Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/63155
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,4, 5, 1, 1,3, 1,3,4
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Summary

Bakterier utsöndrar nanometerstora extracellulära vesiklar (EV) som bär bioaktiva biologiska molekyler. EV-forskning fokuserar på att förstå deras biogenes, roll i mikrob-mikrob- och värd-mikrobinteraktioner och sjukdomar, liksom deras potentiella terapeutiska tillämpningar. Ett arbetsflöde för skalbar isolering av elbilar från olika bakterier presenteras för att underlätta standardisering av EV-forskning.

Abstract

Olika bakteriearter utsöndrar ~ 20-300 nm extracellulära vesiklar (EV), bestående av lipider, proteiner, nukleinsyror, glykaner och andra molekyler härledda från föräldracellerna. Elbilar fungerar som kommunikationsvektorer inom och mellan arter samtidigt som de bidrar till interaktionen mellan bakterier och värdorganismer i samband med infektion och kolonisering. Med tanke på de många funktioner som tillskrivs elbilar inom hälsa och sjukdom finns det ett växande intresse för att isolera elbilar för in vitro - och in vivo-studier . Det antogs att separationen av elbilar baserat på fysikaliska egenskaper, nämligen storlek, skulle underlätta isoleringen av vesiklar från olika bakteriekulturer.

Isoleringsarbetsflödet består av centrifugering, filtrering, ultrafiltrering och storleksuteslutningskromatografi (SEC) för isolering av elbilar från bakteriekulturer. Ett pumpdrivet tangentiellt flödesfiltreringssteg (TFF) införlivades för att förbättra skalbarheten, vilket möjliggör isolering av material från liter startcellodling. Escherichia coli användes som ett modellsystem som uttrycker EV-associerat nanoluciferas och icke-EV-associerat mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferaset riktades mot elbilarna genom att smälta samman dess N-ändstation med cytolysin A. Tidiga kromatografifraktioner innehållande 20-100 nm elbilar med associerat cytolysin A-nanoLuc skilde sig från de senare fraktionerna innehållande de fria proteinerna. Förekomsten av EV-associerat nanoluciferas bekräftades genom immunogoldmärkning och transmissionselektronmikroskopi. Detta EV-isoleringsarbetsflöde är tillämpligt på andra mänskliga tarmassocierade gramnegativa och grampositiva bakteriearter. Sammanfattningsvis, genom att kombinera centrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF och SEC möjliggör skalbar isolering av elbilar från olika bakteriearter. Att använda ett standardiserat isoleringsarbetsflöde kommer att underlätta jämförande studier av mikrobiella elbilar över arter.

Introduction

Extracellulära vesiklar (EV) är nanometerstora, liposomliknande strukturer som består av lipider, proteiner, glykaner och nukleinsyror, utsöndrade av både prokaryota och eukaryota celler1. Sedan de tidiga studierna som visualiserar frisättningen av elbilar från gramnegativa bakterier2 har antalet biologiska funktioner som tillskrivs bakteriella elbilar (20-300 nm i diameter) ständigt ökat under de senaste decennierna. Deras funktioner inkluderar överföring av antibiotikaresistens3, biofilmbildning4, kvorumavkänning5 och toxinleverans6. Det finns också ett växande intresse för användningen av bakteriella elbilar som terapier, särskilt inom vaccinologi7 och cancerterapi8.

Trots det växande intresset för EV-forskning finns det fortfarande tekniska utmaningar när det gäller metoder för isolering. Specifikt finns det ett behov av isoleringsmetoder som är reproducerbara, skalbara och kompatibla med olika EV-producerande organismer. För att skapa en enhetlig uppsättning principer för planering och rapportering av EV-isolering och forskningsmetoder publicerar och uppdaterar International Society for Extracellular Vesicles MISEV-positionsdokumentet9. Dessutom tillhandahåller EV-TRACK-konsortiet en öppen plattform för rapportering av detaljerade metoder för ev-isolering som används i publicerade manuskript för att förbättra transparensen10.

I detta protokoll anpassades tidigare metoder som användes för isolering av elbilar från däggdjurscellodling11,12 för att möjliggöra isolering av elbilar från bakteriell cellodling. Vi försökte använda metoder som möjliggör EV-isolering från en mängd olika mikrober, som kan vara skalbara, och balansera EV-renhet och utbyte (som diskuteras i MISEV-positionsdokumentet9). Efter avlägsnande av bakterieceller och skräp genom centrifugering och filtrering koncentreras odlingsmediet antingen genom centrifugalanordningens ultrafiltrering (för en volym på upp till ~ 100 ml) eller pumpdriven TFF (för större volymer). Elbilar isoleras sedan av SEC med hjälp av kolumner optimerade för rening av små elbilar.

Figure 1
Bild 1: Schematisk översikt över arbetsflödet för bakteriell EV-isolering. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; TFF = tangentiell flödesfiltrering; SEC = storlek uteslutning kromatografi; MWCO = molekylviktsavgränsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En muskommensal stam av Escherichia coli (dvs. E. coli MP113) användes som modellorganism och modifierades för att uttrycka EV-associerat nanoluciferas genom fusion till cytolysin A, som tidigare rapporterats14. Metoderna som används här kan bearbeta åtminstone upp till flera liter bakteriekulturer och effektivt separera EV-associerade från icke-EV-associerade proteiner. Slutligen kan denna metod också användas för andra grampositiva och gramnegativa bakteriearter. Alla relevanta data från de rapporterade experimenten skickades till EV-TRACK:s kunskapsbas (EV-TRACK ID: EV210211)10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Se till att allt arbete som involverar bakterier och rekombinant DNA följer bästa praxis för biosäkerhetsinneslutning som är lämplig för biosäkerhetsrisknivån för varje stam. Arbetet bör utföras i enlighet med lokala, nationella och internationella biosäkerhetsbestämmelser.

1. Bakteriestammar och odlingsförhållanden

OBS: Bakteriestammar som används i denna studie var Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve, och Bifidobacterium dentium.

