Summary
Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.
Abstract
Las enfermedades mitocondriales representan la clase más grande de errores congénitos del metabolismo y actualmente son incurables. Estas enfermedades causan defectos del neurodesarrollo cuyos mecanismos subyacentes aún no se han dilucidado. Un obstáculo importante es la falta de modelos efectivos que recapitulen el deterioro neuronal de inicio temprano observado en los pacientes. Los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) permiten la generación de organoides cerebrales tridimensionales (3D) que se pueden utilizar para investigar el impacto de las enfermedades en el desarrollo y la organización del sistema nervioso. Los investigadores, incluidos estos autores, han introducido recientemente organoides cerebrales humanos para modelar trastornos mitocondriales. Este artículo informa un protocolo detallado para la generación robusta de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso en perfiles bioenergéticos mitocondriales y análisis de imágenes. Estos experimentos permitirán el uso de organoides cerebrales para investigar disfunciones metabólicas y de desarrollo y pueden proporcionar información crucial para diseccionar la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales.
Introduction
Las enfermedades mitocondriales representan la mayor clase de errores congénitos del metabolismo1. Son causadas por mutaciones genéticas que interrumpen diferentes procesos mitocondriales, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2, el ensamblaje de la cadena respiratoria, la dinámica mitocondrial y la transcripción o replicación del ADN mitocondrial3. Los tejidos con requerimientos energéticos se ven particularmente afectados por la disfunción mitocondrial4. En consecuencia, los pacientes con enfermedades mitocondriales suelen desarrollar manifestaciones neurológicas de inicio temprano.
Actualmente no existen tratamientos disponibles para los niños afectados con enfermedades mitocondriales5. Un obstáculo importante para el desarrollo farmacológico de enfermedades mitocondriales es la falta de modelos efectivos que recapitulen el curso de la enfermedad humana6. Varios de los modelos animales actualmente estudiados no presentan los defectos neurológicos presentes en los pacientes7. Por lo tanto, los mecanismos subyacentes a la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales aún no se comprenden completamente.
Estudios recientes generaron iPSCs de pacientes afectados por enfermedades mitocondriales y utilizaron estas células para obtener células neuronales específicas del paciente. Por ejemplo, se ha encontrado que los defectos genéticos asociados a la enfermedad mitocondrial, el síndrome de Leigh, causan aberraciones en la bioenergética celular8,9, la síntesis de proteínas10 y la homeostasis del calcio9,11. Estos informes proporcionaron importantes pistas mecanicistas sobre el deterioro neuronal que ocurre en las enfermedades mitocondriales, allanando el camino para el descubrimiento de fármacos para estas enfermedades incurables12.
Las culturas bidimensionales (2D), sin embargo, no permiten la investigación de la complejidad arquitectónica y la organización regional de los órganos 3D13. Con este fin, el uso de organoides cerebrales 3D derivados de iPSCs específicas del paciente14 puede permitir a los investigadores obtener información adicional importante y, por lo tanto, ayudar a diseccionar cómo las enfermedades mitocondriales afectan el desarrollo y la función del sistema nervioso15. Los estudios que emplean organoides cerebrales derivados de iPSC para investigar enfermedades mitocondriales están comenzando a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales.
Los organoides de la médula espinal portadores de mutaciones asociadas con la enfermedad mitocondrial, la encefalopatía mitocondrial, la acidosis láctica y el síndrome de episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), mostraron neurogénesis defectuosa y diferenciación retardada de la neurona motora16. Los organoides corticales derivados de pacientes con enfermedad mitocondrial, síndrome de Leigh, mostraron reducción de tamaño, defectos en la generación de brotes epiteliales neurales y pérdida de la arquitectura cortical17. Los organoides cerebrales de pacientes con síndrome de Leigh demostraron que los defectos de la enfermedad se inician a nivel de las células progenitoras neurales, que no pueden comprometerse con el metabolismo mitocondrial, causando ramificación neuronal aberrante y morfogénesis18. Por lo tanto, los progenitores neurales pueden representar un objetivo terapéutico celular para las enfermedades mitocondriales, y las estrategias que promueven su función mitocondrial pueden apoyar el desarrollo funcional del sistema nervioso.
El uso de organoides cerebrales podría ayudar a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales. Las enfermedades mitocondriales se consideran principalmente como neurodegeneración de inicio temprano5. Sin embargo, los defectos del neurodesarrollo también están presentes en pacientes afectados por enfermedades mitocondriales, incluyendo retraso en el desarrollo y deterioro cognitivo19. Los organoides cerebrales específicos del paciente pueden ayudar a abordar estos aspectos y dilucidar cómo las enfermedades mitocondriales pueden afectar el desarrollo del cerebro humano. La disfunción mitocondrial también podría desempeñar un papel patogénico en otras enfermedades neurológicas más comunes, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington4. Por lo tanto, dilucidar el impacto de los defectos mitocondriales en el neurodesarrollo utilizando organoides cerebrales también podría ser fundamental para el estudio de esas enfermedades. Este artículo describe un protocolo detallado para generar organoides cerebrales reproducibles que se pueden utilizar para realizar modelos de enfermedades mitocondriales.
