Summary
Этот протокол предназначен для предоставления инструктивной информации для клонального распространения Cannabis sativa L. путем реализации аэропонных систем. Способ, описанный здесь, включает в себя все необходимые материалы и протоколы для успешного воспроизведения желаемых морфологических и химических свойств в роде Cannabis.
Abstract
Этот протокол описывает стандартизацию эффективного метода клонального распространения конопли с использованием аэропонных систем. Первичные побеги черенков были вырезаны из двух сортов конопли, названных «Вишневое вино» и «Красный робин» (17-20% мас./мас. КБД), которые служили «материнским растением». Предшественник ауксина (индол-3-масляная кислота) применяли для стимуляции развития корней в базальной части иссеченных черенков перед помещением в систему. Черенки слегка запотевали раствором питательного тумана каждые три дня, чтобы обеспечить питательную поддержку, поскольку раствор содержит необходимые макроэлементы, включая азот, фосфор и калий. Резервуар для воды аэропонной системы поддерживал диапазон рН между 5,0-6,0 и температурой воды между 20-22 °C. Погружной водяной насос использовался для подачи воды к черенкам. Черенка кончика побега обеспечивали 24 ч света в сутки в течение 10 дней до тех пор, пока не произошло развитие корней, на что корневые черенки пересаживали в исследовательских целях. Эти аэропонные системы доказали, что дают желаемые результаты для распространения каннабиса . Метод, описанный здесь, смягчает потенциальные временные ограничения, возникающие в результате традиционных методов, чтобы обеспечить более эффективные средства для бесполого распространения каннабиса.
Introduction
Каннабис сатива L. является однолетним, двудомным, цветущим растением, классифицированным в семействе Cannabaceae. Каннабиноиды, продуцируемые преимущественно в железистых трихомах, расположенных на наружном эпидермальном слое прицветных тканей на женских соцветиях1, становятся все более популярной темой исследований, прежде всего благодаря их прогрессивно признанным лекарственным свойствам. Каннабидиол (КБД) является вторым наиболее заметным каннабиноидом, обнаруженным в каннабисе после Δ9-тетрагидроканнабинола (ТГК), и приписывается множеству лекарственных преимуществ, включая обезболивающие свойства2, противосудорожные свойства3, антидепрессивные свойства4, снижение риска развития диабета5 и лечение различных расстройств сна6. Из-за множества преимуществ для здоровья, связанных с метаболитами растения каннабис, существует растущий спрос на его коммерческое производство7. Чтобы удовлетворить этот спрос, методы выращивания постоянно совершенствуются и изобретаются заново, чтобы постоянно поставлять последовательный, высококачественный растительный материал для развивающейся индустрии каннабиса.
Размножение каннабиса может быть облегчено двумя способами: половым или бесполым размножением. Примером полового размножения является опыление женской яйцеклетки пыльцой из тычинки самца, в результате чего получается семя, которое может прорастать. Прорастание семян является надежным методом выращивания, который использовался для целей селекции и культивирования, где желательные фенотипические признаки выбираются в родительских линиях для улучшения качества потомства растений каннабиса, включая такие черты, как засухоустойчивость, устойчивость к насекомым, повышение урожайности и повышение потенции8 . Однако непреднамеренное перекрестное опыление является неотъемлемым риском при выполнении полового размножения, вызывая нежелательное потомство, что приводит к потенциальной потере желательных признаков или введению нежелательных признаков. Примером этого непреднамеренного опыления являются производители конопли, получающие семена конопли, опыляемые пыльцой, производящей ТГК, что приводит к значительным экономическим потерям из-за несоответствующих растений (>0,3% общего содержания ТГК по весу)9. Кроме того, чтобы создать культуру, состоящую только из самок, необходимо посеять феминизированное семя вместо нефеминизированного семени, что может привести к гермафродитизму и другим нежелательным признакам, приводящим к экономическим потерям. Чтобы преодолеть ограничение полового размножения каннабиса, бесполое размножение широко практикуется в коммерческих моделях производства индустрии каннабиса10.