  1. För E. coli, använd en steril slinga för att inokulera enstaka kolonier till 250 till 1 000 ml Luria-Bertani (LB) buljong och inkubera aerobt i en skakningsinkubator vid 300 rpm och 37 °C i 48 timmar innan odlingen bearbetas. För rekombinant E. coli MP1-stam som hyser p114-mCherry-Clyluc (kompletterande metod och kompletterande figur S1), tillsätt kloramfenikol till LB-agar och buljong i en slutlig koncentration av 17 μg/ml.
  2. För A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve och B . dentium, streck på hjärnhjärtinfusion (BHI) agarplattor och inkubera anaerobt inuti en vinyl anaerob kammare. Inokulera enstaka kolonier i 100 ml förreducerad BHI-buljong och inkubera i 48 timmar anaerobt.

2. EV-isolering

  1. Klargörande bakterieodlingsmedium genom centrifugering och filtrering
    1. Överför bakteriecellkulturerna som inokulerats i steg 1 för att rengöra 250 ml eller 500 ml polypropencentrifugflaskor genom att hälla. Centrifugera flaskorna i en rotor med fast vinkel med stor kapacitet vid 4 °C och 5 000 × g i 15 minuter. Överför supernatanten till rena centrifugflaskor genom noggrann hällning och centrifugera igen vid 10 000 × g i 15 minuter.
      OBS: Återanvänd flaskorna efter biosäkerhetsanpassad rengöring och dekontaminering.
      1. Om stora pellets av bakterieceller är närvarande efter den andra centrifugeringen, upprepa centrifugeringen i en ren flaska för att ytterligare avlägsna celler.
    2. Överför supernatanten till en 0,22 μm polyetersulfon vakuumdriven filteranordning av lämplig storlek genom att hälla. Filtrera genom att ansluta filtreringsanordningen till en vakuumväggförsörjning. Om filtreringshastigheten sjunker avsevärt, flytta helt enkelt allt ofiltrerat material till en ny enhet. Förvara det filtrerade mediet vid 4 °C över natten och fortsätt protokollet följande dag om så önskas.
      OBS: Centrifugeringarna ovan tillåter vanligtvis bearbetning av ~ 2x den angivna volymen av cellodling genom varje enhet. Till exempel kan en enda 500 ml filterenhet filtrera ~ 1,000 ml förcentrifugerad kultur. Dessa enheter återanvänds vanligtvis inte. Användning av sprutfilter i detta steg rekommenderas inte utan optimering, eftersom betydande förluster noterades med de testade modellerna. Detta är en potentiell stopppunkt.
    3. Kontrollera att de livskraftiga cellerna avlägsnas fullständigt vid denna tidpunkt genom att sprida en alikvot av den filtrerade supernatanten på lämpliga agarplattor och säkerställa frånvaron av kolonier efter inkubation vid optimala förhållanden för bakteriestammen. Om bakterier upptäcks, optimera proceduren ytterligare ovan genom att utföra ytterligare centrifugeringar och / eller filtreringar.
  2. Koncentration av det filtrerade mediet
    1. Om du arbetar med volymer betydligt >100 ml, fortsätt till steg 2.2.2. Om du arbetar med volymer på ~ 100 ml, ladda 90 ml filtrerat odlingsmedium på behållaren med en respektive kapacitet 100 kDa molekylviktsavgränsning (MWCO) centrifugal ultrafiltreringsanordning med serologiska pipetter. Balansera alltid med en matchande ultrafiltreringsanordning och centrifugera i svängande skoprotor vid 4 °C och 2 000 × g i 15-30 minuters intervall, tills volymen på mediet i toppbehållaren har koncentrerats till <0,5 ml.
      1. Fyll på behållaren med eventuellt kvarvarande filtrerat odlingsmedium. Om du "fyller på" tar du bort genomströmningen i enhetens botten och balanserar om alla enheter.
        OBS: Det observerades att den maximala volymen av filtrerat odlingsmedium som kan koncentreras med användning av dessa enheter är <2-faldig den rekommenderade volymen.
      2. Om viskositeten hos det koncentrerade mediet i behållaren är synligt ökad (mörkt, visköst material), späd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och koncentrera om genom centrifugering för att späda ut alla icke-EV-proteiner som är mindre än MWCO på 100 kDa.
        OBS: Detta är en potentiell stopppunkt.
      3. Överför det koncentrerade mediet till ett rör med låg proteinbindning, förvara vid 4 °C över natten och fortsätt protokollet följande dag om så önskas.
    2. Om du arbetar med volymer betydligt >100 ml, välj en TFF-enhet av lämplig storlek (100 kDa MWCO) för att rymma volymen som ska bearbetas.
      OBS: Filtreringsanordningar för bearbetning av 100 ml till > 1,000 ml är kommersiellt tillgängliga. Lokal tillgänglighet, kostnad och kompatibilitet med pumpen och slangar/anslutningar kommer att diktera vilka specifika modeller som kommer att vara mest användbara. Upp till 2 L odlingsmedium bearbetades med den enhet som anges i materialförteckningen innan filtret behövde rengöras (se steg 2.3 nedan för rengöringsprotokollet).
      1. Montera en filtreringskrets med #16 lågbindande / låglakande slang, 1/8 tums slangstång till Luer-adaptrar, TFF-enheten och en peristaltisk pump, som anges i kompletterande figur S2.
        OBS: Utför TFF i ett biosäkerhetsskåp för att minimera risken för att förorena EV-preparatet med miljöbakterier.
      2. Vid rumstemperatur ska du börja cirkulera det filtrerade, konditionerade mediet vid ca 200 ml/min (minst 100 ml/min). Bestäm lämpligt varvtal som motsvarar den önskade flödeshastigheten genom att pumpa 200 ml PBS i ett graderat kärl. När du cirkulerar filtrerat, konditionerat medium, samla molekylerna <100 kDa som passerar ultrafiltreringsmembranet som avfall i ett separat kärl.
        OBS: Exemplet nedan kommer att anta en startvolym på 2 L kultur.
      3. Fortsätt att cirkulera det konditionerade mediet tills dess volym har reducerats till ~ 100-200 ml. Flytta till mindre fartyg efter behov. Späd 2 gånger med PBS och fortsätt att cirkulera med pumpen och koncentrera dig ner till 75-100 ml. Späd 2-faldigt med PBS och fortsätt att cirkulera till en slutlig volym på 25 ml. Späd 2 gånger med PBS och fortsätt att cirkulera tills <10 ml.
      4. Lyft ut matningsslangen ur provbehållaren och fortsätt att pumpa för att rensa filtret och återvinna den maximala mängden prov.
        OBS: Detta är en potentiell stopppunkt.
      5. Överför det koncentrerade provet till ett koniskt rör och förvara det över natten vid 4 °C om så önskas. Alternativt kan du fortsätta med protokollet.
