Summary
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.
Abstract
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar und sind derzeit unheilbar. Diese Erkrankungen verursachen neurologische Entwicklungsdefekte, deren zugrunde liegende Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen. Ein Haupthindernis ist der Mangel an effektiven Modellen, die die früh einsetzende neuronale Beeinträchtigung der Patienten rekapitulieren. Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Hirnorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Krankheiten auf die Entwicklung und Organisation des Nervensystems untersucht werden können. Forscher, einschließlich dieser Autoren, haben kürzlich menschliche Gehirnorganoide eingeführt, um mitochondriale Störungen zu modellieren. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung in mitochondrialen bioenergetischen Profiling- und Bildgebungsanalysen. Diese Experimente werden die Verwendung von Gehirnorganoiden zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Entwicklungsstörungen ermöglichen und können entscheidende Informationen liefern, um die neuronale Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zu sezieren.
Introduction
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar1. Sie werden durch genetische Mutationen verursacht, die verschiedene mitochondriale Prozesse stören, einschließlich oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS)2, Assemblierung der Atmungskette, mitochondrialer Dynamik und mitochondrialer DNA-Transkription oder -Replikation3. Gewebe mit Energiebedarf sind besonders von mitochondrialer Dysfunktion betroffen4. Dementsprechend entwickeln Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen typischerweise früh einsetzende neurologische Manifestationen.
Derzeit gibt es keine Behandlungen für Kinder, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind5. Ein Haupthindernis für die Entwicklung von Medikamenten mitochondrialen Erkrankungen ist das Fehlen wirksamer Modelle, die den menschlichen Krankheitsverlauf rekapitulieren6. Einige der derzeit untersuchten Tiermodelle weisen die bei den Patienten vorhandenen neurologischen Defekte nicht auf7. Daher sind die Mechanismen, die der neuronalen Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden.
Neuere Studien erzeugten iPS-Zellen von Patienten, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen waren, und verwendeten diese Zellen, um patientenspezifische neuronale Zellen zu erhalten. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass genetische Defekte, die mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, assoziiert sind, Aberrationen in der zellulären Bioenergetik8,9, der Proteinsynthese10 und der Calciumhomöostase9,11 verursachen. Diese Berichte lieferten wichtige mechanistische Hinweise auf die neuronale Beeinträchtigung bei mitochondrialen Erkrankungen und ebneten den Weg für die Wirkstoffforschung für diese unheilbaren Krankheiten12.
Zweidimensionale (2D)Kulturen erlauben jedoch keine Untersuchung der architektonischen Komplexität und regionalen Organisation von 3D-Organen13. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von 3D-Hirnorganoiden, die aus patientenspezifischen iPS-Zellen14 abgeleitet sind, es den Forschern ermöglichen, zusätzliche wichtige Informationen zu gewinnen und so zu analysieren, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung und Funktion des Nervensystems beeinflussen15. Studien, die iPSC-abgeleitete Gehirnorganoide zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen einsetzen, beginnen, die neurologischen Entwicklungskomponenten mitochondrialer Erkrankungen aufzudecken.
Rückenmarksorganoide, die Mutationen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Erkrankung, der mitochondrialen Enzephalopathie, der Laktatazidose und dem Schlaganfall-ähnlichen Episodensyndrom (MELAS) tragen, zeigten eine fehlerhafte Neurogenese und eine verzögerte Motoneurondifferenzierung16. Kortikale Organoide, die von Patienten mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, stammen, zeigten eine reduzierte Größe, Defekte in der neuronalen Epithelknospenbildung und einen Verlust der kortikalen Architektur17. Gehirnorganoide von Patienten mit Leigh-Syndrom zeigten, dass die Krankheitsdefekte auf der Ebene neuronaler Vorläuferzellen beginnen, die sich nicht an den mitochondrialen Stoffwechsel binden können, was zu einer aberranten neuronalen Verzweigung und Morphogenese führt18. So können neuronale Vorläufer ein zelluläres therapeutisches Ziel für mitochondriale Erkrankungen darstellen, und Strategien, die ihre mitochondriale Funktion fördern, können die funktionelle Entwicklung des Nervensystems unterstützen.
Die Verwendung von Gehirnorganoiden könnte helfen, die neurologischen Entwicklungskomponenten von mitochondrialen Erkrankungen aufzudecken. Mitochondriale Erkrankungen werden hauptsächlich als früh einsetzende Neurodegeneration angesehen5. Neuroentwicklungsstörungen treten jedoch auch bei Patienten auf, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind, einschließlich Entwicklungsverzögerung und kognitiver Beeinträchtigung19. Patientenspezifische Gehirnorganoide können helfen, diese Aspekte anzugehen und aufzuklären, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung des menschlichen Gehirns beeinflussen können. Mitochondriale Dysfunktion könnte auch eine pathogenetische Rolle bei anderen häufigeren neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit4 spielen. Daher könnte die Aufklärung der Auswirkungen von mitochondrialen Defekten auf die Neuroentwicklung unter Verwendung von Gehirnorganoiden auch für die Untersuchung dieser Krankheiten von entscheidender Bedeutung sein. Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung reproduzierbarer Gehirnorganoide, die für die Durchführung der Krankheitsmodellierung von mitochondrialen Erkrankungen verwendet werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Die Verwendung menschlicher iPS-Zellen kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten iPS-Zellen wurden von gesunden Kontrollpersonen nach lokaler ethischer Zulassung abgeleitet (#2019-681). Alle Zellkulturverfahren müssen unter einer sterilen Zellkulturhaube durchgeführt werden, wobei alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sorgfältig desinfiziert werden müssen, bevor sie unter die Haube überführt werden. Menschliche iPS-Zellen, die zur Differenzierung verwendet werden, sollten eine Passagenzahl unter 50 haben, um mögliche genomische Aberrationen zu vermeiden, die bei extensiver Kultur auftreten können. Der pluripotente Zustand der Zellen sollte vor der Organoidbildung validiert werden, beispielsweise durch Überwachung der Expression von Pluripotenz-assoziierten Markern wie NANOG oder OCT4. Mykoplasmentests sollten wöchentlich durchgeführt werden, um mykoplasmenfreie Kulturen zu gewährleisten.