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Protocol
NOTA: El uso de iPSC humanas puede requerir una aprobación ética. Las iPSC utilizadas en este estudio se derivaron de individuos de control sanos después de la aprobación ética local (# 2019-681). Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse bajo una campana de cultivo celular estéril, desinfectando cuidadosamente todos los reactivos y consumibles antes de transferirlos debajo del capó. Las iPSC humanas utilizadas para la diferenciación deben tener un número de paso inferior a 50 para evitar posibles aberraciones genómicas que puedan ocurrir en cultivos extensos. El estado pluripotente de las células debe validarse antes de la generación de organoides, por ejemplo, mediante la monitorización de la expresión de marcadores asociados a la pluripotencia como NANOG u OCT4. Las pruebas de micoplasma deben realizarse semanalmente para garantizar cultivos libres de micoplasma.
1. Generación de organoides cerebrales
- Cultura de las iPSC humanas
- Cultive iPSC humanas en condiciones libres de alimentador en medio iPSC (consulte la Tabla de materiales) en placas recubiertas de 6 pocillos y manténgalas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 ° C y 5% de CO2.
NOTA: El arrastre de células alimentadoras puede dificultar la diferenciación de los organoides. Pase las células al menos una vez en condiciones libres de alimentador. - Pase las iPSC al 80% de confluencia utilizando un medio de desprendimiento libre de enzimas en proporciones que van desde 1: 4 a 1: 12. Para aumentar la supervivencia celular, agregue 10 μM inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) (Y27632) después de cada división.
- Cultive iPSC humanas en condiciones libres de alimentador en medio iPSC (consulte la Tabla de materiales) en placas recubiertas de 6 pocillos y manténgalas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 ° C y 5% de CO2.
- Disociar las iPSCs (80% de confluencia)-Día 0.
- Preparar el Medio de Diferenciación Cortical I (CDMI) (Tabla 1). Precalentar el medio CDMI a temperatura ambiente (22-25 °C) antes de añadirlo a las celdas.
- Lave los pocillos que contienen las iPSC con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas y los desechos.
- Añadir 500 μL de reactivo precalentado A (Tabla de Materiales) a cada pozo e incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique bajo el microscopio para asegurar el desprendimiento celular.
- Añadir 1 ml de medio iPSC para diluir el reactivo A y neutralizar su actividad.
- Utilice una pipeta de 1000 μL para disociar las células mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.
- Centrifute suavemente las iPSC a 125 x g durante 5 min a temperatura ambiente (22-25 °C).
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante para evitar perturbar la bolita celular.
- Resuspend el pellet con 1 mL de CDMI para obtener una suspensión unicelular, y contar el número de células.
- Preparar el medio de siembra con 9.000 iPSCs por 100 μL en CDMI suplementado con inhibidor de ROCK de 20 μM, inhibidor de WNT-catenina de 3 μM (IWR1) y 5 μM SB431542.
- Agregue 100 μL de medio de siembra por pocillo a una placa de fondo en V de 96 pocillos.
- Mantenga la placa en una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 °C y 5% de CO2.
- Generación de neuroesferas
- En el día 1, observe que se están formando agregados de células redondas (neuroesferas) con bordes lisos definidos. Observe las celdas muertas alrededor de los agregados. Continuar cultivando en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- El día 3, agita la placa golpeando los lados tres veces para separar las células muertas.
- Añadir 100 μL de CDMI suplementado con 20 μM de inhibidor de ROCK, 3 μM IWR1 y 5 μM SB431542 a cada pocillo.
- Devuelva la placa a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- El día 6, retire cuidadosamente 80 μL del medio sobrenadante de cada pocillo. Evite tocar el fondo del pozo.
- Añadir 100 μL de CDMI suplementado con 3 μM IWR1 y 5 μM SB431542 a cada pocillo. Devuelva la placa a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- Repita los pasos 5 y 6 cada 3 días hasta el día 18.
- Transferencia de neuroesferas
- El día 18, prepare cortical Differentiation Medium II (CDMII) (Tabla 1) y agregue 10 ml a una placa de cultivo celular de fijación ultrabaja de 100 mm.
- Use una pipeta de 200 μL con la punta cortada para transferir las neuroesferas redondas de la placa de 96 pocillos a la placa de cultivo celular de fijación ultra baja de 100 mm.
NOTA: Sea suave para evitar dañar las neuroesferas asegurándose de que la abertura de la punta sea lo suficientemente ancha y que los agregados no se aspiren demasiado rápido. - Retire 5 ml de medio de la placa que contiene las neuroesferas y agregue 5 ml de CDMII fresco.
