Summary
Questo protocollo è progettato per fornire informazioni didattiche per la propagazione clonale della Cannabis sativa L. implementando sistemi aeroponici. Il metodo qui descritto include tutte le forniture e i protocolli necessari per riprodurre con successo le proprietà morfologiche e chimiche desiderabili nel genere Cannabis.
Abstract
Questo protocollo descrive la standardizzazione di un'efficiente tecnica di propagazione clonale della canapa utilizzando sistemi aeroponici. Le talee primarie sono state asportate da due varietà di canapa, denominate "Cherry Wine" e "Red Robin" (17-20% w / p CBD), che fungevano da "pianta madre". Un precursore dell'auxina (acido indolo-3-butirrico) è stato applicato per stimolare lo sviluppo delle radici nella porzione basale delle talee asportate prima del posizionamento nel sistema. Le talee sono state leggermente nebulizzate con la soluzione di nebbia nutriente ogni tre giorni per fornire supporto nutrizionale poiché la soluzione contiene i macronutrienti essenziali, tra cui azoto, fosforo e potassio. Il serbatoio dell'acqua del sistema aeroponico ha mantenuto un intervallo di pH compreso tra 5,0-6,0 e una temperatura dell'acqua compresa tra 20-22 °C. Una pompa sommergibile dell'acqua è stata utilizzata per fornire acqua alle talee. Le talee della punta del germoglio sono state fornite con 24 ore di luce al giorno per 10 giorni fino allo sviluppo delle radici, su cui le talee radicate sono state trapiantate a scopo di ricerca. Questi sistemi aeroponici hanno dimostrato di generare risultati desiderabili per la propagazione della cannabis. Il metodo qui descritto allevia i potenziali vincoli di tempo che derivano dai metodi tradizionali per consentire un mezzo più efficiente per la propagazione asessuata della Cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. è una pianta da fiore annuale, dioica, classificata nella famiglia delle Cannabaceae. I cannabinoidi, prodotti prevalentemente all'interno di tricomi ghiandolari situati sullo strato epidermico esterno dei tessuti brattee sulle infiorescenze femminili1, stanno diventando un argomento di ricerca sempre più popolare, principalmente a causa delle loro proprietà medicinali progressivamente riconosciute. Il cannabidiolo (CBD) è il secondo cannabinoide più importante presente nella cannabis dopo il Δ9-tetraidrocannabinolo (THC) ed è attribuito a una serie di benefici medicinali, tra cui proprietà analgesiche2, proprietà anticonvulsive3, proprietà antidepressive4, riduzione del rischio di diabete5 e trattamento di vari disturbi del sonno6. A causa della moltitudine di benefici per la salute associati ai metaboliti della pianta di cannabis, c'è una crescente domanda per la sua produzione su scala commerciale7. Per soddisfare questa domanda, i metodi di coltivazione vengono costantemente migliorati e reinventati per fornire continuamente materiale vegetale coerente e di alta qualità all'emergente industria della cannabis.
La propagazione della Cannabis può essere facilitata in due modi: riproduzione sessuale o asessuata. Un esempio di riproduzione sessuale è l'impollinazione di un ovulo femmina con polline proveniente dallo stame di un maschio con conseguente seme che può essere germinato. La germinazione dei semi è un metodo di coltivazione affidabile che è stato utilizzato per scopi di riproduzione e coltivazione in cui i tratti fenotipici desiderabili sono selezionati in linee parentali per migliorare la qualità della prole Piante di cannabis , compresi tratti come la tolleranza alla siccità, la resistenza agli insetti, l'aumento della resa e l'aumento della potenza8 . Tuttavia, l'impollinazione incrociata non intenzionale è un rischio intrinseco quando si esegue la riproduzione sessuale, causando una prole indesiderata, che porta alla potenziale perdita di tratti desiderabili o all'introduzione di tratti indesiderati. Un esempio di questa impollinazione involontaria è evidenziato dai coltivatori di canapa che ricevono semi di canapa impollinati con polline che produce THC con conseguente significativa perdita economica a causa delle piante non conformi (>0,3% THC totale w / w) 9. Inoltre, per generare un raccolto composto da sole femmine, un seme femminizzato deve essere seminato invece di un seme non femminizzato, che può portare a ermafroditismo e altri tratti indesiderati che portano alla perdita economica. Per superare la limitazione della riproduzione sessuale della Cannabis, la riproduzione asessuata è stata ampiamente praticata nei modelli di produzione commerciale dell'industria della Cannabis10.