1. Erzeugung von Hirnorganoiden
- Kultur menschlicher iPS-Zellen
- Humane iPS-Zellen unter feederfreien Bedingungen in iPSC-Medium (siehe Materialtabelle) auf beschichteten 6-Well-Platten zu kultivieren und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 aufzubewahren.
HINWEIS: Die Verschleppung von Feederzellen kann die Organoiddifferenzierung behindern. Passieren Sie die Zellen mindestens einmal unter feederfreien Bedingungen. - Passage der iPS-Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von enzymfreiem Ablösungsmedium in Verhältnissen von 1:4 bis 1:12. Um das Überleben der Zellen zu erhöhen, fügen Sie nach jeder Spaltung 10 μM Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK) -Inhibitor (Y27632) hinzu.
- Humane iPS-Zellen unter feederfreien Bedingungen in iPSC-Medium (siehe Materialtabelle) auf beschichteten 6-Well-Platten zu kultivieren und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 aufzubewahren.
- Dissoziieren Sie die iPS-Zellen (80% Konfluenz) - Tag 0.
- Vorbereitung des kortikalen Differenzierungsmediums I (CDMI) (Tabelle 1). CDMI-Medium bei Raumtemperatur (22-25 °C) vorwärmen, bevor es den Zellen zugesetzt wird.
- Waschen Sie die Vertiefungen, die die iPS-Zellen enthalten, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
- Zu jeder Vertiefung werden 500 μL vorgewärmtes Reagenz A (Materialtabelle) gegeben und 5 min bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um die Zellablösung sicherzustellen.
- Fügen Sie 1 ml iPSC-Medium hinzu, um Reagenz A zu verdünnen, um seine Aktivität zu neutralisieren.
- Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um die Zellen durch Pipettieren auf und ab zu dissoziieren und die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen zu übertragen.
- Die iPS-Zellen bei 125 x g für 5 min bei Raumtemperatur (22-25 °C) vorsichtig zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml CDMI, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und zählen Sie die Zellzahl.
- Bereiten Sie das Seeding-Medium mit 9.000 iPS-Zellen pro 100 μL in CDMI vor, ergänzt mit 20 μM ROCK-Inhibitor, 3 μM WNT-Catenin-Inhibitor (IWR1) und 5 μM SB431542.
- 100 μL Aussaatmedium pro Vertiefung in eine 96-Well-V-Bodenplatte geben.
- Bewahren Sie die Platte in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 auf.
- Neurosphären-Generierung
- Beobachten Sie an Tag 1, dass sich runde Zellaggregate (Neurosphären) mit definierten glatten Grenzen bilden. Beachten Sie die toten Zellen um die Aggregate. Kultur im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 fortsetzen.
- An Tag 3 rühren Sie die Platte, indem Sie dreimal auf die Seiten klopfen, um abgestorbene Zellen zu lösen.
- Zu jeder Vertiefung werden 100 μL CDMI, ergänzt mit 20 μM ROCK-Inhibitor, 3 μM IWR1 und 5 μM SB431542, gegeben.
- Geben Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator zurück.
- Entfernen Sie am Tag 6 vorsichtig 80 μL des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, den Boden des Brunnens zu berühren.
- Fügen Sie 100 μL CDMI, ergänzt mit 3 μM IWR1 und 5 μM SB431542, zu jeder Vertiefung hinzu. Geben Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator zurück.
- Wiederholen Sie die Schritte 5 und 6 alle 3 Tage bis zum 18. Tag.
- Transfer von Neurosphären
- Bereiten Sie am Tag 18 Cortical Differentiation Medium II (CDMII) vor (Tabelle 1) und geben Sie 10 ml in eine 100 mm Ultra-Low Attachment Cell Culture Plate.
- Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die runden Neurosphären von der 96-Well-Platte auf die 100-mm-Zellkulturplatte mit extrem niedriger Befestigung zu übertragen.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um die Neurosphären nicht zu beschädigen, indem Sie sicherstellen, dass die Öffnung der Spitze breit genug ist und dass die Aggregate nicht zu schnell abgesaugt werden. - Entfernen Sie 5 ml Medium von der Platte, die die Neurosphären enthält, und fügen Sie 5 ml frisches CDMII hinzu.
HINWEIS: Dieses Verfahren hilft, die Menge an CDMI-Medium zu reduzieren, die möglicherweise aus dem Transfer von Neurosphären übertragen wurde. - Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2.
HINWEIS: Untersuchen Sie die Neurosphären am nächsten Tag visuell. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Orbitalschüttlers, wenn die Neurosphären zusammengeklumpt oder am Boden der Platte befestigt sind. - Alle 3 Tage das überstehende Medium vorsichtig absaugen und durch frisches CDMII ersetzen. Lassen Sie eine kleine Menge des Mediums, um zu verhindern, dass die Neurosphären austrocknen.
- Bereiten Sie am Tag 35 Kortikales Differenzierungsmittel III (CDMIII) vor (Tabelle 1).
HINWEIS: Die Matrixkomponente sollte in kaltem CDMIII gelöst werden. - Saugen Sie das Medium von der Platte ab und fügen Sie 10 ml kaltes CDMIII hinzu.