      6. Flytta det koncentrerade provet till en 15 ml kapacitet 100 kDa MWCO centrifugal ultrafiltreringsanordning. Centrifugera i en svängande skoprotor vid 4 °C och 2 000 × g i 15–30 minuters intervall tills volymen av mediet i den övre behållaren har koncentrerats till <2 ml.
        OBS: Detta är en potentiell stopppunkt.
      7. Överför det koncentrerade mediet till ett lågproteinbindande rör och förvara vid 4 °C över natten och fortsätt protokollet följande dag om så önskas.
  3. Rengöring av TFF-enheten (tillval)
    OBS: Filtreringshastigheten minskar när TFF-enheten börjar "täppa till" under processen (nedsmutsning). Vid behov kan filteranordningen rengöras för att underlätta filtrering av ytterligare prover i samma reningskörning. Även om det teoretiskt möjligt har ett rengjort TFF-filter inte använts för en annan reningskörning för att undvika korskontaminering.
    1. För att rengöra, ta bort alla slangar och lock från TFF-enheten och töm eventuell kvarvarande vätska.
    2. Använd den peristaltiska pumpen och slangen för att översvämma både TFF-enhetens inre och yttre fack (dvs. via de parallella och vinkelräta portarna i modellen som anges i materialförteckningen) med ~ 100 ml destillerat vatten. Ta bort alla slangar/lock och töm TFF-enheten.
    3. Täck de yttre (vinkelräta, filtrat) portarna och cirkulera 250 ml 20% etanol i destillerat vatten vid >200 ml / min i 10 min genom det inre facket. Töm, översvämma med destillerat vatten och dränera igen som ovan.
    4. Cirkulera 250 ml 0,5 N färsk NaOH-lösning i 30 minuter genom det inre facket och töm igen.
    5. Anslut alla slangar och lock till inlopps-, utloppsportarna och filtrateportarna, som i kompletterande figur S2, och cirkulera 0,5 N NaOH-lösningen igen tills en volym NaOH > 1 ml/cm 2-filterytan tränger igenom filtermembranet och samlas upp som filtrat/avfall.
    6. Skölj TFF-enheten med destillerat vatten enligt ovan. Använd TFF-enheten omedelbart eller översvämma enheten med ~ 100 ml 20% etanol och förvara över natten vid 4 ° C.
      OBS: Om det förvaras i etanol, var noga med att tömma, skölja med vatten, dränera och cirkulera 250 ml PBS genom enheten tills en volym på >1 ml / cm2 filteryta tränger igenom filtermembranet och samlas upp som filtrat / avfall för att avlägsna kvarvarande etanol före provbearbetning.
  4. Storleksuteslutningskromatografi (SEC)
    OBS: SEC används för att öka renheten hos elbilar och ta bort icke-vesikulärt protein.
    1. Använd en liten SEC-kolonn (10 ml bäddvolym) för isolering av elbilar från <100 ml utgångsmaterial och en större kolonn (47 ml bäddvolym) för isolering av elbilar från >100 ml utgångsmaterial.
      I exemplet nedan visas volymer för den större kolumnen, med volymer för den mindre kolumnen inom parentes.
    2. Ta SEC-kolumnen och PBS till rumstemperatur under flera timmar. Stabilisera SEC-kolonnen i vertikalt läge med hjälp av ett standardlaboratoriumstativ och hållare. Alternativt kan du använda kommersiella kromatografikolonnstativ.
    3. Innan du ansluter till SEC-kolonnen, hydrera provbehållaren genom att låta 5 ml PBS strömma genom friten och in i en avfallsbehållare. Skruva loss inloppslocket på SEC-kolonnen, tillsätt 2 ml PBS till provbehållaren och anslut försiktigt behållaren till kolonnen när PBS droppar ut genom friten (gäller inte för små SEC-kolumner).
      OBS: Detta föregående steg förhindrar att luftbubblor fastnar högst upp i SEC-kolumnen. Om luft är instängd, ta bort behållaren, tryck på kolonnen för att få ut luftbubblan och upprepa anslutningsproceduren. För den mindre kolumnen tar du helt enkelt bort toppen av SEC-kolumnen och bifogar provbehållaren.
    4. Lägg till 47 ml (10 ml) PBS i provbehållaren och ta bort locket till botten av SEC-kolumnen. Låt all laddad provbuffert flöda genom kolumnen för jämvikt. Kasta genomströmningen.
    5. Ladda högst 2 ml (0,5 ml) prov på provbehållaren, kassera genomströmningen och låt provet komma in i kolonnen helt.
    6. Tillsätt omedelbart PBS till provbehållaren eller behållaren med en volym på 14,25 ml minus provvolymen (3 ml minus provvolymen, för den lilla kolonnen). Låt lösningen flöda genom kolonnen och kassera denna mängd som är lika med kolonnens tomrumsvolym.
      OBS: För ett typiskt 2 ml prov kommer mängden PBS som ska tillsättas till provbehållaren eller behållaren att vara 12,25 ml.
    7. Placera ett 2 ml lågbindande mikrorör direkt under SEC-kolonnen. Tillsätt omedelbart 2 ml (0,5 ml) PBS till provbehållaren och låt den komma in i kolumnen. Märk de första 2 ml (0,5 ml) genomströmningen som fraktion 1. Fortsätt att tillsätta 2 ml (0,5 ml) åt gången till provbehållaren för att samla upp varje efterföljande fraktion.
      OBS: De flesta bakteriella elbilar eluerar i de första 5 fraktionerna. Under optimeringen samlades de första 12 fraktionerna.
    8. Förvara fraktionerna vid 4 °C för kortvarig lagring (dagar) eller -80 °C för långtidsförvaring.
    9. Rengöring och lagring av de återanvändbara SEC-kolumnerna
      SEC-kolumnerna som beskrivs i detta protokoll kan återanvändas upp till 5 gånger enligt tillverkaren. Om flödeshastigheten för SEC-kolumnerna minskar efter användning av <5 rekommenderar tillverkaren att de koncentrerade proverna centrifugeras vid 10 000 x g i 10 minuter för att rensa eventuella aggregat före SEC. Ladda sedan supernatanten för denna centrifugering på SEC-kolumnen för EV-isolering.
      1. För att rengöra och lagra SEC-kolumnen efter varje användning, lägg till 2 ml (0,5 ml) på 0,5 M NaOH och låt den komma in i kolumnen helt. Kör 100 ml (20 ml) 20 % etanol genom kolonnen och förvara den vid 4 °C till nästa användning. Före nästa användning, balansera etanolen till rumstemperatur enligt ovan och byt ut den mot PBS-buffert genom att köra ytterligare 150 ml (30 ml) PBS genom kolonnen.
      2. För att rengöra och omedelbart återanvända SEC-kolumnen efter varje användning, lägg till 2 ml (0,5 ml) på 0,5 M NaOH och låt den komma in i kolumnen helt. Kör cirka 150 ml (30 ml) PBS-buffert för att tvätta bort NaOH. När pH för eluat är lika med PBS (~ 7) kan ett nytt prov laddas.