NOTA: Este procedimiento ayuda a reducir la cantidad de medio CDMI que puede haberse trasladado de la transferencia de neuroesferas. - Coloque la placa en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 °C y 5% de CO2.
NOTA: Inspeccione visualmente las neuroesferas al día siguiente. Aumente la velocidad del agitador orbital si las neuroesferas están agrupadas o unidas a la parte inferior de la placa. - Cada 3 días, aspire cuidadosamente el medio sobrenadante y reemplácelo con CDMII fresco. Deje una pequeña cantidad del medio para evitar que las neuroesferas se sequen.
- El día 35, preparar el Medio de Diferenciación Cortical III (CDMIII) (Tabla 1).
NOTA: El componente de la matriz debe disolverse en CDMIII frío. - Aspirar el medio de la placa y añadir 10 mL de CDMIII frío.
NOTA: Es más efectivo usar medio frío para que el componente de la matriz pueda recubrir los organoides sin formar grumos. - Después de cambiar el medio, coloque la placa de nuevo en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 ° C y 5% de CO2.
- Cambie el medio cada 3-5 días dependiendo de la tasa de crecimiento, según lo indique el color del medio.
- El día 70, preparar el Medio de Diferenciación Cortical IV (CDMIV) (Tabla 1). Use el medio CDMIV hasta que se alcance la edad deseada de los organoides. Durante este período, mantenga la placa en un agitador orbital a 70 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado (37 ° C y 5% de CO2).
- Cambie el medio cada 3-5 días, dependiendo de la tasa de crecimiento.
2. Inmunotinción de organoides cerebrales
- Preparación de tejidos
- Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) y colóquela debajo de una campana de seguridad.
NOTA: Use equipo de seguridad personal cuando manipule PFA. - Recoja los organoides cerebrales y transfiéralos suavemente con una pipeta Pasteur de plástico de punta roma de 3 ml a una placa de 6 pocillos llena de PFA.
NOTA: Utilizar organoides de más de 40 días para permitir la visualización de estructuras con mayor complejidad celular. - Mantenga los organoides en la solución de PFA durante 1 h a temperatura ambiente.
- Retire cuidadosamente el PFA con una pipeta Pasteur de plástico de 3 ml y lave los organoides fijos tres veces con PBS.
- Conservar los organoides fijos a 4 °C en PBS hasta su uso posterior.
- Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) y colóquela debajo de una campana de seguridad.
- Preparación de rodajas de organoides cerebrales
- Prepare una solución de agar al 3% y caliente lentamente hasta que se licúe.
- Coloque el molde (el extremo cortado de una jeringa de 10 ml) sobre un trozo de papel de filtro absorbente (lado liso hacia arriba). Coloque una gota de agar sobre él.
- Saque rápidamente un solo organoide de la placa de 6 pocillos con una espátula y elimine el exceso de PBS con papel de filtro.
NOTA: Tenga cuidado de no tocar el organoide directamente con papel de filtro. - Coloque el organoide sobre la gota de agar.
- Repita este procedimiento con hasta tres organoides.
NOTA: Trabaje rápido para evitar la solidificación del agar durante este paso. - Rellene el molde con agar hasta que todos los organoides estén completamente cubiertos.
- Espere hasta que el agar comience a solidificarse y luego transfiera suavemente todo el molde que contiene los organoides, incluido el papel de filtro absorbente, a un elemento de enfriamiento.
NOTA: Si un elemento refrigerante no está disponible, guarde los organoides durante unos minutos en un refrigerador a 4 °C. - Mientras tanto, prepárese para el procedimiento de corte: coloque una cuchilla de afeitar (limpiada con acetona y lavada con agua de doble destilación) en el soporte del vibratomo, monte en el baño y llénela con PBS.
- Retire el molde del agar (solidificado) y use un bisturí para recortarlo y formar un cubo.
- Coloque el cubo de agar que contiene los organoides en la placa portadora del vibratomo con gel adhesivo (consulte la Tabla de materiales) y colóquelo en el baño que contenga PBS.
- Ajuste el vibratomo (consulte la Tabla de materiales) para cortar rodajas a un espesor de 150 μm.
NOTA: Los ajustes del vibratomo (ángulo, amplitud, frecuencia y velocidad adecuados de la cuchilla) pueden ser similares a los utilizados para cortar tejido cerebral fijo derivado de animales postnatales tempranos. Sin embargo, los ajustes ideales dependen en gran medida del tipo de vibratomo y deben determinarse en un primer paso para evitar la distorsión o incluso la extracción del tejido durante el corte. - Inicie el procedimiento de corte. Use una pipeta de vidrio o una espátula para transferir suavemente cada rebanada recién cortada a un plato de 24 pocillos lleno de PBS.
- Guarde la placa que contiene las rodajas a 4 °C (hasta por unos días) hasta su posterior procesamiento.
- Transfiera las rebanadas fuera de la placa con una pipeta de vidrio o una espátula a los portaobjetos del microscopio. Utilice un mínimo de 2 sectores por diapositiva.