La riproduzione asessuata della Cannabis richiede solo una singola pianta, che consente la moltiplicazione di un singolo genotipo che consente la produzione commerciale di piante che portano caratteristiche agronomiche e farmaceutiche desiderabili. Una forma comune di riproduzione asessuata della cannabis è quella di tagliare e inserire piccole porzioni di una pianta femminile in un substrato fuori suolo11 che è coperto da una cupola di umidità per indurre la formazione di radici. Sebbene questo metodo si sia dimostrato efficace, uno svantaggio comune è l'accumulo di un alto livello di umidità (di solito l'80% o superiore) all'interno della cupola, fornendo un ambiente di crescita ideale per i patogeni fungini, che possono essere dannosi per le nuove talee sensibili. Un'altra forma di propagazione asessuata è la micropropagazione mediante coltura tissutale, in cui tecniche sterili consentono la propagazione di insetti, microbi e materiale vegetale di cannabis privo di virus in uno spazio limitato12. Questo processo, tuttavia, è costoso, richiede tempo e richiede tecnici di laboratorio addestrati che sono generalmente inaccessibili per le strutture di cannabis su larga scala.
Esistono pochissimi rapporti di ricerca pubblicati sulla propagazione clonale della Cannabis. Al fine di fornire una base per la comprensione della riproduzione asessuata della Cannabis per scopi di ricerca e produzione industriale, questo studio mirava a dimostrare la facilità e l'accessibilità dell'impiego di sistemi aeroponici per la propagazione clonale della Cannabis. I sistemi aeroponici sono ideali per la propagazione asessuata della Cannabis, fornendo costantemente acqua ricca di nutrienti alle talee, inducendo la formazione precoce delle radici in modo tempestivo e consentendo di mantenere una pianta a tempo indeterminato, se necessario.
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Protocol
1. Generazione di una pianta madre per la propagazione clonale
- Seleziona una pianta madre sana e femminile che presenti caratteristiche morfologiche e chimiche desiderabili specifiche per l'uso previsto.
- Lasciare che la pianta madre raggiunga la dimensione appropriata (circa 25 germogli maturi) per la propagazione clonale (cioè talee).
- Permettere alle piante madri di rimanere nella fase di crescita vegetativa (luce: scuro = 18 h:6 h) per favorire la crescita dei germogli per la propagazione futura.
2. Costruzione e preparazione del sistema aeroponico
- Inizia posizionando il coperchio sopra il contenitore (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Praticare il numero desiderato di fori nel coperchio fornendo uno spazio adeguato (preferibilmente 3 cm) tra ciascuno.
- Posizionare la pompa dell'acqua (Tabella dei materiali) al centro del contenitore.
- Versare 7-8 L di acqua distillata nel contenitore in modo che l'ugello della pompa rimanga a circa 2,5 cm sopra la linea di galleggiamento.
NOTA: Ciò garantisce che la pompa dell'acqua sommergibile (Table of Materials) sia in grado di spingere l'acqua con una forza sufficiente a diffondersi sul coperchio del contenitore. Si consiglia acqua distillata; tuttavia, può essere utilizzata anche acqua di rubinetto normale. - Collocare la quantità appropriata di cubi Rockwool (3,81 cm) (Table of Materials) o cubi multimediali di scelta in ogni slot. Accendere la pompa e lasciarla funzionare per 24 ore.
NOTA: I cubi di lana di roccia sono preferiti per la loro capacità di "ancoraggio" sulle talee appena radicate che aiutano a mantenere le piante in posizione verticale dopo il trapianto.
3. Selezione ed asportazione dei germogli appropriati
- Raccogli i germogli vicino al meristema apicale usando un bisturi o una forbice sterilizzati. Le talee sono lunghe ~ 10 cm, idealmente con diversi nodi.
NOTA: tagliare lo stelo con un angolo di 45°. Il taglio con un angolo di 45° aumenta la superficie della porzione basale del taglio, consentendo più spazio per lo sviluppo delle radici. È facoltativo realizzare una piccola fessura (1-2 cm) al centro del taglio a 45° per aumentare ulteriormente la superficie. - Rimuovere tutto il fogliame tranne il fogliame presente sui primi tre nodi.
- Immergere il taglio appena asportato nella soluzione di radicazione contenente acido indolo-3-butirrico (IBA) (Tabella dei materiali) ~ 2-5 cm dalla base dello stelo per ~ 5 s.
- Inserire il taglio al centro di un cubo Rockwool posizionato nel sistema aeroponico.