3. Kvalitetskontroll av ev-förberedelser

  1. Sterilitetstestning
    OBS: Eftersom dessa elbilar kommer från bakteriekulturer är det viktigt att säkerställa sterilitet före nedströms användning.
    1. Få 100 μl (20 μl) av de fraktioner som ska användas i analyser och inokulera 3 ml av mediet som används för att odla källbakterierna. Kultur under respektive optimala förhållanden i minst 3 dagar och observera för grumlighet. Alternativt kan du applicera fraktionsproverna på agarplattor som innehåller mediet som används för att odla de producerande bakterierna och leta efter kolonibildning.
      OBS: Om bakteriell kontaminering upptäcks rekommenderas det inte att använda EV-preparatet för experiment. Upprepa istället isoleringen och var noga med att minimera risken för bakteriell kontaminering genom att (a) utföra tillräcklig centrifugering / filtrering av konditionerat bakteriecellodlingsmedium, (b) använda rena flaskor, slangar, filter och kromatografikolonner och (c) använda lämpliga aseptiska tekniker.
  2. Kvantifiering av protein
    OBS: Ett högkänsligt, fluorescensbaserat proteinkvantifieringssats användes (se materialförteckningen). Satsen fungerar med en matchande proprietär fluorimeter vid excitations-/emissionsvåglängder på 485/590 nm.
    1. Ta alla reagenser, standarder och prover till rumstemperatur.
    2. Bered en masterblandning av proteinreagens och buffert genom att tillsätta 1 μl reagens till 199 μl buffert för varje prov och standard som skall analyseras. Använd tunnväggiga 0,5 ml PCR-rör, tillsätt 10 μL standard + 190 μL huvudblandning till varje standardrör.
      OBS: För att ligga inom analysområdet beror mängden av varje fraktion som ska tillsättas till varje provrör på det förväntade proteinutbytet av reningen. Typiskt användes 5 μL av varje fraktion + 195 μL masterblandning. Den slutliga volymen prov + huvudblandning måste vara 200 μl.
    3. Vortex analysrören och inkubera i minst 15 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
    4. Mät standarderna på lämplig proprietär fluorimeter (se materialtabellen) genom att välja alternativet Proteinanalys med pilknapparna och trycka på GO-knappen för att bekräfta. Följ instruktionerna på skärmen, sätt i varje standardrör och tryck på GO.
    5. Sätt i experimentprovröret; tryck på GO för att läsa; och notera det visade resultatet, vilket är den faktiska proteinkoncentrationen i analysbufferten/provblandningen. För att få proteinkoncentrationen i provet, använd piltangenterna för att välja alternativet Beräkna provkoncentration , tryck på GO och använd piltangenterna för att välja provvolymen som läggs till i analysbufferten för det givna provet. Tryck på GO och registrera provproteinkoncentrationen. Upprepa detta steg för varje prov som ska analyseras.
  3. Partikelräkning och storleksfördelning
    OBS: Mikrofluidik resistiv pulsavkänning (MRPS) användes för att kvantifiera EV-koncentration och storleksfördelning.
    1. Späd proverna i PBS kompletterat med 1% Tween-20 som har filtrerats genom ett 0,02 μm sprutfilter till en proteinkoncentration på cirka 0,1 μg/ml.
      OBS: Målet med utspädningen är att uppnå en förväntad partikelkoncentration i intervallet 1010 partiklar/ml i EV-innehållande fraktioner. Den optimala utspädningen kan behöva bestämmas empiriskt. Få elbilar förväntas för senare fraktioner (utöver fraktion 6). Således kommer partikelkoncentrationen sannolikt att vara <1010 partiklar / ml trots analys vid låga utspädningar.
    2. Ladda 3 μl av varje prov i engångspatronen för mikrofluidik med en mikropipett, sätt in patronen i MRPS-instrumentet och tryck på metallknappen med en blå upplyst kant.
    3. Klicka på Gå! på förvärvsprogramvaran och vänta tills provet analyseras av instrumentet. Skaffa 1 000 till 10 000 partikelhändelser för att minimera det tekniska statistiska analysfelet. Klicka nu på Stoppa och avsluta körning för att slutföra exempelförvärvet.
      OBS: Tillsammans med rådatafilerna matar instrumentet ut ett sammanfattande kalkylblad som listar partikelkoncentrationen i provet. Korrigera detta värde enligt provutspädningen.
    4. Använd analysprogramvara för att ladda rådata och generera anpassade grafer för storleksfördelning.