- Retire con cuidado el agar y el exceso de PBS con una jeringa.
- Deje que las rodajas se sequen hasta que se adhieran a las diapositivas.
NOTA: Si bien los portaobjetos de microscopio se pueden almacenar en cámaras de plástico llenas de PBS a 4 ° C, deben teñirse lo antes posible después del procedimiento de corte.
- Tinción inmunohistoquímica
- Preparar la solución de bloqueo (Tabla 1).
- Use una pluma PAP para dibujar un borde hidrofóbico alrededor de las rodajas en la diapositiva para ayudar a mantener todas las soluciones en las diapositivas.
- Agregue cuidadosamente la solución de bloqueo en el portaobjetos e incube durante 1 h a temperatura ambiente (22-25 ° C). Para evitar destruir el tejido, no agregue la solución directamente sobre las rodajas.
- Aspire la solución de bloqueo y aplique el anticuerpo primario deseado diluido en la solución de bloqueo.
- Incubar el portaobjetos durante la noche en una cámara humidificada a 4 °C.
- Enjuague la diapositiva tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada uno.
- Incubar las rodajas con el anticuerpo secundario específico diluido en la solución bloqueadora y realizar la tinción de Hoechst (1:2.500) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Recuerde realizar controles negativos para confirmar que no hay unión no específica o autofluorescencia. - Enjuague tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada uno en la oscuridad.
- Agregue una gota de medio de montaje a la rebanada, coloque una funda en el borde de la gota y coloque lentamente la hoja de cubierta hacia la rebanada para evitar burbujas de aire.
- Deje que el tobogán descanse durante la noche a temperatura ambiente. Aplique esmalte de uñas en el borde de la cubierta para sellar aún más la diapositiva. Para un almacenamiento a largo plazo, conservar a 4 °C.
- Documentación de la tinción
- Para escanear imágenes grandes para coser, utilice un microscopio vertical motorizado de campo amplio equipado con (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) un objetivo de alta calidad; Conjunto de filtros DAPI (por ejemplo, excitación (EX): 340-380 nm, espejo dicroico (DM): 400 nm, filtro de barrera (BA): 435-485 nm); conjunto de filtros de isotiocianato de fluoresceína (por ejemplo, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Conjunto de filtros Alexa594 (por ejemplo, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); cámara digital; software de adquisición de alto rendimiento que permite puntadas automatizadas y operaciones de pila.
- Para el manejo de imágenes, use un programa de procesamiento de imágenes capaz de generar archivos tif de 8 bits, recortar puntos, ajustar el contraste y el brillo, fusionar los canales (por ejemplo, azul, verde y rojo) y agregar barras de escala.
- Para escanear detalles, utilice un microscopio de barrido láser confocal motorizado equipado con un objetivo de alta calidad, un láser UV (EX: 408 nm), un láser de argón (EX: 488 nm), un láser de helio-neón (EX: 543), software de imágenes para un microscopio confocal.
- Para el manejo de imágenes de detalles, utilice un programa de procesamiento de imágenes capaz de generar proyecciones de máxima intensidad de pilas z confocales (por ejemplo, secciones ópticas de 0,6 μm cada una), generar archivos tif de 8 bits, ajustar el contraste y el brillo, fusionar los canales (por ejemplo, azul, verde y rojo), agregar barras de escala.
- Utilice un editor gráfico para organizar las figuras.
3. Perfil bioenergético de organoides cerebrales
- Preparación de organoides para perfiles bioenergéticos
- Prepare la solución de papaína y DNasa siguiendo el protocolo del fabricante.
- Transfiera de 3 a 5 organoides a una placa de 6 pocillos. Lávelos dos veces con PBS precalentado.
- Añadir 2 ml de solución de papaína activada precalentada que contenga DNasa. Usando una cuchilla, corte los organoides en trozos pequeños.
- Coloque la placa en un agitador orbital a 27 rpm dentro de una incubadora de cultivo celular (a 37 °C, 5% de CO2) e incube durante 15-20 min.
NOTA: El tiempo de incubación depende de la etapa organoide. Los organoides en etapa temprana se pueden usar tal como son. Para organoides mayores de 3 meses, se recomienda cortar los organoides en 2-3 piezas antes de la disociación e incubar las piezas a una velocidad de balanceo establecida a 27 rpm durante 15-20 min a 37 ° C. Este procedimiento puede ayudar a extirpar el tejido necrótico que puede estar presente en los organoides en etapa posterior. - Recoger los tejidos digeridos en un tubo de 15 ml y añadir 5 ml de medio de cultivo organoide CDMIV (Tabla 1).
- Triture el tejido con una pipeta de plástico de 10 ml mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Deje que el tejido no disociado se asiente hasta la parte inferior del tubo.