Бесполое размножение каннабиса требует только одного растения, что позволяет размножаться на один генотип, что позволяет производить коммерческие растения, несущие желаемые агрономические и фармацевтические признаки. Распространенной формой бесполого размножения каннабиса является вырезание и вставка небольших частей женского растения в беспочвенный субстрат11 , который покрыт куполом влажности, чтобы вызвать образование корней. Хотя этот метод оказался успешным, общим недостатком является накопление высокого уровня влажности (обычно 80% или выше) внутри купола, обеспечивая идеальную среду роста для грибковых патогенов, которые могут быть вредными для новых, чувствительных черенков. Другой формой бесполого размножения является микроразмножение с использованием культуры тканей, где стерильные методы позволяют размножать растительный материал каннабиса без насекомых, микробов и вирусов в ограниченном пространстве12. Этот процесс, однако, является дорогостоящим, трудоемким и требует подготовки лаборантов, которые, как правило, недоступны для крупномасштабных объектов каннабиса .
Существует очень мало опубликованных отчетов об исследованиях по клональному размножению каннабиса. Чтобы обеспечить основу для понимания бесполого размножения каннабиса в исследовательских целях и промышленном производстве, это исследование было направлено на демонстрацию простоты и доступности использования аэропонных систем для клонального распространения каннабиса. Аэропонные системы идеально подходят для бесполого размножения каннабиса, последовательно поставляя богатую питательными веществами воду черенкам, своевременно вызывая раннее корнеобразование и позволяя поддерживать растение бесконечно, если это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация материнского растения для клонального размножения
- Выберите здоровое женское материнское растение, которое проявляет желательные морфологические и химические характеристики, характерные для его предполагаемого использования.
- Дайте материнскому растению достичь соответствующего размера (примерно 25 зрелых побегов) для клонального размножения (т.е. черенков).
- Позвольте материнским растениям оставаться в вегетативной стадии роста (светлый: темнота = 18 ч: 6 ч), чтобы способствовать росту побегов для будущего размножения.
2. Конструирование и подготовка аэропонной системы
- Начните с размещения крышки поверх контейнера (38,1 см x 25,4 см x 30,48 см). Просверлите нужное количество отверстий в крышке, обеспечивая при этом достаточное пространство (предпочтительно 3 см) между ними.
- Расположите водяной насос (Таблицу материалов) в центре контейнера.
- Налейте 7-8 л дистиллированной воды в емкость так, чтобы сопло насоса оставалось примерно на 2,5 см выше ватерлинии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что погружной водяной насос (Таблица материалов) способен толкать воду с достаточным усилием, чтобы распространиться по крышке контейнера. Рекомендуется дистиллированная вода; тем не менее, обычная водопроводная вода также может быть использована. - Поместите соответствующее количество кубиков минеральной ваты (3,81 см) (Таблица материалов) или кубиков носителей по выбору в каждый слот. Включите насос и дайте ему работать в течение 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кубики минеральной ваты предпочтительны из-за их способности «закреплять» на недавно укоренившихся черенках, которые помогают поддерживать растения в вертикальном положении после пересадки.
3. Отбор и вырезание соответствующих побегов
- Собирайте побеги возле апикальной меристемы с помощью стерилизованного скальпеля или ножниц. Черенки имеют длину ~10 см, в идеале с несколькими узлами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрежьте стебель под углом 45°. Резка под углом 45° увеличивает площадь поверхности базальной части черенка, предоставляя больше пространства для развития корней. Необязательно сделать небольшую щель (1-2 см) в середине разреза на 45° для дальнейшего увеличения площади поверхности. - Удалите всю листву, кроме листвы, присутствующей на трех верхних узлах.
- Окуните вновь иссеченный черенок в раствор для укоренения, содержащий индол-3-масляную кислоту (IBA) (Таблица материалов) ~2-5 см вверх от основания стебля на ~5 с.