4. EV-lagring

  1. Alikvotera enskilda eller poolade fraktioner till 25-50% av den individuella fraktionsstorleken (beroende på storleken på den kolonn som används) i rör med låg proteinbindning och förvaras vid -80 ° C för att undvika frys-tina cykler.
    OBS: Olika applikationer kan kräva mindre eller större alikvoter beroende på den förväntade mängden som används i varje experiment. Detta måste bestämmas empiriskt. De icke-EV-innehållande fraktionerna kan kasseras om de inte är tillämpliga på forskningsmålen.

5. Transmissionselektronmikroskopi

  1. Negativ färgning
    1. Tillsätt 5 μl av EV-provet till det kolbelagda 400-masknätet i koppar och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Tvätta provsidan med 5 droppar 5 mM Tris-buffert (pH 7.1) och sedan med 5 droppar destillerat vatten.
    2. Fläckprovsida med 5 droppar 2% uranylacetat. Torka bort eventuell extra mängd fläckar med filterpapper och låt gallret torka helt i flera timmar eller över natten. Visualisera proverna med ett elektronmikroskop som drivs vid 80 kV.
  2. Immunogold-märkning
    1. Applicera 10 μl av EV-suspensionen på ett formvar/kol 400-maskigt rutnät och inkubera vid rumstemperatur i 1 h. Tvätta gallret i PBS tre gånger och applicera sedan 4% paraformaldehyd i 10 minuter för att fixa provet. Tvätta gallret fem gånger med PBS.
    2. Blockera gallret med tre tvättar av PBS som innehåller 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Applicera sedan 10 μl av en primär antikropp i 40 minuter vid rumstemperatur (här 1 μg/ml nluc-antikropp). Tvätta tre gånger igen med PBS som innehåller 0,1% BSA.
    3. Tillsätt 10 μl sekundär guldmärkt antikropp till gallret och inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur. Tvätta gallret tre gånger med PBS.
      OBS: Här användes en get-antimusantikropp konjugerad med 10 nm guldnanopartiklar efter utspädning 1:10 i blockerande buffert. Om guldmärkning döljer EV-visualisering kan sekundära antikroppar med mindre guldnanopartiklar (t.ex. 5 nm) användas istället.
    4. Efterfixera gallret med 10 μL 2,5% glutaraldehyd i 10 min vid rumstemperatur. Tvätta tre gånger i PBS. Utför negativ färgning med 2% uranylacetat (10 μL) i 15 min. Bädda in proverna i 10 μl 0,5% uranylacetat och 0,13% metylcellulosalösning i 10 min.
    5. Låt provgallren torka över natten vid rumstemperatur innan avbildning sker på elektronmikroskopet.
    6. På programvaran för mikroskopförvärv bestämmer du exponeringen empiriskt för att få optimal bildkvalitet (t.ex. 0,80851 s i den här inställningen) och justerar den genom att skriva detta värde i alternativrutan för exponeringstid . Välj alternativet 80 kV och klicka på Starta förvärv för att fånga bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att bedöma vilka SEC-kromatografifraktioner som anrikades för elbilar laddades SEC-kolonnen med 2 ml E. coli MP1-konditionerat odlingsmedium som hade koncentrerats 1 000 gånger av TFF och sekventiella fraktioner samlades in. Med hjälp av MRPS visade det sig att fraktionerna 1-6 innehöll flest elbilar (figur 2A). Efterföljande fraktioner innehöll mycket få elbilar, som i stället bestod av EV-fria proteiner (figur 2B). Elbilar var främst <100 nm i diameter (figur 2C). TEM bekräftade EV-anrikning och storlek, särskilt i fraktionerna 2-6 (figur 2D).

För att ytterligare säkerställa att metoderna kunde separera elbilar från icke-EV-associerade proteiner genererades en rekombinant stam av E. coli MP1 som uttrycker ett cytolysin A-nanoluciferasfusionsprotein och fritt (icke-smält) mCherry (schematiserat i figur 3A). Cytolysin A-fusionsproteiner har tidigare visat sig associera med E. coli EVs14. För att övervaka mCherry-fluorescens överfördes 100 μL alikvoter från varje kromatografifraktion till brunnarna i en 96-brunnsplatta. Deras fluorescens mättes i en mikroplattläsare med 580 nm respektive 620 nm som absorptions- och emissionsvåglängder.

På liknande sätt blandades för luminiscensmätning en alikvot på 20 μl av varje fraktion med en lika stor volym av Luciferas-analyslösningen i en 384-brunnsplatta, inkuberades i 15 minuter och synlig ljusluminescens mättes. Det observerades att EV-berikade fraktioner (fraktionerna 2-7) hade hög nanoluciferasaktivitet jämförbar med den för senare fraktioner men endast en mycket låg fluorescerande signal från icke-EV-associerad mCherry (figur 3B). Bakgrundssignalen från lika många negativa kontroll-elbilar (isolerade från en matchad bakteriestam som saknar nanoluciferasuttryck) var >1 000 gånger lägre i EV-fraktioner. Signalen från den positiva kontrollen (en nanoluciferasuttryckande bakteriecellpellets) var ungefär 1 000 gånger högre än den från EV-fraktionerna (visas inte). Den senare normaliserades till den initiala volymen av cellodlingsmaterial som gav de analyserade cellerna respektive elbilarna. EV-associationen av nanoluciferas bekräftades i fraktionerna 2-5 genom immunogoldmärkning (figur 3C), med beaktande av märkningen inom de små ~ 20 nm elbilar isolerade.

