Summary
Bu protokol, aeroponik sistemler uygulayarak Esrar sativa L.'nin klonal yayılımı için eğitici bilgiler sağlamak üzere tasarlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, Esrar cinsinde arzu edilen morfolojik ve kimyasal özellikleri başarıyla çoğaltmak için gerekli tüm malzemeleri ve protokolleri içerir.
Abstract
Bu protokol, aeroponik sistemler kullanılarak kenevirin verimli bir klonal yayılma tekniğinin standardizasyonunu açıklar. Birincil sürgün kesimleri, 'ana bitki' olarak hizmet veren "Cherry Wine" ve "Red Robin" (17-20% w/ w CBD) adlı iki kenevir çeşidinden çıkarıldı. Sisteme yerleştirilmeden önce eksizyon kesimlerinin bazal kısmında kök gelişimini teşvik etmek için bir yardımcı öncül (indole-3-bütirik asit) uygulandı. Çözelti azot, fosfor ve potasyum da dahil olmak üzere temel makro besin maddelerini içerdiğinden, kesimler her üç günde bir besin buharı çözeltisi ile hafifçe buğulandı. Aeroponik sistem su rezervuarı 5.0-6.0 arasında pH aralığını ve 20-22 °C arasında bir su sıcaklığını korudu. Kesimlere su ulaştırmak için dalgıç su pompası kullanıldı. Sürgün ucu kesimleri, kök gelişimi gerçekleşene kadar 10 gün boyunca günde 24 saat ışıkla sağlandı ve köklenmiş kesimler araştırma amacıyla nakledildi. Bu aeroponik sistemlerin Esrar yayılımı için arzu edilen sonuçlar ürettiği kanıtlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, Esrarın aseksüel yayılması için daha verimli bir araç sağlamak için geleneksel yöntemlerden kaynaklanan potansiyel zaman kısıtlamalarını hafifletir.
Introduction
Esrar sativa L. Cannabaceae familyasında sınıflandırılan yıllık, dioecious, çiçekli bir bitkidir. Ağırlıklı olarak kadın çiçeklenmeleri üzerindeki bract dokuların dış epidermal tabakasında bulunan glandüler trikomlar içinde üretilen kannabinoidler1, öncelikle giderek tanınan tıbbi özellikleri nedeniyle giderek daha popüler bir araştırma konusu haline gelmektedir. Kannabidiol (CBD), Esrar'da Δ9-tetrahidrokannabinolden (THC) sonra bulunan ikinci en belirgin kannabinoiddir ve analjezik özellikler2, anti-nöbet özellikleri3, antidepresan özellikleri4, diyabet riskini azaltmak5 ve çeşitli uyku bozukluklarını tedavi etmek dahil olmak üzere bir dizi tıbbi faydaya atfedilir6. Esrar bitkisinin metabolitleri ile ilişkili sağlık yararlarının çokluğu nedeniyle, ticari ölçekli üretimine artan bir talep var7. Bu talebi karşılamak için, gelişmekte olan Kenevir endüstrisine sürekli tutarlı, yüksek kaliteli bitki materyali tedarik etmek için yetiştirme yöntemleri sürekli olarak geliştirilmekte ve yeniden icat edilmektedir.