NOTA: la profondità di inserimento del taglio deve rimanere a ~1-2 cm dal fondo del cubo Rockwool. - Spruzzare le talee non radicate con la soluzione di nebbia nutritiva (Tabella dei materiali) ogni 3 giorni.
- Coltivare le talee con 18-24 ore di luce al giorno con una densità di flusso fotonico fotosintetico (PPFD) di 100 μmol/m2/s a 24-29 °C e 40-60% di umidità relativa.
4. Manutenzione del sistema aeroponico e salute del propagule
- Ricostituire il sistema con acqua a un pH compreso tra 5,0 e 6,0 ogni 2-5 giorni.
- Nebulizzare leggermente le talee (una nebbia per taglio) con la soluzione di nebbia nutritiva (Tabella dei materiali) ogni 3 giorni.
- Aggiungere 5 ml di ciascuna soluzione nutritiva (Tabella dei materiali) al serbatoio ogni 3-5 giorni.
NOTA: L'aggiunta di nutrienti fa sì che l'acqua sia marrone e torbida. - Aggiungere 15 ml di soluzione detergente di alghe e batteri contenente acido ipocloroso (0,028%) per 10 L di acqua ogni 5 giorni (Tabella dei materiali).
5. Trapianto di propaguli
- Seleziona le talee con radici lunghe, bianche e fibrose.
NOTA: Evitare talee con sistemi di radici marroni, viscide e corte in quanto questo è un indicatore della presenza di marciume radicale e di solito richiede più tempo per acclimatarsi al nuovo terreno di coltura e può portare malattie indesiderate. - Rimuovere con cura il cubo di Rockwool dal sistema e districare le radici.
- Trapiantare i propaguli di Cannabis in un vaso da vivaio da 4 L riempito con una miscela di terreno nutriente (Table of Materials).
NOTA: si consiglia di annaffiare immediatamente per evitare che le radici si secchino.
6. Pulizia e stoccaggio del sistema aeroponico
- Quando il sistema non è più in uso, lavare con acqua e pulire con etanolo al 70% o un altro disinfettante.
- Rimuovere il filtro dalla pompa dell'acqua e risciacquare con acqua per rimuovere i detriti.
- Asciugare il sistema pulendolo con carta assorbente o un panno.
- Posizionare la pompa all'interno della vasca con il coperchio e conservarla fino a quando non è necessario.
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Representative Results
Per convalidare l'efficienza del sistema aeroponico descritto, un totale di 10 e 12 germogli sani lunghi 14 cm sono stati asportati dalle piante madri, rispettivamente "Cherry Wine" e "Red Robin" (Figura 1A, B). Dopo l'immersione nel supporto di induzione di rooting, i cloni sono stati inseriti nel sistema (Figura 2A). La costruzione e il funzionamento di un sistema aeroponico sono mostrati come diagramma schematico nella Figura 2A.
Dopo 2 giorni di acclimatazione, tutti i cloni hanno iniziato a sviluppare radici in 3-7 giorni e radici completamente sviluppate di 37 cm di lunghezza dopo 10-14 giorni sul sistema, che era sufficiente per essere piantato in un vaso pieno di terra (Figura 2B, D). La Figura 3 mostra la lunghezza media dei germogli e delle radici di ciascuna varietà. La lunghezza delle riprese e la lunghezza delle radici sono state misurate prima del trasferimento al terreno. La lunghezza media dei germogli e delle radici era di 24,8 cm ± 2,4 cm e 37,8 cm ± 2,5 cm per "Cherry Wine" e 21,4 cm ± rispettivamente 2,1 cm e 39,7 cm ± 5,9 cm per "Red Robin" (Figura 3A, B). Le differenze tra le due varietà sono state analizzate da ANOVA bidirezionale, seguito dal test delle molteplici compassioni di Tukey, che non mostra differenze significative nelle lunghezze dei germogli e delle radici tra le due varietà (n = 10-12, p < 0,05).