- Transfiera cuidadosamente la suspensión celular a un tubo de 15 ml, evitando cualquier trozo de tejido no disociado. Filtre la solución a través de un colador celular de 40 μm (por ejemplo, tubos de fondo redondo de poliestireno con tapas de colador celular).
- Pellet las células centrifugando a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Evalúe el número de celda y la calidad utilizando el azul tripano.
- Coloque el número deseado (~ 20,000 / pozo) de células en microplacas recubiertas de 96 pocillos. Cambiar el medio 6-8 h después del recubrimiento a Medio Neuronal (Tabla 1).
- Incubar la microplaca recubierta de 96 pocillos en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2) durante 4 días.
- Perfiles bioenergéticos
- El día 3 después de volver a colocar las células disociadas, agregue 200 μL de solución de calibración en cada pozo de la parte inferior de la microplaca de 96 pocillos y coloque el cartucho del sensor verde superior sobre la microplaca hidratada.
NOTA: Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la microplaca en la orientación correcta y asegúrese de que la solución de calibrante cubra todos los sensores. - Incubar la microplaca hidratada de 96 pocillos en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche.
- Encienda el analizador para permitir que el instrumento se estabilice a 37 °C durante la noche.
- El día 4 después del replanteo, inspeccione el cultivo de organoides disociados en la microplaca de 96 pocillos bajo el microscopio para asegurarse de que las células aparezcan como una monocapa confluente.
- Preparar el medio de ensayo (Tabla 1).
- Retire neuronal Medium de todos los pocillos con una pipeta sin tocar el fondo del pozo para evitar daños celulares. Alternativamente, invierta cuidadosamente toda la placa y luego séquela en papel limpio. Trabaje rápidamente para evitar la muerte celular.
- Lave las células dos veces con 200 μL precalentados de medio de ensayo. Agregue assay medium a un volumen final de 180 μL por pozo. Incubar la microplaca de 96 pocillos en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante 1 h.
- Preparar soluciones de 10 μM de inhibidores mitocondriales en medio de ensayo. Tenga en cuenta que la concentración final después de la inyección es de 1 μM.
- Cargue el cartucho del sensor colocado en la microplaca hidratada con 10x soluciones de los inhibidores mitocondriales.
- Añadir 18 μL de inhibidor mitocondrial 1 en el puerto A.
- Añadir 19,8 μL de inhibidor mitocondrial 2 en el puerto B.
- Añadir 21,6 μL de inhibidor mitocondrial 2 en el puerto C.
- Añadir 23,4 μL de inhibidor mitocondrial 3 en el puerto D.
- Coloque el cartucho cargado en la microplaca hidratada en una incubadora sin CO2 a 37 °C hasta el inicio del ensayo.
- Configure un protocolo en ejecución en el software del instrumento (Tabla 2).
- Presione START. Tome el cartucho cargado de la incubadora sin CO2 y colóquelo en el analizador para su calibración.
NOTA: Asegúrese de que la placa esté insertada en la orientación correcta y sin la tapa. - Una vez finalizado el paso de calibración, retire la placa de calibración. Tome la microplaca de 96 pocillos de la incubadora que no es de CO2 y colóquela en el analizador. Haga clic en CONTINUAR para iniciar las mediciones.
- Cuando termine la ejecución, retire la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos del analizador y recoja el medio de todos los pocillos sin perturbar las células.
NOTA: El medio puede almacenarse a -20 °C y utilizarse posteriormente para medir la cantidad de lactato liberado por las células en el medio utilizando un kit de ensayo de lactato apropiado. - Lave las células con 200 μL de 1x PBS en cada pocillo.
- Después de retirar el PBS, congele la placa a -20 °C.
NOTA: La placa congelada se puede utilizar para cuantificar células, proteínas o ADN en cada pocillo de la microplaca. Esta cuantificación será necesaria para normalizar las tasas bioenergéticas obtenidas. Siga las instrucciones del fabricante para los ensayos de cuantificación de células, proteínas o ADN.
- El día 3 después de volver a colocar las células disociadas, agregue 200 μL de solución de calibración en cada pozo de la parte inferior de la microplaca de 96 pocillos y coloque el cartucho del sensor verde superior sobre la microplaca hidratada.
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Representative Results
El protocolo descrito aquí facilita la generación robusta de organoides redondos (Figura 1A). Los organoides generados contienen neuronas maduras que se pueden visualizar utilizando marcadores de proteínas específicos para axones (SMI312) y dendritas (proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2)) (Figura 1B).. Los organoides maduros contienen no solo células neuronales (MAP2-positivas) sino también células gliales (por ejemplo, positivas para el marcador de astrocitos S100 proteína B de unión al calcio (S100ß)) (Figura 1B)..