HINWEIS: Es ist effektiver, kaltes Medium zu verwenden, damit die Matrixkomponente die Organoide beschichten kann, ohne Klumpen zu bilden. - Nach dem Wechsel des Mediums legen Sie die Platte wieder auf einen Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2.
- Wechseln Sie das Medium alle 3-5 Tage, abhängig von der Wachstumsrate, wie durch die Farbe des Mediums angezeigt.
- Bereiten Sie am Tag 70 das kortikale Differenzierungsmedium IV (CDMIV) vor (Tabelle 1). Verwenden Sie CDMIV-Medium, bis das gewünschte Alter der Organoide erreicht ist. Während dieser Zeit bewahren Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 ° C und 5% CO2) auf.
- Wechseln Sie das Medium alle 3-5 Tage, abhängig von der Wachstumsrate.
2. Immunfärbung von Hirnorganoiden
- Gewebepräparation
- Bereiten Sie 4% ige Paraformaldehyd (PFA) -Lösung vor und legen Sie sie unter eine Sicherheitshaube.
HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit PFA persönliche Sicherheitsausrüstung. - Sammeln Sie Gehirnorganoide und übertragen Sie sie vorsichtig mit einer stumpfen 3 ml Kunststoff-Pasteur-Pipette auf eine mit PFA gefüllte 6-Well-Platte.
HINWEIS: Verwenden Sie Organoide, die älter als 40 Tage sind, um die Visualisierung von Strukturen mit höherer zellulärer Komplexität zu ermöglichen. - Bewahren Sie die Organoide in der PFA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur auf.
- Entfernen Sie die PFA vorsichtig mit einer 3 ml Kunststoff-Pasteurpipette und waschen Sie die festen Organoide dreimal mit PBS.
- Die festsitzenden Organoide bei 4 °C in PBS bis zur weiteren Verwendung lagern.
- Bereiten Sie 4% ige Paraformaldehyd (PFA) -Lösung vor und legen Sie sie unter eine Sicherheitshaube.
- Vorbereitung von Organoidschnitten des Gehirns
- Bereiten Sie eine 3% ige Agarlösung vor und erhitzen Sie sie langsam, bis sie verflüssigt ist.
- Legen Sie die Form (das geschnittene Ende einer 10-ml-Spritze) auf ein Stück saugfähiges Filterpapier (glatte Seite nach oben). Legen Sie einen Tropfen Agar darauf.
- Nehmen Sie schnell ein einzelnes Organoid mit einem Spatel aus der 6-Well-Platte und entfernen Sie überschüssiges PBS mit Filterpapier.
HINWEIS: Achten Sie darauf, das Organoid nicht direkt mit Filterpapier zu berühren. - Legen Sie das Organoid auf das Agartröpfchen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu drei Organoiden.
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um eine Erstarrung des Agars während dieses Schritts zu vermeiden. - Füllen Sie die Form mit Agar auf, bis alle Organoide vollständig bedeckt sind.
- Warten Sie, bis das Agar zu erstarren beginnt, und übertragen Sie dann vorsichtig die gesamte Form, die die Organoide enthält, einschließlich des absorbierenden Filterpapiers, auf ein Kühlelement.
HINWEIS: Wenn ein Kühlelement nicht verfügbar ist, lagern Sie die Organoide einige Minuten im Kühlschrank bei 4 °C. - Bereiten Sie sich in der Zwischenzeit auf den Schneidevorgang vor: Legen Sie eine Rasierklinge (mit Aceton gereinigt und mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen) in den Halter des Vibratoms, montieren Sie es auf das Bad und füllen Sie es mit PBS.
- Entfernen Sie die Form von (erstarrtem) Agar und schneiden Sie sie mit einem Skalpell zu einem Würfel ab.
- Befestigen Sie den Agarwürfel mit den Organoiden auf der Trägerplatte des Vibratoms mit Klebegel (siehe Materialtabelle) und legen Sie ihn in das PBS-haltige Bad.
- Stellen Sie das Vibratom (siehe Materialtabelle) ein, um Scheiben mit einer Dicke von 150 μm zu schneiden.
HINWEIS: Die Vibratomeinstellungen (richtiger Winkel, Amplitude, Frequenz und Geschwindigkeit der Klinge) können denen ähneln, die zum Schneiden von festem Hirngewebe aus frühen postnatalen Tieren verwendet werden. Die idealen Einstellungen hängen jedoch stark von der Art des Vibratoms ab und müssen in einem ersten Schritt bestimmt werden, um eine Verzerrung oder gar ein Reißen des Gewebes beim Schneiden zu verhindern. - Starten Sie den Schneidvorgang. Verwenden Sie eine Glaspipette oder einen Spatel, um jede frisch geschnittene Scheibe vorsichtig in eine mit PBS gefüllte 24-Well-Platte zu geben.
- Lagern Sie den Teller mit den Scheiben bei 4 °C (bis zu einigen Tagen) bis zur Weiterverarbeitung.
- Die Scheiben mit einer Glaspipette oder einem Spatel aus der Platte auf Objektträger übertragen. Verwenden Sie mindestens 2 Scheiben pro Folie.
- Entfernen Sie vorsichtig das Agar und das überschüssige PBS mit einer Spritze.
- Lassen Sie die Scheiben trocknen, bis sie an den Objektträgern haften.
HINWEIS: Während Objektträger in Kunststoffkammern gelagert werden können, die bei 4 °C mit PBS gefüllt sind, sollten sie so schnell wie möglich nach dem Schneidevorgang gefärbt werden.
- Immunhistochemische Färbung
- Bereiten Sie die blockierende Lösung vor (Tabelle 1).