Esrarın yayılması iki şekilde kolaylaştırılabilir: cinsel veya aseksüel üreme. Cinsel üremeye bir örnek, bir erkeğin stameninden polen içeren bir dişi ovül tozlaşmasıdır ve bu da çimlenebilen bir tohumla sonuçlanır. Tohum çimlenmesi, kuraklık toleransı, böcek direnci, artan verim ve artan potens gibi özellikler de dahil olmak üzere, yavruların kalitesini artırmak için ebeveyn hatlarında arzu edilen fenotipik özelliklerin seçildiği üreme ve yetiştirme amacıyla kullanılan güvenilir bir yetiştirme yöntemidir8 . Bununla birlikte, istenmeyen çapraz tozlaşma, cinsel üreme yaparken doğal bir risktir, istenmeyen yavrulara neden olarak, arzu edilen özelliklerin potansiyel kaybına veya istenmeyen özelliklerin tanıtılmasına neden olan. Bu istenmeyen tozlaşmanın bir örneği, THC üreten polenlerle tozlaşmış kenevir tohumu alan kenevir yetiştiricileri tarafından vurgulanır ve bu da uyumsuz bitkiler nedeniyle önemli ekonomik kayba neden olur (>0.3% toplam THC w/ w)9. Ek olarak, sadece dişilerden oluşan bir ürün üretmek için, kadınsı olmayan bir tohum yerine kadınsı bir tohum ekilmelidir, bu da hermafroditme ve ekonomik kayba yol açan diğer istenmeyen özelliklere yol açabilir. Esrarın cinsel üreme sınırlamasının üstesinden gelmek için, aseksüel üreme Esrar endüstrisinin ticari üretim modellerinde yaygın olarak uygulanmıştır10.
Esrarın aseksüel üremesi, arzu edilen agronomik ve farmasötik özellikler taşıyan bitkilerin ticari üretimine izin veren tek bir genotipin çoğalması için sadece tek bir bitki gerektirir. Aseksüel Esrar üremesinin yaygın bir şekli, kök oluşumunu teşvik etmek için bir nem kubbesi ile kaplı topraksız bir substrat11'e dişi bir bitkinin küçük kısımlarını kesmek ve eklemektir. Bu yöntemin başarılı olduğu kanıtlansa da, yaygın bir dezavantaj, kubbenin içinde yüksek düzeyde nem (genellikle% 80 veya daha yüksek) birikmesidir ve mantar patojenleri için yeni, hassas kesimlere zarar verebilen ideal bir büyüme ortamı sağlar. Aseksüel yayılmanın bir başka şekli, steril tekniklerin sınırlı alanda böcek, mikrop ve virüs içermeyen Esrar bitki materyalinin yayılmasına izin verdiği doku kültürü kullanılarak mikropropagasyondur12. Bununla birlikte, bu işlem pahalı, zaman alıcıdır ve genellikle büyük ölçekli Esrar tesisleri için erişilemeyen eğitimli laboratuvar teknisyenleri gerektirir.
Esrarın klonal yayılımı hakkında çok az yayınlanmış araştırma raporu bulunmaktadır. Araştırma amacıyla ve endüstriyel üretim için Esrarın aseksüel üremesinin anlaşılmasına zemin oluşturmak amacıyla, bu çalışma Esrarın klonal yayılımı için aeroponik sistemlerin kullanım kolaylığını ve erişilebilirliğini göstermeyi amaçlamıştır. Aeroponik sistemler, Esrarın aseksüel olarak yayılması, kesimlere sürekli olarak besin bakımından zengin su sağlanması, erken kök oluşumunun zamanında teşvik edilmesi ve gerekirse bir bitkinin süresiz olarak muhafaza edilmesine izin verilmesi için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonal yayılma için bir ana bitkinin üretimi
- Kullanım amacına özgü arzu edilen morfolojik ve kimyasal özellikler gösteren sağlıklı, dişi bir anne bitkisi seçin.
- Ana bitkinin klonal yayılma (yani kesimler) için uygun boyuta (kabaca 25 olgun sürgün) ulaşmasına izin verin.
- Gelecekteki yayılma için sürgün büyümesini teşvik etmek için ana bitkilerin vejetatif büyüme aşamasında (ışık: karanlık = 18 saat: 6 saat) kalmasına izin verin.
2. Aeroponik sistemin inşası ve hazırlanması
- Kapağı kabın üzerine (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm) yerleştirip başlayın. Her biri arasında yeterli alan (tercihen 3 cm) sağlarken istenen sayıda deliği kapağın içine delin.
- Su pompasını (Malzeme Masası) kabın ortasına yerleştirin.