Mediante el análisis de organoides cerebrales en rodajas utilizando microscopía confocal, es posible identificar y monitorear la distribución y organización detallada de diferentes tipos de células y estructuras celulares. Esto podría proporcionar una nueva visión de cómo las enfermedades mitocondriales podrían afectar el desarrollo del sistema nervioso. Por ejemplo, es posible monitorizar los axones neuronales (SMI312-positivo) y las dendritas (MAP2-positivo) (Figura 2A) o la aparición mutua de células neuronales (MAP2-positivo) y células gliales (S100ß-positivo) (Figura 2A). Las imágenes confocales también pueden ayudar a investigar con más detalle la distribución y organización de los progenitores neurales ((región determinante del sexo Y) caja-2 (SOX2)-positiva) con respecto a las neuronas (beta-III tubulina (TUJ1)-positiva) (Figura 2B). Finalmente, los organoides cerebrales se pueden teñir para marcadores específicos de mitocondrias (como la proteína de la membrana mitocondrial externa, la subunidad translocasa de la membrana externa de 20 kDa (TOM20)) (Figura 2C)..
El protocolo descrito permite a los investigadores realizar perfiles bioenergéticos de organoides cerebrales. Utilizando este procedimiento, es posible medir tanto el metabolismo mitocondrial utilizando la tasa de consumo de oxígeno (OCR) (Figura 2D) como el metabolismo glicolítico utilizando la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 2E). El perfil bioenergético permite monitorizar cómo las células pueden modificar sus perfiles OCR y ECAR en respuesta a una administración secuencial de inhibidores mitocondriales.
En primer lugar, se puede aplicar el inhibidor de la ATP sintasa, oligomicina. La oligomicina causa una caída en el perfil de OCR (Figura 2D) y, por lo tanto, identifica el OCR necesario para la producción de ATP. Tras el tratamiento con oligomicina, también puede haber un aumento compensatorio en ECAR (Figura 2E), lo que sugiere que las células pueden regular al alza la glucólisis para prevenir el estrés metabólico causado por la reducción del metabolismo mitocondrial. La posterior doble aplicación del ionóforo protono, cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidracazón (FCCP), provoca la pérdida del potencial de membrana mitocondrial. Como las moléculas de oxígeno ahora son libres de moverse, esto causa un rápido aumento en el OCR (Figura 2D).
Estos cambios en el perfil de OCR identifican la capacidad respiratoria máxima de las células. La administración final de rotenona más antimicina A provoca un bloqueo del transporte de electrones, y por lo tanto, una fuerte disminución del OCR (Figura 2D). ECAR puede mostrar fluctuación después del tratamiento con FCCP y rotenona más antimicina A (Figura 2E), dependiendo de la capacidad glucolítica residual de las células. Los perfiles OCR y ECAR pueden verse alterados dramáticamente en organoides cerebrales derivados de pacientes mitocondriales.
Figura 1: Generación de organoides cerebrales a partir de iPSCs humanas. (A) Representación esquemática del protocolo utilizado para producir organoides cerebrales con las correspondientes imágenes de transmisión. El día 0 corresponde a la disociación de iPSCs y siembra en una placa de 96 pocillos con fondo en V utilizando CDMI suplementado con un inhibidor de ROCK, un inhibidor de WNT y SB431542. En el día 18, las neuroesferas se transfieren de las placas de 96 pocillos a las placas de cultivo celular de 100 mm con CDMII suplementado con N2. A partir de este punto, los cultivos se colocan en un agitador orbital. En el día 35, el medio se cambia de CDMII a CDMIII, que también contiene un componente de matriz disuelta (Tabla 1). A partir del día 70, CDMIII se cambia a CDMIV suplementado con B27. Se tomó una imagen representativa de la neuroesfera en el día 12 utilizando una cámara de microscopio con un aumento de 10x. Una imagen organoide temprana se tomó en el día 22 utilizando una cámara de microscopio con un aumento de 4x. Se tomó una imagen organoide madura en el día 40 utilizando una cámara de microscopio con aumento de 4x. (B) La estructura general y la organización celular de los organoides cerebrales se pueden visualizar utilizando microscopía de campo amplio. Se muestran imágenes representativas de campo amplio cosidas para visualizar las relaciones entre las dendritas (MAP2-positivo) y los axones (SMI312-positivo), y entre las células neuronales (MAP2-positivo) y los presuntos astrocitos (S100ß-positivo). Las células fueron contrateñidas con Hoechst para revelar los núcleos. Todas las imágenes fueron tomadas usando organoides cerebrales de 78 días de antigüedad. La columna de la derecha muestra la superposición de tres canales (combinar). Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: iPSC = célula madre pluripotente inducida; MDL = Medio de diferenciación cortical; ROCA = Rho quinasa; MAP2 = proteína 2 asociada a microtúbulos; S100ß= S100 proteína B de unión al calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización y perfil bioenergético de organoides cerebrales para el modelado de enfermedades mitocondriales. La organización detallada y la arquitectura de los organoides se pueden analizar mediante microscopía confocal. Todas las imágenes fueron tomadas usando organoides cerebrales de 78 días de edad y contrateñidas con Hoechst para revelar los núcleos. La columna de la derecha muestra la superposición de tres canales (combinar). Barras de escala = 50 μm. (A) Proyecciones representativas de enfoque extendido (44-48 planos ópticos, 0,6 μm cada uno) que abordan la