Slutligen, för att bedöma tillämpligheten av detta protokoll på andra bakteriearter, isolerades elbilar från ~ 100 ml kulturer av följande olika anaeroba bakterier: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve och B . dentium framställda i BHI-odlingsmedium. Som en kontroll isolerades elbilar från det färska BHI-odlingsmediet. Medan EV-utbytet varierade beroende på art, observerades det igen att tidiga kromatografifraktioner 1-4 berikades för elbilar (figur 4A). Det komplexa BHI-mediet innehöll också partiklar i EV-storlek, om än vid <25% av det totala EV-utbytet i dessa preparat (figur 4A, svarta staplar). Elbilar av dessa bakterier visade sig också vara främst <100 nm stora (figur 4B).

Figure 2
Figur 2: Representativ E. coli MP1 EV-eluering i tidiga kromatografifraktioner. (A) Partikelantal med MRPS i sekventiella 2 ml kromatografifraktioner. SEC-ingången var 2 L bakterieodlingssupernatant koncentrerad till 2 ml. Heldragen linje representerar medelvärdet; skuggat område betecknar SEM. (B) Proteinkoncentration i varje fraktion. (C) Storleksfördelning av elbilar i fraktion 3 mätt med MRPS. Heldragen linje representerar medelvärdet; skuggat område representerar 95% CI. Observera att instrumentet inte kan kvantifiera partiklar <50 nm. (D) Transmissionselektronmikrografer av sekventiella, poolade kromatografifraktioner och färskodlingsmedium (kontroll). Alla bilder togs i samma skala (100 nm). TEM-bilder med brett fält visas i kompletterande figur S3. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; MRPS = mikrofluidik resistiv pulsavkänning; SEC = storlek uteslutning kromatografi; SEM = medelvärdets standardfel; CI = konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Separering av E. coli MP1 elbilar från EV-fria proteiner med SEC. (A) Schematisk av E. coli MP1 som uttrycker rekombinant mCherry (röd) i cytoplasman och periplasm-trafficking cytolysin A-nanoLuciferase fusionsprotein (gula diamanter). (B) nanoLuciferas bioluminescensaktivitet och mCherry-fluorescens övervakades i sekventiellt eluterade kromatografifraktioner. Vertikal prickad linje representerar gränsen för EV-berikade fraktioner baserat på analyser i figur 2. (C) EV-fraktioner (F2-5) var immunogoldmärkta efter färgning med anti-nanoLuciferas-antikropp. Cyanpilspetsar pekar på guldkonjugerade sekundära antikroppar som samlokaliseras med små elbilar. Kontroll-elbilar från vildtyp E. coli MP1 hade försumbar icke-specifik färgning. Båda bilderna togs i samma skala (100 nm). TEM-bilder med brett fält visas i kompletterande figur S4. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; SEC = storlek uteslutning kromatografi; F = fraktion; TEM = transmissionselektronmikroskopi; ClyA-nLuc = cytolysin A-nanoLuciferas fusionsprotein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Isolering av elbilar från olika bakteriearter. Indikerade arter odlades i 48 timmar i BHI-medium under anaeroba förhållanden. Elbilar isolerades genom ultrafiltrering + SEC. (A) EV-koncentration i de första 4 SEC-fraktionerna, mätt med MRPS. ±Svarta staplar representerar partiklar som detekterats i ett parti färskt BHI-medium (kontroll). (B) Storleksfördelning av elfordon i del 2. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; MRPS = mikrofluidik resistiv pulsavkänning; SEC = storlek uteslutning kromatografi; BHI = infusion av hjärnhjärtat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur S1: p114-mCherry-Clyluc plasmid. (A) Karta över p114-mCherry-Clyluc plasmid. (B) Sekvens för regionen J23114-mCherry-clyA-nluc. Violett, J23114 Promotor; Rosa, mCherry gen; Grå, clyA-gen ; Grön, Linker sekvens; Orange, nLuc gen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Schema för tangentiell flödesfiltrering (TFF). Slangen med hullingslangar var ansluten till TFF-enheten, som visas. Matningsflödesslangen börjar nedsänkt i det filtrerade, konditionerade odlingsmediekärlet, fortsätter genom den peristaltiska pumpen och ansluts till TFF-enhetens inloppsport. Returflödet börjar vid TFF-enhetens utloppsport och slutar ovanför ytan på det filtrerade, konditionerade odlingsmediet. Eventuellt kan en mottrycksklämma (t.ex. en skruvmutter + bult eller enkel pappersklämma) användas för att öka filtreringshastigheten. När pumpen cirkulerar det konditionerade mediet leder utvecklat tryck i TFF-enheten till ultrafiltrering och avlägsnande av komponenter <100 kDa genom filtratet / avfallsflödesslangen, som kan samlas i ett separat kärl för bortskaffande (magenta). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Elektronmikrografer för widefieldöverföring. TEM-bilder av sekventiella, poolade kromatografifraktioner och färskt odlingsmedium (kontroll) som visas i figur 2D. Bilderna visar att E. coli MP1 extracellulära vesiklar eluerar i tidiga kromatografifraktioner. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild S4: TEM-bilder för Widefield för figur 3C. EV-fraktionerna (F2-5) var immunogold-märkta efter färgning med anti-nano-Luciferas-antikropp. Cyanpilspetsar pekar på guldkonjugerade sekundära antikroppar som samlokaliseras med små elbilar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande metod: För rekombinant E. coli MP1-stam som hyser p114-mCherryClyluc. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I protokollet ovan beskrivs en metod som är skalbar och på ett tillförlitligt sätt isolerar elbilar från olika gramnegativa/positiva och aeroba/anaeroba bakterier. Det har flera potentiella stopppunkter under hela proceduren, även om det är bättre att undvika att ta längre tid än 48 timmar att isolera elbilar från konditionerade bakterieodlingsmedier.