- Pompa nozülün su hattından yaklaşık 2,5 cm yukarıda kalması için kabın içine 7-8 L damıtılmış su dökün.
NOT: Bu, dalgıç su pompasının (Malzeme Masası) suyu kap kapağına yayılacak kadar kuvvetle itebilmesini sağlar. Damıtılmış su önerilir; bununla birlikte, düzenli musluk suyu da kullanılabilir. - Her yuvaya uygun miktarda Rockwool küpü (3,81 cm) (Malzeme Masası) veya medya küpleri yer alın. Pompayı açın ve 24 saat çalışmasına izin verin.
NOT: Taşyünü küpleri, ekimden sonra bitkileri dik tutmaya yardımcı olan yeni köklü kesimlerde "ankraj" yetenekleri nedeniyle tercih edilir.
3. Uygun sürgünlerin seçilmesi ve çıkarılması
- Sterilize edilmiş bir neşter veya makas kullanarak apikal meristemin yakınındaki sürgünleri toplayın. Kesimler ~ 10 cm uzunluğundadır, ideal olarak birkaç düğümle.
NOT: Gövdeyi 45° açıyla kesin. 45° açıyla kesim, kesimin bazal kısmının yüzey alanını artırarak kök gelişimi için daha fazla alan sağlar. Yüzey alanını daha da artırmak için 45° kesimin ortasında küçük bir yarık (1-2 cm) yapmak isteğe bağlıdır. - İlk üç düğümde bulunan yapraklar hariç tüm yaprakları çıkarın.
- Yeni eksilen kesimi, hint-3-bütirik asit (IBA) (Malzeme Tablası) içeren köklenme çözeltisine ~5 s için gövdenin tabanından ~2-5 cm yukarı daldırın.
- Kesimi aeroponik sisteme yerleştirilmiş bir Rockwool küpünün ortasına yerleştirin.
NOT: Kesme ekleme derinliği, Rockwool küpünün altından ~1-2 cm uzakta kalacaktır. - Köksüz kesimleri her 3 günde bir besin buğusu çözeltisi (Malzeme Masası) ile püskürtün.
- Kesimleri günde 18-24 saat ışıkla, 24-29 °C'de 100 μmol/m2/s fotonitetik foton akı yoğunluğu (PPFD) ve % 40-60 bağıl nem ile büyütün.
4. Aeroponik sistem bakımı ve propagule sağlığı
- Sistemi her 2-5 günde bir 5,0- 6,0 arasında bir pH'da suyla doldurun.
- Kesimleri (kesim başına bir sis) her 3 günde bir besin sisi çözeltisi (Malzeme Masası) ile hafifçe buğulayın.
- Her besin çözeltisinin (Malzeme Tablosu) 5 mL'yi her 3-5 günde bir rezervuara ekleyin.
NOT: Besin ilavesi suyun kahverengi ve bulanık olmasına neden olur. - Her 5 günde bir 10 L su başına hipokloröz asit (%0,028) içeren alg ve bakteri temizleme çözeltisinin 15 mL'sini ekleyin (Malzeme Tablosu).
5. Propagüllerin nakledilme
- Uzun, beyaz, lifli kökleri olan kesimleri seçin.
NOT: Kök çürüklüğü varlığı için bir gösterge olduğu ve genellikle yeni büyüyen ortama alışması daha uzun süreceği ve istenmeyen hastalıkları beraberinde getirebileceği için kahverengi, sümüklü ve kısa kök sistemleri ile kesimlerden kaçının. - Rockwool küpünü sistemden dikkatlice sökün ve kökleri çözün.
- Esrar profillerini besleyici bir toprak karışımı (Malzeme Masası) ile dolu 4 L fidanlık kabına nakledin.
NOT: Köklerin kurumasını önlemek için hemen sulama yapılması önerilir.
6. Aeroponik sistemin temizlenmesi ve depolanmasının
- Sistem artık kullanılmadığında, suyla yıkayın ve% 70 etanol veya başka bir dezenfektanla temizleyin.