- Вставьте разрез в центр куба Rockwool, расположенного в аэропонной системе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина режущей вставки должна оставаться ~1-2 см от дна куба Rockwool. - Опрыскивайте неукорененные черенки раствором питательного тумана (Таблица материалов) каждые 3 дня.
- Выращивают черенки с 18-24 ч света в сутки с плотностью потока фотонов фотосинтеза (PPFD) 100 мкмоль/м2/с при 24-29 °C и относительной влажности 40-60%.
4. Обслуживание аэропонной системы и здоровье пропагулы
- Пополняйте систему водой при рН между 5,0-6,0 каждые 2-5 дней.
- Слегка опыляйте черенки (по одному туману на черенок) раствором питательного тумана (Таблица материалов) каждые 3 дня.
- Добавляйте 5 мл каждого питательного раствора (таблица материалов) в резервуар каждые 3-5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление питательных веществ приводит к тому, что вода становится коричневой и мутной. - Добавляйте 15 мл раствора для очистки водорослей и бактерий, содержащего хлорноватистую кислоту (0,028%), на 10 л воды каждые 5 дней (Таблица материалов).
5. Пересадка пропагул
- Выбирайте черенки с длинными, белыми, волокнистыми корнями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте черенков с коричневой, слизистой и короткой корневой системой, так как это является показателем наличия корневой гнили и обычно занимает больше времени для акклиматизации к новой питательной среде и может принести нежелательные заболевания. - Осторожно вытесните куб Rockwool из системы и распутайте корни.
- Пересадите пропагулы каннабиса в детский горшок объемом 4 л, наполненный питательной почвенной смесью (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленно поливать, чтобы предотвратить высыхание корней.
6. Очистка и хранение аэропонной системы
- Когда система больше не используется, промойте водой и очистите 70% этанолом или другим дезинфицирующим средством.
- Снимите фильтр с водяного насоса и промойте водой, чтобы удалить мусор.
- Высушите систему, протерев ее бумажными полотенцами или мочалкой.
- Поместите насос внутрь ванны с крышкой и храните его до тех пор, пока он не понадобится.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проверить эффективность описанной аэропонной системы, в общей сложности 10 и 12 здоровых побегов длиной 14 см были вырезаны из материнских растений, «Вишневое вино» и «Красный робин», соответственно (рисунок 1A, B). После погружения в индукционные среды укоренения клоны помещали в систему (рисунок 2А). Конструкция и эксплуатация аэропонной системы показаны в виде принципиальной схемы на рисунке 2А.
После 2 дней акклиматизации все клоны начали развивать корни через 3-7 дней и полностью развили корни длиной 37 см через 10-14 дней на системе, чего было достаточно для посадки в заполненный почвой горшок (рисунок 2B,D). На рисунке 3 показана средняя длина побегов и корней каждой разновидности. Длина побега и длина корней измерялись перед переносом в почву. Средняя длина побегов и корней составляла 24,8 см ± 2,4 см и 37,8 см ± 2,5 см для «Вишневого вина» и 21,4 см ± 2,1 см и 39,7 см ± 5,9 см для «Красного Робина» соответственно (рисунок 3A, B). Различия между двумя разновидностями были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA, за которым последовал тест туки на множественное сострадание, не показавший существенных различий в длине побегов и корней между двумя сортами (n = 10-12, p < 0,05).