För det första består det av att odla bakterier för att generera konditionerat bakterieodlingsmedium. Det visade sig att öka odlingstiden till minst 48 timmar och använda det optimala tillväxtmediet hjälper till att maximera EV-utbytet. Det är troligt att varje bakterieart måste optimeras med avseende på dessa två parametrar. Bakteriekulturens volym är också viktig för att säkerställa att tillräckliga elbilar isoleras för önskad applicering. För in vitro-studier isoleras elbilarna vanligtvis från minst 100 ml, medan elbilar för in vivo-studier vanligtvis isoleras från >1 L odlingsmedium. Återigen kommer EV-produktionsegenskaperna för varje bakteriestam och den erforderliga EV-mängden för nedströmsanalyser att diktera den minsta startodlingsvolymen.

När konditionerat odlingsmedium är tillgängligt måste celler och stora icke-EV-skräp tas bort. Det visade sig att centrifugering är ett kritiskt steg i denna process. Som noterats i protokollet ovan utfördes två ökande g-kraftcentrifugeringar. Ibland utförs ytterligare 10 000 × g centrifugering om det noterades att pelleten i det andra snurret inte är kompakt. Därefter utförs steril filtrering av denna supernatant genom ett 0,22 μm filter. Otillräcklig centrifugering leder till igensättning och dålig prestanda för detta filtreringssteg. Det noterades att fortsatt filtrering av supernatanten efter att filtreringshastigheten har avtagit avsevärt kan leda till filterfel och kontaminering av EV-preparatet med föräldrabakterierna. Lösningen på ihållande igensättning av filtret är att återcentrifugera och/eller omfiltrera supernatanten, vilket säkerställer sterilitet. De beskrivna centrifugerings- och vakuumdrivna filtreringsstegen testades för upp till totalt 4 liter bakteriekultur. Ytterligare uppskalning av EV-isolering kan kräva ändringar. Till exempel kan båda dessa steg potentiellt ersättas med sekventiell pumpdriven filtrering med kompatibla filteranordningar med minskande porstorlek, ner till 0,22 μm. Detta återstår dock att testa.

I det aktuella protokollet beskrivs två variationer, beroende på bakteriekulturens startvolym. För volymer <100 ml, använd centrifugala ultrafiltreringsanordningar för att koncentrera odlingsmediet. MWCO är kritisk i dessa steg. För elbilar för däggdjur användes tidigare >300 kDa MWCO11,12. Detta resulterade dock i mycket dåliga EV-utbyten från bakterier, förmodligen på grund av den mindre storleksfördelningen. Således rekommenderas att använda 100 kDa MWCO. En mindre MWCO kan också användas men är förknippad med längre centrifugeringstider och mindre avlägsnande av föroreningar med liten molekylvikt, vilket ökar provviskositeten. Det är också bra att ha olika storlekar av ultrafiltreringsenheter vid 100 kDa MWCO för att hjälpa till att koncentrera olika startvolymer av prov i hela protokollet.

Alternativt, för provstorlekar som är signifikant >100 ml, använd pumpdriven TFF för att koncentrera provet. återigen är det viktigt att använda en 100 kDa MWCO. Denna metod möjliggör bearbetning av stora volymer odlingsmedium på ett halvautomatiskt sätt. Det är viktigt att erhålla en TFF-enhet av lämplig storlek för startodlingsvolymen. Den använda enheten är klassad vid bearbetning av upp till 200 ml material av tillverkaren. Det var möjligt att bearbeta upp till ca 2 L. En allvarlig minskning av filtreringshastigheten observerades emellertid vid försök att bearbeta större volymer, vilket krävde att processen stoppades och enheten rengjordes före ytterligare bearbetning. Således kommer egenskaperna hos varje bakteriekultur och mängden utgångsmaterial att diktera den erforderliga storleken på TFF-anordningen. Dessutom är den uppnåeliga pumphastigheten en annan viktig parameter för TFF. Vid låga hastigheter på ~ 100 ml / min var det nödvändigt att öka mottrycket i TFF-enheten med hjälp av en klämma, som anges i kompletterande figur S2, för att underlätta filtrering, vilket ökar filtrets nedsmutsningshastighet. Slangen återanvändes upp till 2 gånger efter lämplig dekontaminering och autoklavering.

När provet är koncentrerat kan det sedan laddas på en SEC-kolumn för att isolera elbilarna. Kommersiella kolumner optimerade för liten EV-isolering användes. För små startprover använder du kolumner med 0,5 ml laddningsvolym och använder kolumnerna med 2 ml laddningsvolym för större startprover upp till 2 L. Det är troligt att bearbetningen av startkulturer >2 L kommer att kräva större kolumner. Tillverkare av EV-optimerade kolumner erbjuder för närvarande SEC-kolumner som kan acceptera > 100 ml koncentrerat material.

Olika metoder används för att karakterisera de isolerade elbilarna, varav de flesta är allmänt tillgängliga. Normalisering baserades på proteinkoncentrationen för de flesta analyser eftersom detta inte påverkas av oförmågan hos andra kvantifieringsmetoder (nämligen partikelkvantifiering med tekniker som MRPS) att detektera mycket små elbilar <50 nm. MRPS och andra nanopartikelkvantifieringstekniker är fortfarande användbara vid relativ kvantifiering av elfordon mellan de olika fraktionerna.