- Filtreyi su pompasından çıkarın ve döküntüleri gidermek için suyla durulayın.
- Sistemi kağıt havlu veya bezle silerek kurulayın.
- Pompayı kapağı açık küvetin içine yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan aeroponik sistemin verimliliğini doğrulamak için, ana bitkilerden sırasıyla 'Cherry Wine' ve 'Red Robin' olmak üzere toplam 10 ve 12 sağlıklı 14 cm uzunluğunda sürgünler çıkarıldı (Şekil 1A,B). Köklendirme indüksiyon ortamına daldıktan sonra klonlar sisteme yerleştirildi (Şekil 2A). Bir aeroponik sistemin inşası ve çalışması Şekil 2A'da şematik bir diyagram olarak gösterilmiştir.
2 günlük alışmadan sonra, tüm klonlar 3-7 gün içinde kök geliştirmeye başladı ve toprak dolu bir tencereye ekilmesi yeterli olan sistemde 10-14 gün sonra 37 cm uzunluğunda tamamen gelişmiş kökler (Şekil 2B,D). Şekil 3, her çeşidin ortalama sürgün ve kök uzunluğunu gösterir. Sürgün uzunluğu ve kök uzunluğu toprağa aktarılamadan önce ölçüldü. Ortalama sürgün ve kök uzunluğu sırasıyla 24,8 cm ± 2,4 cm ve 37,8 cm ± 'Vişne Şarabı' için 2,5 cm ve 21,4 cm ± 2,1 cm ve 'Red Robin' için 5,9 cm ± 39,7 cm olarak gerçekleşmiştir (Şekil 3A,B). İki çeşit arasındaki farklar iki yönlü ANOVA ile analiz edildi, ardından Tukey'in çoklu şefkat testi, iki çeşit arasındaki sürgün ve kök uzunluklarında önemli bir fark göstermiyor (n = 10-12, s < 0.05).
Şekil 1: Klonal yayılma için birden fazla sürgün üreten sağlıklı bir anne bitki. (A) Olgun anne bitkileri, "Cherry Wine" (ön) ve "Red Robin" (arka) ~4 aylık bitkisel büyümede, yayılma için ideal olan çok sayıda sürgün sergiler. (B) Esrar klonlamak için uygun sürgün eksizyonu için yaklaşık uzunluk (14 cm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Esrar klonal yayılımı için aeroponik sistemin kurulması. (A) Aeroponik sistemin bileşenlerini gösteren şematik diyagram (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Aeroponik sistem tamamen "Cherry Wine" klonları tarafından işgal edilir. (C) Kök büyümesi sergileyen klonlarla aeroponik sistemin içinde. (D) Aeroponik sistemde 10 gün sonra Rockwool küpünde sağlıklı kök büyümesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aeroponik klonlama sisteminde 10 gün sonra "Kiraz Şarabı" ve "Red Robin" için sürgün ve kök uzunluğu ölçümleri. (A) İki kenevir çeşidindeki sürgün ve kök uzunluğunu temsil eden bir çubuk grafik ve (B) tablosu. İki çeşit arasındaki sürgün/kök uzunluklarındaki farklar iki yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tutarlı kannabinoid içeriğine sahip Esrar bitkilerine artan taleple birlikte, Esrar endüstrisinde çeşitli klonal yayılma yöntemleri istismar edilmiştir. Aseksüel yayılma, büyük ölçekli, tutarlı üretim için cinsel yöntemlere göre çeşitli avantajlar göstermektedir. Aeroponik yayılma sistemi, hızlı kök gelişimi sağlamak için havalandırılmış besin bakımından zengin bir su sisi kullanan bir hidroponik sistemin değiştirilmiş bir versiyonudur. Tanımlanan aeroponik sistem üç kritik adımdan oluşur, 1) istenen fiziksel / kimyasal özellik için genetik bir kaynak olarak sağlıklı bir dişi Esrar 'anne' bitkisi üretmek, 2) sürgünleri kesmek (apikal meristemler) ve yardımcı öncül, IBA ve 3) propagulün istenen fidanlık potasına alışmasını içeren kök indüksiyon ortamı ile tedavi etmek.