interacción entre dendritas (MAP2-positivo, puntas de flecha) y axones (SMI312-positivo, flechas), y entre células neuronales (MAP2-positivo, puntas de flecha) y presuntos astrocitos (S100ß-positivo, flechas). (B) Proyecciones representativas de enfoque extendido (14-31 planos ópticos, 0,6 μm cada uno) que muestran la distribución de las neuronas (TUJ1-positivo, puntas de flecha) con respecto a los progenitores neurales (SOX2-positivo, flechas). (C) Proyecciones representativas de enfoque extendido (20 planos ópticos, 0,6 μm cada uno) que muestran la distribución dentro de las neuronas (TUJ1-positivo, puntas de flecha) de las mitocondrias (visualizadas utilizando anticuerpos contra la proteína de la membrana mitocondrial externa TOM20, flechas). (D) La respiración mitocondrial de los organoides cerebrales puede ser monitoreada en función del perfil del OCR después de la administración secuencial de diferentes inhibidores mitocondriales (ver texto para más detalles). (E) La actividad glucolítica de los organoides cerebrales puede ser monitoreada en base al ECAR tras la administración secuencial de inhibidores mitocondriales (ver texto para más detalles). Para el perfil bioenergético, se disociaron aproximadamente 10-15 organoides cerebrales para obtener suficientes células para volver a salpicar en la microplaca de 96 pocillos. Las barras indican los SEM en base a los resultados obtenidos en dos experimentos independientes. Abreviaturas: MAP2 = proteína 2 asociada a microtúbulos; S100ß = S100 proteína B de unión al calcio; TUJ1 = tubulina beta-III; SOX2 = (región Y determinante del sexo) caja-2; TOM20 = translocasa de la membrana externa 20 kDa subunidad; OCR = tasa de consumo de oxígeno; ECAR = tasa de acidificación extracelular; Oligom. = oligomicina; FCCP = cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidraazon; R = rotenona; AntA = Antimicina A; SEMs = error estándar de medias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composición de medios | |||
| CDMI (Día 0-18) | Final conc. | ||
| Glasgow-MEM | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Reemplazo de suero noqueado (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (solución de aminoácidos no esenciales MEM) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| 2-mercaptethanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL y 100 μg/mL |
| CDMII (Día 18-35) | Final conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| Suplemento N-2 (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Concentrado de lípidos definido químicamente | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL y 100 μg/mL |
| CDMIII (Día 35-70) | Final conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| Suplemento N-2 (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Concentrado de lípidos definido químicamente | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL y 100 μg/mL |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparina | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV(Día 70+) | Final conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| Suplemento N-2 (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Concentrado de lípidos definido químicamente | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL y 100 μg/mL |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparina | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| Suplemento de B-27 con vitamina A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Medio neuronal | Final conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Suplemento N-2 | Gibco | 17502048 | [1x] |
| Suplemento de B-27 con vitamina A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| Ácido L-ascórbico | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (dibutiril monofosfato de adenosina cíclica) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (factor neutrotrófico derivado del cerebro) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/ml] |
| GDNF (factor neurotrófico derivado de la línea celular glial) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/ml] |
| TGF-β3 humano (factor de crecimiento transformador-beta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/ml] |
| Medio de ensayo | Final conc. | ||
| Caballito de mar XF DMEM medio | Biociencia del Caballito de Mar | 103680-100 | 500 ml |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| L-glutamina | Lonza | BEBP17-605E | 2 mM |
| Glucosa | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 mM |
| Solución de bloqueo | Final conc. | ||
| PBS-Tween | [1:1] 0.1% Preadolescentes | ||
| Suero de burro | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Tritón-X | Merck | X100-5ML | 1% |
Tabla 1: Detalles de los medios y soluciones utilizados para la generación de organoides.
| Inicialización | Línea de base (X3) | Inyección de oligomicina (X3) | Inyección de FCCP (X3) | Inyección de FCCP (X3) | Inyección anti A + podredumbre (X3) |
| Calibrar | Mezclar | Mezclar | Mezclar | Mezclar | Mezclar |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Equilibrate (12:00) | Esperar | Esperar | Esperar | Esperar | Esperar |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Medida (03:00) | Medida (03:00) | Medida (03:00) | Medir | Medida (03:00) | |
| (03:00) |
Tabla 2: Configuración del protocolo para la elaboración de perfiles bioenergéticos. Descripción de los pasos y su duración en minutos utilizando el software Seahorse Wave Desktop. Abreviaturas: FCCP = cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidraazon; Podredumbre = rotenona; Anti A = Antimicina A.