Figura 1: Una pianta madre sana che genera più germogli per la propagazione clonale. (A) Piante madri mature, "Cherry Wine" (davanti) e "Red Robin" (dietro) a ~4 mesi di crescita vegetativa, che esibiscono numerosi germogli ideali per la propagazione. (B) Lunghezza approssimativa (14 cm) per una corretta escissione del germoglio per la clonazione della cannabis. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Istituzione del sistema aeroponico per la propagazione clonale della Cannabis. (A) Schema che illustra i componenti del sistema aeroponico (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Sistema aeroponico completamente occupato da cloni di "Cherry Wine". (C) All'interno del sistema aeroponico con cloni che mostrano una crescita radicale. (D) Crescita sana delle radici nel cubo di lana di roccia dopo 10 giorni nel sistema aeroponico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazioni della lunghezza delle riprese e delle radici per "Cherry Wine" e "Red Robin" dopo 10 giorni nel sistema di clonazione aeroponica. (A) Un grafico a barre e (B) una tabella che rappresentano la lunghezza del germoglio e della radice nelle due varietà di canapa. Le differenze nelle lunghezze di germoglio / radice tra due varietà sono state analizzate da ANOVA bidirezionale, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con la crescente domanda di piante di cannabis con un contenuto costante di cannabinoidi, vari metodi di propagazione clonale sono stati sfruttati nell'industria della cannabis . La propagazione asessuata mostra diversi vantaggi rispetto ai metodi sessuali per una produzione coerente e su larga scala. Un sistema di propagazione aeroponica è una versione modificata di un sistema idroponico che utilizza una nebbia d'acqua ricca di nutrienti aerati per fornire un rapido sviluppo delle radici. Il sistema aeroponico descritto è composto da tre fasi critiche, 1) generare una pianta "madre" di cannabis femmina sana come fonte genetica per un tratto fisico / chimico desiderato, 2) tagliare i germogli (meristemi apicali) e trattare con mezzi di induzione radicale contenenti il precursore dell'auxina, IBA, e 3) acclimatazione della propagula nel vaso di vivaio desiderato.
Il sistema di propagazione aeroponica consente la produzione efficiente di cloni di canapa con evidenti vantaggi rispetto ai diversi metodi di propagazione. Include 1) risparmio di tempo e costi attraverso una formazione di radici sane e mature che induce meno lavoro non appena 5 giorni; 2) omogeneità genetica - che consente di produrre cloni geneticamente identici, escluse eventuali variazioni genetiche, per accogliere la ricerca riproducibile sulla cannabis e le applicazioni industriali; 3) uniformità nelle operazioni su larga scala; e 4) minore vulnerabilità ai patogeni microbici - mantenendo un livello relativamente basso di umidità nella chioma superiore delle piante rispetto al livello di umidità costruito all'interno del contenitore in cui si verifica lo sviluppo delle radici.
Sebbene il sistema aeroponico offra una serie di vantaggi, sono presentate alcune limitazioni che dovrebbero essere affrontate con attenzione durante le pratiche. In primo luogo, poiché tutti i nutrienti sono forniti idroponicamente, può essere facilmente contaminato da agenti patogeni algali, fungini e virali (ad esempio, viroide latente del luppolo) che portano alla malformazione del sistema radicale che viene mitigata attraverso il trattamento regolare di agenti antimicrobici / fungini / virali. In secondo luogo, l'uso diffuso di una singola pianta madre può essere problematico per gli impianti di produzione. Avere una singola linea di clonazione di genotipo come unica pianta in un modello di produzione comporta un rischio di perdita di intere colture se tale genotipo è suscettibile a un determinato parassita o agente patogeno presente in tale impianto di coltivazione; pertanto, si raccomanda di mantenere più piante madri di diverse linee che vengono utilizzate per propagare cloni di produzione con questo sistema di clonazione aeroponica per limitare la perdita economica da un dato parassita o agente patogeno13. Si consiglia di coltivare vegetativamente una pianta madre solo per non più di 6 mesi prima di clonare una nuova pianta madre da utilizzare come fonte futura per i cloni di produzione. Ciò previene le radici troppo cresciute che possono portare a piante madri malsane e tassi di successo della clonazione più bassi, nonché baldacchini troppo cresciuti che possono ospitare parassiti e agenti patogeni, che possono essere trasmessi ai cloni propagati.
Il sistema aeroponico è scalabile a livello industriale in modo economico. La Figura 1 mostra che almeno 20 materiali vegetali possono essere alloggiati in un unico contenitore (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Il sistema può essere facilmente scalato per contenere più di 50 piante per unità senza aumentare i costi di acqua, sostanze nutritive ed elettricità. I vantaggi qui descritti per il metodo attuale forniscono una ragione per implementare il sistema di clonazione aeroponica nelle pratiche industriali e nei laboratori di ricerca per la propagazione efficiente in termini di tempo e uniforme della cannabis.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dall'Institute of Cannabis Research presso la Colorado State University-Pueblo e dal Ministero della Scienza e delle TIC (2021-DD-UP-0379) e dalla città di Chuncheon (Hemp R & D and industrialization, 2020-2021), Gli autori desiderano anche ringraziare Justin Henderson al Summit CBD per la generosa donazione per i semi di "Cherry Wine".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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