Рисунок 1: Здоровое материнское растение, которое генерирует несколько побегов для клонального размножения. (A) Зрелые материнские растения, «Cherry Wine» (спереди) и «Red Robin» (сзади) на ~ 4 месяца вегетативного роста, демонстрируя многочисленные побеги, идеально подходящие для размножения. (B) Приблизительная длина (14 см) для надлежащего обрезания побегов для клонирования каннабиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Создание аэропонной системы для клонального распространения каннабиса. (A) Принципиальная схема, иллюстрирующая компоненты аэропонной системы (38,1 см x 25,4 см x 30,48 см). (B) Аэропонная система полностью занята клонами "Cherry Wine". (C) Внутри аэропонной системы с клонами, демонстрирующими рост корней. (D) Здоровый рост корней в кубике Rockwool после 10 дней в аэропонной системе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение длины побега и корня для «Вишневого вина» и «Красного Робина» после 10 дней в системе аэропонного клонирования. А) гистограмма и таблица В, отражающие длину побега и корня двух сортов конопли. Различия в длине побега / корня между двумя сортами были проанализированы с помощью двусторонней ANOVA, за которой последовал тест туки с несколькими сравнениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С ростом спроса на растения каннабиса с постоянным содержанием каннабиноидов, различные методы клонального размножения были использованы в индустрии каннабиса . Бесполое размножение показывает несколько преимуществ перед сексуальными методами для крупномасштабного, последовательного производства. Аэропонная система распространения представляет собой модифицированную версию гидропонной системы, которая использует аэрированный богатый питательными веществами водяной туман для обеспечения быстрого развития корней. Описанная аэропонная система состоит из трех критических этапов: 1) генерация здорового женского «материнского» растения каннабиса в качестве генетического источника желаемого физического/химического признака, 2) вырезание побегов (апикальные меристемы) и обработка корневой индукционной средой, содержащей предшественник ауксина, IBA, и 3) акклиматизация пропагулы в желаемом питомнике.
Аэропонная система распространения позволяет эффективно производить клоны конопли с явными преимуществами перед различными методами распространения. Это включает в себя 1) экономию времени и средств за счет менее трудоемкого здорового, зрелого корнеобразования уже через 5 дней; 2) генетическая однородность - позволяющая производить генетически идентичные клоны, исключая любые генетические вариации, для размещения воспроизводимых исследований каннабиса и промышленных применений; 3) единообразие в крупномасштабных операциях; и 4) меньшая уязвимость к микробным патогенам - поддержание относительно низкого уровня влажности в верхнем пологе растений, чем уровень влажности, встроенный внутри контейнера, где происходит развитие корней.
Хотя аэропонная система предлагает ряд преимуществ, существует несколько ограничений, которые следует тщательно учитывать во время практики. Во-первых, поскольку все питательные вещества обеспечиваются гидропонным способом, он может быть легко загрязнен водорослевыми, грибковыми и вирусными (например, латентным вироидом хмеля) патогенами, что приводит к пороку развития корневой системы, которая смягчается путем регулярного лечения антимикробным / грибковым / вирусным агентом (агентами). Во-вторых, широкое использование растения-одиночки может быть проблематичным для производственных объектов. Наличие одной линии клонирования генотипа в качестве единственного растения в производственной модели приводит к риску полной потери урожая, если этот генотип восприимчив к данному вредителю или патогену, который присутствует на этом объекте культивирования; таким образом, рекомендуется поддерживать несколько материнских растений из различных линий, которые используются для размножения производственных клонов с помощью этой системы аэропонного клонирования, чтобы ограничить экономические потери от любого данного вредителя или патогена13. Рекомендуется только вегетативно выращивать материнское растение в течение не более 6 месяцев, прежде чем клонировать новое материнское растение, чтобы использовать его в качестве будущего источника для производственных клонов. Это предотвращает заросшие корни, которые могут привести к нездоровым материнским растениям и снижению показателей успеха клонирования, а также заросшие навесы, которые могут содержать вредителей и патогены, которые могут передаваться размножающимся клонам.
Аэропонная система является промышленно масштабируемой экономически эффективным способом. На рисунке 1 показано, что по меньшей мере 20 растительных материалов могут быть размещены в одном контейнере (38,1 см х 25,4 см х 30,48 см). Система может быть легко масштабирована, чтобы вместить более 50 растений на единицу без увеличения затрат на воду, питательные вещества и электричество. Описанные здесь преимущества нынешнего метода дают основание для внедрения системы аэропонного клонирования в отрасли промышленности и исследовательских лабораториях для эффективного по времени и равномерного распространения каннабиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Институтом исследований каннабиса при Университете штата Колорадо-Пуэбло и Министерством науки и ИКТ (2021-DD-UP-0379) и городом Чхунчхон (Hemp R & D и индустриализация, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