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Discussion
Este artículo describe la generación reproducible de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso para el modelado de enfermedades mitocondriales. El protocolo aquí descrito se modifica en base a un trabajo publicado previamente20. Una ventaja importante del protocolo actual es que no requiere la incrustación manual de cada organoide en una matriz de andamios. De hecho, la solución matricial simplemente se disuelve en el medio de cultivo celular. Además, no hay necesidad de emplear biorreactores costosos, ya que los organoides se pueden cultivar en placas estándar de cultivo de tejidos de 6 pocillos colocadas en un agitador orbital dentro de la incubadora. Este procedimiento también permite el cultivo paralelo de varias placas que contienen diferentes organoides derivados de varias líneas individuales, aumentando así el rendimiento de los experimentos y permitiendo el monitoreo de las diferencias de potencial que surgen en los perfiles de crecimiento de diferentes organoides. Probamos este protocolo utilizando diferentes iPSCs derivadas de controles sanos e individuos afectados por enfermedades mitocondriales, con resultados consistentes.
Para el modelado de enfermedades mitocondriales, es esencial utilizar diferentes marcadores para visualizar la morfología y la organización de la red mitocondrial. Este procedimiento permite investigar si el número, la morfología o la distribución mitocondriales podrían alterarse en organoides cerebrales derivados de pacientes con enfermedades mitocondriales. La presencia y organización de progenitores neurales dentro de los organoides cerebrales podría ser de crucial importancia para modelar los trastornos mitocondriales. Recientemente descubrimos que las mutaciones causantes de la enfermedad mitocondrial, el síndrome de Leigh, alteran la arquitectura celular y la distribución de las células progenitoras neurales dentro de los organoides cerebrales derivados del paciente18.
Para la realización de perfiles bioenergéticos, hemos adaptado un método previamente descrito para evaluar la bioenergética de las células madre pluripotentes21. Un protocolo reciente describió cómo llevar a cabo el perfil bioenergético de organoides derivados del intestino delgado de ratón, colon humano y tumores colorrectales22. Sin embargo, esos organoides son bastante pequeños en comparación con los organoides cerebrales, y por lo tanto, se necesita un protocolo diferente, como el que se informa aquí, para los organoides cerebrales. Recientemente empleamos este protocolo para evaluar el perfil bioenergético de los organoides cerebrales humanos portadores de mutaciones en el gen de la proteína 1 del locus surfeit (SURF1) que causa la enfermedad mitocondrial grave, el síndrome de Leigh18. Encontramos que el perfil de OCR está particularmente afectado en los organoides del síndrome de Leigh, como lo demuestra una disminución significativa en el nivel basal de OCR, la tasa de producción de ATP y la tasa máxima de respiración18.
En conclusión, presentamos aquí un protocolo detallado para la generación robusta de organoides cerebrales humanos y describimos cómo realizar experimentos que serían importantes para la investigación de los mecanismos de la enfermedad subyacentes a las enfermedades mitocondriales. Los organoides cerebrales humanos también pueden ser de importancia crítica para dilucidar la diversidad mitocondrial en el cerebro humano y su papel en la salud y las enfermedades humanas23. Es importante aclarar que los organoides cerebrales generados con los protocolos actualmente disponibles, incluido el descrito aquí, todavía tienen limitaciones. Estos incluyen, por ejemplo, la falta de vascularización y la ausencia de microglía poblacional24. Estos aspectos deben tenerse en cuenta para interpretar correctamente los resultados.
Por ejemplo, la falta de vasculatura y microglía podría limitar los mecanismos compensatorios que pueden estar en su lugar in vivo. Por lo tanto, los organoides cerebrales derivados del paciente pueden presentar defectos que son más fuertes que los observados en los pacientes17,18. Además, a pesar de una reproducibilidad general de este protocolo20, se puede observar heterogeneidad línea a línea. Con este fin, al realizar estudios de modelado de enfermedades, siempre es importante cuantificar sistemáticamente la uniformidad de los organoides de control y pacientes mediante la evaluación de los patrones de morfología (tamaño, capa) y la distribución de los marcadores moleculares a través de diferentes organoides.
Finalmente, no es posible generar organoides cerebrales a partir de una sola iPSC, lo que limita la viabilidad del cribado genético a gran escala con CRISPR/Cas9. Dado el ritmo de la investigación, es probable que algunas de las limitaciones actuales del protocolo descrito aquí pronto se superen. Los protocolos optimizados estarán disponibles. Se espera que estos modelos 3D de enfermedades mitocondriales permitan el descubrimiento eventual de terapias implementables para enfermedades mitocondriales, que son perjudiciales, y para enfermedades incurables con necesidades médicas altamente insatisfechas.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros o no financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Miriam Bünning por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo de deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark y berlinesa Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), y el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (e: Bio joven investigador concede AZ 031L0211 a A.P.). El trabajo en el laboratorio de C.R.R. fue apoyado por el DFG (FOR 2795 "Sinapsis bajo estrés", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
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