- Verwenden Sie einen PAP-Stift, um einen hydrophoben Rand um die Scheiben auf dem Objektträger zu zeichnen, um alle Lösungen auf den Objektträgern zu halten.
- Die Sperrlösung vorsichtig auf den Objektträger geben und 1 h bei Raumtemperatur (22-25 °C) inkubieren. Um eine Zerstörung des Gewebes zu vermeiden, fügen Sie die Lösung nicht direkt auf die Scheiben hinzu.
- Aspirieren Sie die Blocklösung und tragen Sie den gewünschten primären Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt auf.
- Inkubieren Sie den Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C.
- Spülen Sie den Objektträger dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min ab.
- Inkubieren Sie die Scheiben mit dem in der Blocklösung verdünnten spezifischen Sekundärantikörper und führen Sie eine Hoechst-Färbung (1:2.500) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln durch.
HINWEIS: Denken Sie daran, Negativkontrollen durchzuführen, um sicherzustellen, dass keine unspezifische Bindung oder Autofluoreszenz vorliegt. - Spülen Sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min im Dunkeln.
- Fügen Sie der Scheibe einen Tropfen Montagemedium hinzu, legen Sie einen Deckglas auf den Rand des Tropfens und legen Sie den Deckglas langsam in Richtung der Scheibe, um Luftblasen zu vermeiden.
- Lassen Sie die Rutsche über Nacht bei Raumtemperatur ruhen. Tragen Sie Nagellack auf den Rand des Deckglases auf, um den Objektträger weiter zu versiegeln. Für die Langzeitlagerung bei 4 °C lagern.
- Dokumentation der Färbung
- Um große Bilder für das Stitching zu scannen, verwenden Sie ein motorisiertes aufrechtes Weitfeldmikroskop, das mit (siehe Materialtabelle für Details) einem hochwertigen Objektiv ausgestattet ist. DAPI-Filterset (z.B. Anregung (EX): 340-380 nm, dichroitischer Spiegel (DM): 400 nm, Sperrfilter (BA): 435-485 nm); Fluorescein-Isothiocyanat-Filterset (z. B. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 Filterset (z.B. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); Digitalkamera; Leistungsstarke Erfassungssoftware, die automatisierte Stiche und Stack-Operationen ermöglicht.
- Verwenden Sie für die Bildbearbeitung ein Bildverarbeitungsprogramm, das in der Lage ist, 8-Bit-Tif-Dateien zu generieren, Stiche zuzuschneiden, Kontrast und Helligkeit anzupassen, die Kanäle (z. B. Blau, Grün und Rot) zusammenzuführen und Maßstabsleisten hinzuzufügen.
- Um Details zu scannen, verwenden Sie ein motorisiertes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem hochwertigen Objektiv, einem UV-Laser (EX: 408 nm), einem Argon-Laser (EX: 488 nm), einem Helium-Neon-Laser (EX: 543) und einer Bildgebungssoftware für ein konfokales Mikroskop ausgestattet ist.
- Verwenden Sie für die Bildbearbeitung von Details ein Bildverarbeitungsprogramm, das in der Lage ist, Projektionen mit maximaler Intensität von konfokalen Z-Stacks (z. B. optische Abschnitte von jeweils 0,6 μm) zu erzeugen, 8-Bit-Tif-Dateien zu generieren, Kontrast und Helligkeit anzupassen, die Kanäle (z. B. Blau, Grün und Rot) zusammenzuführen und Skalierungsbalken hinzuzufügen.
- Verwenden Sie einen grafischen Editor, um die Figuren anzuordnen.
3. Bioenergetische Profilierung von Hirnorganoiden
- Präparation von Organoiden für das bioenergetische Profiling
- Bereiten Sie die Papain- und DNase-Lösung nach dem Protokoll des Herstellers vor.
- Übertragen Sie 3-5 Organoide in eine 6-Well-Platte. Waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmtem PBS.
- Fügen Sie 2 ml vorgewärmte aktivierte Papainlösung hinzu, die DNase enthält. Schneiden Sie die Organoide mit einer Klinge in kleine Stücke.
- Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 27 U / min in einem Zellkulturinkubator (bei 37 °C, 5% CO2) und inkubieren Sie für 15-20 min.
HINWEIS: Die Zeit der Inkubation hängt vom Organoidstadium ab. Organoide im Frühstadium können so verwendet werden, wie sie sind. Für Organoide, die älter als 3 Monate sind, wird empfohlen, die Organoide vor der Dissoziation in 2-3 Stücke zu schneiden und die Stücke mit einer Schaukelgeschwindigkeit bei 27 U / min für 15-20 min bei 37 ° C zu inkubieren. Dieses Verfahren kann helfen, nekrotisches Gewebe zu entfernen, das in den Organoiden im späten Stadium vorhanden sein kann. - Sammeln Sie die verdauten Gewebe in einem 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml Organoidkulturmedium CDMIV hinzu (Tabelle 1).
- Triturieren Sie das Gewebe mit einer 10 ml Kunststoffpipette, indem Sie 10-15 Mal auf und ab pipettieren. Lassen Sie das unzusammenhängende Gewebe sich auf dem Boden der Röhre absetzen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in einen 15-ml-Röhrchen, wobei Nichtsoziierte Gewebestücke vermieden werden. Filtern Sie die Lösung durch ein 40 μm Zellsieb (z. B. Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappen).
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Beurteilen Sie die Zellzahl und -qualität mit trypan blue.
- Platten Sie die gewünschte Anzahl (~ 20.000 / Well) von Zellen auf beschichtete 96-Well-Mikroplatten. Wechseln Sie das Medium 6-8 h nach der Beschichtung zu Neuronales Medium (Tabelle 1).
- Inkubieren Sie die beschichtete 96-Well-Mikroplatte in einem CO2-Inkubator (37 °C, 5% CO2) für 4 Tage.
- Bioenergetische Profilerstellung
- Geben Sie an Tag 3 nach dem erneuten Plattieren der dissoziierten Zellen 200 μL Kalibrierlösung in jede Vertiefung des unteren Teils der 96-Well-Mikroplatte und legen Sie die obere grüne Sensorkartusche auf die hydratisierte Mikroplatte.
HINWEIS: Legen Sie die Sensorkassette in der richtigen Ausrichtung auf die Mikroplatte und stellen Sie sicher, dass die Kalibrierlösung alle Sensoren abdeckt. - Inkubieren Sie die hydratisierte 96-Well-Mikroplatte in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 °C über Nacht.
- Schalten Sie den Analysator ein, damit sich das Gerät über Nacht bei 37 °C stabilisieren kann.
- Untersuchen Sie am Tag 4 nach der Neuplattierung die dissoziierte Organoidkultur auf der 96-Well-Mikroplatte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen als konfluente Monoschicht erscheinen.
- Assay-Medium vorbereiten (Tabelle 1).
- Entfernen Sie neuronales Medium mit einer Pipette aus allen Vertiefungen, ohne den Boden des Brunnens zu berühren, um Zellschäden zu vermeiden. Alternativ können Sie die gesamte Platte vorsichtig umkehren und dann auf sauberem Papier trocknen. Arbeiten Sie schnell, um den Zelltod zu vermeiden.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmten 200 μL Assay Medium. Geben Sie Assay Medium zu einem Endvolumen von 180 μL pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Mikroplatte in einem Co2-freien Inkubator bei 37 °C für 1 h.
- 10 μM-Lösungen von mitochondrialen Inhibitoren in Assay-Medium herstellen. Beachten Sie, dass die Endkonzentration nach der Injektion 1 μM beträgt.
- Laden Sie die Sensorkartusche, die in die hydratisierte Mikroplatte gelegt wird, mit 10-fachen Lösungen der mitochondrialen Inhibitoren.
- Fügen Sie 18 μL des mitochondrialen Inhibitors 1 in Port A hinzu.
- 19,8 μL des mitochondrialen Inhibitors 2 in Port B geben.
- 21,6 μL des mitochondrialen Inhibitors 2 in Port C geben.
- Fügen Sie 23,4 μL des mitochondrialen Inhibitors 3 in Port D hinzu.
- Legen Sie die geladene Kartusche bis zum Beginn des Assays in die hydratisierte Mikrotiterplatte in einen CO2-freien Inkubator bei 37 °C.
- Richten Sie ein laufendes Protokoll in der Software des Geräts ein (Tabelle 2).
- Drücken Sie START. Nehmen Sie die geladene Kartusche aus dem Nicht-CO2-Inkubator und legen Sie sie zur Kalibrierung in den Analysator.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Platte in der richtigen Ausrichtung und ohne Deckel eingesetzt ist. - Sobald der Kalibrierungsschritt beendet ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte. Nehmen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte aus dem Nicht-CO2-Inkubator und legen Sie sie in den Analysator. Klicken Sie auf WEITER, um die Messungen zu starten.
- Wenn der Lauf beendet ist, entfernen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte aus dem Analysator und sammeln Sie das Medium aus allen Vertiefungen, ohne die Zellen zu stören.
HINWEIS: Das Medium kann bei -20 °C gelagert und später zur Messung der von den Zellen im Medium freigesetzten Laktatmenge mit einem geeigneten Laktat-Assay-Kit verwendet werden. - Waschen Sie die Zellen mit 200 μL 1x PBS in jeder Vertiefung.
- Nach dem Entfernen des PBS die Platte bei -20 °C einfrieren.
HINWEIS: Die gefrorene Platte kann verwendet werden, um Zellen, Proteine oder DNA in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zu quantifizieren. Diese Quantifizierung wird für die Normalisierung der erhaltenen bioenergetischen Raten benötigt. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Zell-, Protein- oder DNA-Quantifizierungsassays.
- Geben Sie an Tag 3 nach dem erneuten Plattieren der dissoziierten Zellen 200 μL Kalibrierlösung in jede Vertiefung des unteren Teils der 96-Well-Mikroplatte und legen Sie die obere grüne Sensorkartusche auf die hydratisierte Mikroplatte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll erleichtert die robuste Erzeugung von runden Organoiden (Abbildung 1A).< Die erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Hilfe von axonspezifischen Proteinmarkern (SMI312) und Dendriten (Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)) sichtbar gemacht werden können (Abbildung 1B). Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen (MAP2-positiv), sondern auch Gliazellen (z.B. positiv für den Astrozytenmarker S100 Calcium-bindendes Protein B (S100ß)) (Abbildung 1B).
Durch die Analyse von geschnittenen Hirnorganoiden mittels konfokaler Mikroskopie ist es möglich, die detaillierte Verteilung und Organisation verschiedener Zelltypen und Zellstrukturen zu identifizieren und zu überwachen. Dies könnte neue Erkenntnisse darüber liefern, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung des Nervensystems beeinflussen könnten. Beispielsweise ist es möglich, neuronale Axone (SMI312-positiv) und Dendriten (MAP2-positiv) (Abbildung 2A) oder das gegenseitige Auftreten von neuronalen Zellen (MAP2-positiv) und Gliazellen (S100ß-positiv) zu überwachen (Abbildung 2A). Konfokale Bilder können auch helfen, die Verteilung und Organisation neuronaler Vorläufer ((geschlechtsbestimmende Region Y) box-2 (SOX2)-positiv) in Bezug auf Neuronen (Beta-III-Tubulin (TUJ1)-positiv) genauer zu untersuchen (Abbildung 2B). Schließlich können Gehirnorganoide für mitochondrienspezifische Marker (wie das äußere mitochondriale Membranprotein, Translokase der äußeren Membran 20 kDa Untereinheit (TOM20)) gefärbt werden (Abbildung 2C).
Das beschriebene Protokoll ermöglicht es Forschern, ein bioenergetisches Profiling von Hirnorganoiden durchzuführen. Mit diesem Verfahren ist es möglich, sowohl den mitochondrialen Metabolismus mit der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) (Abbildung 2D) als auch den glykolytischen Metabolismus mit der extrazellulären Säuerungsrate (ECAR) zu messen (Abbildung 2E). Bioenergetisches Profiling ermöglicht es zu überwachen, wie Zellen ihre OCR- und ECAR-Profile als Reaktion auf eine sequentielle Verabreichung von mitochondrialen Inhibitoren modifizieren können.
Zunächst kann der ATP-Synthase-Inhibitor Oligomycin angewendet werden. Oligomycin verursacht einen Abfall des OCR-Profils (Abbildung 2D) und identifiziert daher die OCR, die für die ATP-Produktion benötigt wird. Bei der Oligomycin-Behandlung kann es auch zu einem kompensatorischen Anstieg von ECAR kommen (Abbildung 2E), was darauf hindeutet, dass die Zellen die Glykolyse hochregulieren können, um den durch die Verringerung des mitochondrialen Stoffwechsels verursachten metabolischen Stress zu verhindern. Die anschließende Doppelapplikation des Protonenionophors Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) verursacht den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Da sich die Sauerstoffmoleküle nun frei bewegen können, führt dies zu einem raschen Anstieg der OCR (Abbildung 2D).
Diese Veränderungen im OCR-Profil identifizieren die maximale Atmungskapazität der Zellen. Die endgültige Verabreichung von Rotenon plus Antimycin A verursacht eine Blockierung des Elektronentransports und damit eine starke Abnahme der OCR (Abbildung 2D). ECAR kann nach der Behandlung mit FCCP und Rotenon plus Antimycin A (Abbildung 2E) Schwankungen aufweisen, abhängig von der restglykolytischen Kapazität der Zellen. Die OCR- und ECAR-Profile können in Gehirnorganoiden, die von mitochondrialen Patienten stammen, dramatisch verändert sein.
Abbildung 1: Erzeugung von Hirnorganoiden aus menschlichen iPS-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Protokolls zur Herstellung von Hirnorganoiden mit entsprechenden Übertragungsbildern. Tag 0 entspricht der Dissoziation von iPS-Zellen und der Aussaat in einer 96-Well-Platte mit V-Boden unter Verwendung von CDMI, ergänzt mit einem ROCK-Inhibitor, einem WNT-Inhibitor und SB431542. Am Tag 18 werden Neurosphären von den 96-Well-Platten auf 100 mm Zellkulturschalen mit CDMII und N2 ergänzt. Ab diesem Zeitpunkt werden die Kulturen auf einem Orbitalschüttler positioniert. Am Tag 35 wird das Medium von CDMII auf CDMIII umgeschaltet, das ebenfalls eine gelöste Matrixkomponente enthält (Tabelle 1). Ab Tag 70 wird CDMIII auf CDMIV umgestellt, ergänzt um B27. Ein repräsentatives Neurosphärenbild wurde an Tag 12 mit einer Mikroskopkamera mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Ein frühes Organoidbild wurde an Tag 22 mit einer Mikroskopkamera bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen. Ein ausgereiftes Organoidbild wurde am Tag 40 mit einer Mikroskopkamera mit 4-facher Vergrößerung aufgenommen. (B) Die Gesamtstruktur und zelluläre Organisation von Hirnorganoiden kann mittels Weitfeldmikroskopie visualisiert werden. Repräsentativ zusammengefügte Weitfeldbilder werden gezeigt, um die Beziehungen zwischen Dendriten (MAP2-positiv) und Axonen (SMI312-positiv) sowie zwischen neuronalen Zellen (MAP2-positiv) und vermuteten Astrozyten (S100ß-positiv) zu visualisieren. Die Zellen wurden mit Hoechst gegengefärbt, um die Kerne freizulegen. Alle Bilder wurden mit 78 Tage alten Gehirnorganoiden aufgenommen. Die rechte Spalte zeigt die Überlagerung von drei Kanälen (Merge). Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: iPSC = induced pluripotent stem cell; CDM = Kortikales Differenzierungsmedium; ROCK = Rho-Kinase; MAP2 = Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2; S100ß= S100 Calcium-bindendes Protein B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Visualisierung und bioenergetisches Profiling von Hirnorganoiden für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Die detaillierte Organisation und Architektur von Organoiden kann mittels konfokaler Mikroskopie analysiert werden. Alle Bilder wurden mit 78 Tage alten Gehirnorganoiden aufgenommen und mit Hoechst gegengefärbt, um die Kerne freizulegen. Die rechte Spalte zeigt die Überlagerung von drei Kanälen (Merge). Maßstabsbalken = 50 μm. (A) Repräsentative Projektionen mit erweitertem Fokus (44-48 optische Ebenen, je 0,6 μm), die das Zusammenspiel zwischen Dendriten (MAP2-positiv, Pfeilspitzen) und Axonen (SMI312-positiv, Pfeile) sowie zwischen neuronalen Zellen (MAP2-positiv, Pfeilspitzen) und mutmaßlichen Astrozyten (S100ß-positiv, Pfeile) adressieren. (B) Repräsentative Projektionen mit erweitertem Fokus (14-31 optische Ebenen, je 0,6 μm), die die Verteilung von Neuronen (TUJ1-positiv, Pfeilspitzen) in Bezug auf neuronale Vorläufer (SOX2-positiv, Pfeile) zeigen. (C) Repräsentative Projektionen mit erweitertem Fokus (20 optische Ebenen, je 0,6 μm), die die Verteilung innerhalb von Neuronen (TUJ1-positiv, Pfeilspitzen) von Mitochondrien zeigen (visualisiert mit Antikörpern gegen das äußere mitochondriale Membranprotein TOM20, Pfeile). (D) Die mitochondriale Atmung von Hirnorganoiden kann basierend auf dem Profil der OCR nach sequenzieller Verabreichung verschiedener mitochondrialer Inhibitoren überwacht werden (Details siehe Text). (E) Die glykolytische Aktivität von Hirnorganoiden kann basierend auf dem ECAR bei sequentieller Verabreichung mitochondrialer Inhibitoren überwacht werden (Details siehe Text). Für das bioenergetische Profiling wurden etwa 10-15 Gehirnorganoide dissoziiert, um genügend Zellen für die Neuplattierung auf die 96-Well-Mikroplatte zu erhalten. Die Balken zeigen die SEMs basierend auf den Ergebnissen an, die in zwei unabhängigen Experimenten erzielt wurden. Abkürzungen: MAP2 = Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2; S100ß = S100 Calcium-bindendes Protein B; TUJ1 = Beta-III-Tubulin; SOX2 = (geschlechtsbestimmende Region Y) Box-2; TOM20 = Translokase der äußeren Membran 20 kDa Untereinheit; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ECAR = extrazelluläre Säuerungsrate; Oligom. = Oligomycin; FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; R = Rotenon; AntA = Antimycin A; SEMs = Standardfehler der Mittelwerte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Medienkomposition | |||
| CDMI (Tag 0-18) | Finale conc. | ||
| Glasgow-MEM | Gibco | 11710-035 | [1:1] |
| Knockout Serum Ersatz (KSR) | Gibco | 10828010 | 20% |
| MEM-NEAA (MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung) | Gibco | 11140-050 | 0,1 mM |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| 2-Mercaptethanol | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM |
| Penicillin und Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml und 100 μg/ml |
| CDMII (Tag 18-35) | Finale conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 m² |
| N-2 Ergänzung (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch definiertes Lipidkonzentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin und Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml und 100 μg/ml |
| CDMIII (Tag 35-70) | Finale conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 m² |
| N-2 Ergänzung (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch definiertes Lipidkonzentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin und Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml und 100 μg/ml |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 1% |
| CDMIV (Tag 70+) | Finale conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 2 m² |
| N-2 Ergänzung (100x) | Gibco | 17502-048 | 1% |
| Chemisch definiertes Lipidkonzentrat | Gibco | 11905031 | 1% |
| Penicillin und Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/ml und 100 μg/ml |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | 10% |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | 5 μg/ml |
| Matrigel | Corning | 356231 | 2% |
| B-27 Ergänzung mit Vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | 2% |
| Neuronales Medium | Finale conc. | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330038 | [1:1] |
| N-2 Ergänzung | Gibco | 17502048 | [1x] |
| B-27 Ergänzung mit Vitamin A 50x | Gibco | 17504044 | [1x] |
| L-Ascorbinsäure | Sigma Aldrich | A92902 | [200 μM] |
| db-cAMP (Dibutyrylcyclisches Adenosinmonophosphat) | Sigma Aldrich | D0627 | 500 μM |
| BDNF (vom Gehirn abgeleiteter neutrotropher Faktor) | MACS Miltenyi | 130-093-811 | [10 ng/ml] |
| GDNF (Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor) | MACS Miltenyi | 130-096-290 | [10 ng/ml] |
| Humanes TGF-β3 (transformierender Wachstumsfaktor-beta3) | MACS Miltenyi | 130-094-007 | [1 ng/ml] |
| Assay-Medium | Finale conc. | ||
| Seepferdchen XF DMEM medium | Seepferdchen Biowissenschaften | 103680-100 | 500 ml |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360070 | 1 mM |
| L-Glutamin | Lonza | BEBP17-605E | 2 m² |
| Traubenzucker | Sigma Aldrich | 50-99-7 | 10 mM |
| Blockierende Lösung | Finale conc. | ||
| PBS-Tween | [1:1] 0,1% Tween | ||
| Esel Serum | Sigma Aldrich | D9663 | 10% |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | 1% |
Tabelle 1: Details zu Medien und Lösungen, die für die Organoiderzeugung verwendet werden.
| Initialisierung | Ausgangswert (x3) | Oligomycin Injektion (X3) | FCCP-Injektion (X3) | FCCP-Injektion (X3) | Anti A + Rot Injektion (X3) |
| Kalibrieren | Mischen | Mischen | Mischen | Mischen | Mischen |
| (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
| Gleichgewicht (12:00) | Warte | Warte | Warte | Warte | Warte |
| (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
| Messen (03:00) | Messen (03:00) | Messen (03:00) | Messen | Messen (03:00) | |
| (03:00) |
Tabelle 2: Protokollaufbau für bioenergetische Profilerstellung. Beschreibung der Schritte und ihrer Länge in Minuten mit der Seahorse Wave Desktop-Software. Abkürzungen: FCCP = carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon; Rot = Rotenon; Anti A = Antimycin A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser Artikel beschreibt die reproduzierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert20. Ein großer Vorteil des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es nicht die manuelle Einbettung jedes Organoids in eine Gerüstmatrix erfordert. Tatsächlich wird die Matrixlösung einfach in das Zellkulturmedium gelöst. Darüber hinaus müssen keine teuren Bioreaktoren eingesetzt werden, da Organoide in Standard-Gewebekultur-6-Well-Platten kultiviert werden können, die auf einem Orbitalschüttler im Inkubator positioniert sind. Dieses Verfahren ermöglicht auch die parallele Kultivierung mehrerer Platten mit unterschiedlichen Organoiden, die aus verschiedenen Einzellinien stammen, wodurch der Durchsatz der Experimente erhöht und die Überwachung potenzieller Unterschiede in den Wachstumsprofilen verschiedener Organoide ermöglicht wird. Wir testeten dieses Protokoll mit verschiedenen iPS-Zellen, die von gesunden Kontrollen und Personen, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind, mit konsistenten Ergebnissen abgeleitet wurden.
Für die mitochondriale Krankheitsmodellierung ist es wichtig, verschiedene Marker zu verwenden, um die Morphologie und Organisation des mitochondrialen Netzwerks zu visualisieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung, ob die Anzahl, Morphologie oder Verteilung der Mitochondrien in Gehirnorganoiden, die von Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen stammen, verändert sein könnte. Das Vorhandensein und die Organisation neuronaler Vorläufer innerhalb der Gehirnorganoide könnte für die Modellierung mitochondrialer Störungen von entscheidender Bedeutung sein. Wir haben kürzlich entdeckt, dass Mutationen, die die mitochondriale Erkrankung, das Leigh-Syndrom, verursachen, die zelluläre Architektur und Verteilung neuronaler Vorläuferzellen innerhalb der vom Patienten abgeleiteten Gehirnorganoide stören18.
Für die Durchführung eines bioenergetischen Profilings haben wir eine zuvor beschriebene Methode zur Beurteilung der Bioenergetik pluripotenter Stammzellen angepasst21. Ein kürzlich durchgeführtes Protokoll beschrieb, wie ein bioenergetisches Profiling von Organoiden durchgeführt werden kann, die aus dem Dünndarm der Maus, dem menschlichen Dickdarm und kolorektalen Tumoren gewonnen werden22. Diese Organoide sind jedoch im Vergleich zu Gehirnorganoiden recht klein, und daher ist ein anderes Protokoll, wie das hier berichtete, für Gehirnorganoide erforderlich. Wir haben dieses Protokoll kürzlich zur Bewertung des bioenergetischen Profils menschlicher Hirnorganoide eingesetzt, die Mutationen im Surfeit Locus Protein 1-Gen (SURF1) tragen, das die schwere mitochondriale Erkrankung Leigh-Syndrom18 verursacht. Wir fanden heraus, dass das OCR-Profil bei Organoiden des Leigh-Syndroms besonders betroffen ist, wie eine signifikante Abnahme des basalen OCR-Spiegels, der ATP-Produktionsrate und der maximalen Atemfrequenz zeigt18.
Abschließend stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung menschlicher Hirnorganoide vor und beschreiben, wie Experimente durchgeführt werden können, die für die Untersuchung der Krankheitsmechanismen, die mitochondrialen Erkrankungen zugrunde liegen, wichtig wären. Organoide des menschlichen Gehirns können auch von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der mitochondrialen Vielfalt im menschlichen Gehirn und ihrer Rolle für die menschliche Gesundheit und Krankheiten sein23. Es ist wichtig klarzustellen, dass Gehirnorganoide, die mit derzeit verfügbaren Protokollen, einschließlich des hier beschriebenen, erzeugt wurden, immer noch Einschränkungen aufweisen. Dazu gehören beispielsweise die fehlende Vaskularisierung und das Fehlen einer Mikroglia-Population24. Diese Aspekte müssen berücksichtigt werden, um die Ergebnisse richtig zu interpretieren.
Zum Beispiel könnte der Mangel an Gefäßen und Mikroglia kompensatorische Mechanismen einschränken, die in vivo vorhanden sein können. Vom Patienten abgeleitete Hirnorganoide könnten daher Defekte aufweisen, die stärker sind als die bei Patienten beobachteten 17,18. Darüber hinaus kann trotz einer allgemeinen Reproduzierbarkeit dieses Protokolls20 eine Line-to-Line-Heterogenität beobachtet werden. Zu diesem Zweck ist es bei der Durchführung von Krankheitsmodellierungsstudien immer wichtig, die Einheitlichkeit von Kontroll- und Patientenorganoiden systematisch zu quantifizieren, indem die Muster der Morphologie (Größe, Schicht) und die Verteilung molekularer Marker auf verschiedene Organoide bewertet werden.
Schließlich ist es nicht möglich, Gehirnorganoide aus einem einzigen iPSC zu erzeugen, was die Machbarkeit eines groß angelegten genetischen Screenings mit CRISPR/Cas9 einschränkt. Angesichts des Forschungstempos ist es wahrscheinlich, dass einige der derzeitigen Einschränkungen des hier beschriebenen Protokolls bald überwunden werden. Optimierte Protokolle werden verfügbar sein. Diese 3D-Modelle von mitochondrialen Erkrankungen werden hoffentlich die Entdeckung umsetzbarer Therapien für mitochondriale Erkrankungen, die schädlich sind, und für unheilbare Krankheiten mit hohem ungedecktem medizinischem Bedarf ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Miriam Bünning für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 an A.P.), Spark und dem Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds an A.P.), der United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant an A.P.), dem Universitätsklinikum Düsseldorf (Forschungskommission UKD an A.P.) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (d: Bio Young Investigator Grant AZ 031L0211 an A.P.). Die Arbeiten im Labor von C.R.R. wurden von der DFG gefördert (FOR 2795 "Synapsen unter Stress", Ro 2327/13-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A.
- Gorman, G. S., et al.
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J.
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