Aeroponik yayılma sistemi, farklı yayılma yöntemlerine göre net avantajlara sahip kenevir klonlarının verimli bir şekilde üretilmesine izin sağlar. 1) 5 gün gibi kısa bir sürede daha az işgücü uyandıran sağlıklı, olgun kök oluşumu ile zaman ve maliyet tasarrufu içerir; 2) genetik homojenlik - tekrarlanabilir Esrar araştırma ve endüstri uygulamalarını barındırmak için herhangi bir genetik varyasyon hariç, genetik olarak aynı klonların üretilmesine izin vermek; 3) büyük ölçekli operasyonlarda tekdüzelik; ve 4) mikrobiyal patojenlere karşı daha az kırılganlık - bitkilerin üst gölgeliklerinde kök gelişiminin meydana geldiği kabın içinde inşa edilen nem seviyesinden nispeten düşük bir nem seviyesini korumak.
Aeroponik sistem bir dizi avantaj sunsa da, uygulamalar sırasında dikkatlice ele alınması gereken birkaç sınırlama sunulmaktadır. İlk olarak, tüm besinler hidroponik olarak sağlandığı için, anti-mikrobiyal / mantar / viral ajanların düzenli tedavisi ile hafifletilen kök sisteminin malformasyonuna yol açan alg, mantar ve viral (örneğin, hop latent viroid) patojenleri ile kolayca kontamine olabilir. İkincisi, tek bir ana tesisin yaygın kullanımı üretim tesisleri için sorunlu olabilir. Bir üretim modelinde tek bitki olarak tek bir genotip klon hattına sahip olmak, bu genotipin o yetiştirme tesisinde bulunan belirli bir zararlıya veya patojene duyarlı olması durumunda tüm mahsul kaybı riskine yol açar; bu nedenle, herhangi bir haşere veya patojenden ekonomik kaybı sınırlamak için bu aeroponik klonlama sistemi ile üretim klonlarını yaymak için kullanılan çeşitli soylardan birden fazla ana bitkinin korunması önerilir13. Üretim klonları için gelecekteki kaynak olarak kullanmak üzere yeni bir ana bitkiyi klonlamadan önce sadece 6 aydan fazla bir süre boyunca bitkisel olarak bir ana bitki yetiştirmeniz önerilir. Bu, sağlıksız ana bitkilere ve daha düşük klonlama başarı oranlarına yol açabilecek aşırı büyümüş köklerin yanı sıra, yayılan klonlara bulaşabilecek zararlıları ve patojenleri barındırabilecek aşırı büyümüş kanopileri önler.
Aeroponik sistem endüstriyel olarak uygun maliyetli bir şekilde ölçeklenebilir. Şekil 1 , en az 20 bitki materyalin tek bir kapta (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm) barındırılabileceğini göstermektedir. Sistem, su, besin ve elektrik maliyetlerini artırmadan birim başına 50'den fazla tesisi tutacak şekilde kolayca ölçeklendirilebilir. Mevcut yöntem için burada açıklanan avantajlar, esrarın zaman verimli ve düzgün yayılması için aeroponik klonlama sistemini endüstri uygulamalarına ve araştırma laboratuvarlarına uygulamak için bir neden sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo'daki Esrar Araştırma Enstitüsü ve Bilim ve Bİt Bakanlığı (2021-DD-UP-0379) ve Chuncheon şehri (Kenevir Ar-Ge ve sanayileşme, 2020-2021) tarafından desteklendi, yazarlar ayrıca "Kiraz Şarabı" tohumları için cömert bağış için Summit CBD'de Justin Henderson'a teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