En kritisk aspekt av MRPS-kvantifiering är utspädningsnivån. Vid lämplig utspädning bör frekvensen av detekterade elbilar fortsätta att öka till detektionsgränsen i de flesta fall, eftersom instrumentet inte kan kvantifiera partiklar <50 nm. Otillräcklig utspädning kommer att leda till högt instrumentbrus, vilket kommer att generera en artefaktisk klockformad kurva med en topp >65 nm (vid användning av den rekommenderade C-300 mikrofluidikpatronen). Under dataanalys av storleksfrekvensfördelning observeras fortfarande ibland en arteffaktisk topp mellan 50 nm (instrumentets absoluta detektionsgräns) och 60 nm, trots tillräcklig utspädning. Detta beror sannolikt på närvaron av ett betydande antal mycket små bakteriella elbilar (som visualiseras i TEM, figur 2D) som ligger under gränsen för exakt detektering av MRPS och återigen leder till instrumentbrus. Uteslut i så fall datapunkter som är mindre än den observerade "toppen", som blir den de facto nedre kvantifieringsgränsen för det givna provet.

Som beskrivs i detta protokoll kan kvantifieringen av EV-överflöd, total proteinkoncentration och överflöd av icke-EV-proteiner i de eluterade kromatografifraktionerna hjälpa användare att bestämma vilka fraktioner som ska användas för nedströmsanalyser. Till exempel detekterades små elbilar i poolade fraktioner 7-8 (figur 2D); emellertid var deras överflöd lägre än i de omedelbart föregående fraktionerna, medan den totala proteinkoncentrationen (figur 2B) var högre. Detta kan tyda på att fraktionerna 7-8 innehåller högre mängder icke-EV-associerade proteiner och därför kanske inte är önskvärda för vissa nedströmsapplikationer.

Sammanfattningsvis beskrivs här ett mångsidigt EV-isoleringsprotokoll som förlitar sig på kommersiellt tillgängliga material. Betydelsen av denna metod jämfört med allmänt använda ultracentrifugeringsbaserade metoder är att den består av steg som enkelt kan reproduceras av olika användare och är mycket skalbar. Detta är särskilt viktigt för att underlätta genereringen av tillräckligt med material för in vivo-studier . Det användes för att isolera elbilar från kulturer på 100 ml till 2 L. Med tanke på det stora utbudet av tillgängliga TFF-enheter är det möjligt att detta protokoll kan anpassas till större reningar med viss modifiering. Det beskrivna isoleringsprotokollet är främst baserat på elbilarnas fysikaliska egenskaper, nämligen deras storlek, och är sannolikt tillämpligt på bakteriearter utöver de som beskrivs i denna studie.

En begränsning av det beskrivna protokollet är att det gynnar isoleringen av små elbilar, särskilt <100 nm, vilket framgår av de representativa resultaten. Tidigare rapporter beskriver också förekomsten av större bakteriella elbilar15,16. Isolering av större bakteriella elbilar kan kräva modifieringar av protokollet ovan, till exempel genom att använda SEC-kolumner optimerade för större elbilar. Sådana SEC-kolumner är också kommersiellt tillgängliga. Dessutom kan andra protokoll sannolikt uppnå högre EV-renhet (till exempel ultracentrifugering av densitetsgradient eller immunisolering). Dessa metoder saknar dock genomströmningen och skalbarheten hos de metoder som beskrivs i denna studie. Ändring av detta protokoll med ytterligare reningssteg i framtiden kan ytterligare öka preparatens utbyte och renhet, vilket kan vara viktigt för experimentella och terapeutiska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Forskningen som beskrivs ovan stöddes av NIH TL1 TR002549-03 utbildningsbidrag. Vi tackar Drs. John C. Tilton och Zachary Troyer (Case Western Reserve University) för att underlätta tillgången till partikelstorleksanalysatorinstrumentet; Lew Brown (Spectradyne) för tekniskt bistånd med analys av data om partikelstorleksfördelning; Dr David Putnam vid Cornell University för att tillhandahålla pClyA-GFP plasmid14; och Dr. Mark Goulian vid University of Pennsylvania för att förse oss med E. coli MP113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes Thermo Scientific 3430 it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron microscopy sciences 15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter Beckman Coulter 392077 Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila ATCC BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO) MilliporeSigma UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge Beckman Coulter No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 ATCC 29148
Bifidobacterium breve NCIMB B8807
Bifidobacterium dentium ATCC 27678
Brain Heart infusion (BHI) broth Himedia M2101 After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge Spectradyne
Chloramphenicol MP Biomedicals ICN19032105
Electron microscope FEI company Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) Takara 636763
Escherichia coli MP1 Dr. Mark Goulian (gift) commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter ThermoFisher 010-0151-05 used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor ThermoFisher F12-6x500-LEX fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper Electron microscopy sciences FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) Electron microscopy sciences 16100
Hematin ChemCruz 207729B Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader Tecan This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus Takara 638909 For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller Difco 244620
L-Cysteine Hydrochloride J.T. Baker 2071-05 It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-08 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-24 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm Masterflex HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor Masterflex EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft Cole Palmer EW-06435-16 low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3) MP 102259 Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK Repligen D04-E100-05-N TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System Promega N1110 This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 R&D Systems MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument Spectradyne
nCS1 Viewer Spectradyne Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer NEB M0482 DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes Eppendorf 30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix NEB M0492 DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm Izon maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack Izon for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm Izon maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer ThermoFisher Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit ThermoFisher Q33211 Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge ThermoFisher 75006580
SpectraMax i3x Microplate reader Molecular Devices This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) MilliporeSigma S2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		 One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate Electron microscopy sciences 22400
Vinyl anaerobic chamber Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES Sartorius VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) MilliporeSigma WHA68093002 to filter MRPS diluent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
  2. Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
  3. Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
  4. Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
  5. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  6. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  7. Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
  8. Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
  9. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  10. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  11. Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
  12. Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
  13. Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
  14. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
  15. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  16. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).

Tags

Biologi utgåva 176
Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från <em>Escherichia coli</em> och andra bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Watson, D. C., Johnson, S., Santos,… More

Watson, D. C., Johnson, S., Santos, A., Yin, M., Bayik, D., Lathia, J. D., Dwidar, M. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (176), e63155, doi:10.3791/63155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter