Summary
患者由来のオルガノイド(PDO)は、トランスレーショナルがん研究における強力なツールであり、疾患の遺伝的および表現型的な不均一性および個別化抗がん治療に対する応答の両方を反映しています。ここでは、表現型解析および薬物応答の評価に備えてヒト原発性膀胱癌PDOを生成するための統合プロトコールが詳述されている。
Abstract
現在の インビトロ 治療試験プラットフォームは、腫瘍病態生理学との関連性を欠いており、典型的には、組織培養プラスチック上の二次元(2D)培養物として確立された癌細胞株を使用する。治療応答と感受性を正確に予測できる腫瘍の複雑さのより代表的なモデルが決定的に必要とされています。新鮮な腫瘍組織に由来する患者由来オルガノイド(PDO)の三次元(3D) エクスビボ 培養の開発は、これらの欠点に対処することを目的としている。オルガノイド培養物は、日常的な臨床管理と並行して腫瘍の代理として使用でき、潜在的な効果的な介入を特定し、無駄である可能性のある治療法を示すことによって、治療上の決定に情報を提供することができます。ここで、この手順は、新鮮で生存可能な臨床組織から膀胱癌PDOを確立するための戦略および詳細なステップバイステッププロトコルを記述することを目的としている。当社の十分に確立された最適化されたプロトコルは、患者から直接得られた限定的で多様な出発物質または患者由来の異種移植片(PDX)腫瘍材料を使用して実験用の3D培養をセットアップするのに実用的です。この手順は、標準的な組織培養装置を備えたほとんどの研究室でも採用できます。このプロトコルを使用して生成されたオルガノイドは、泌尿器科的癌病理を支える分子メカニズムを理解し、臨床管理に情報を提供する治療法を評価するために 、ex vivo 代理として使用することができる。
Introduction
膀胱癌は、最も蔓延している尿路癌であり、世界で10番目に多いヒト悪性腫瘍である1.それは、疾患2の遺伝的に多様で表現型的に複雑なスペクトルを包含する。尿路上皮非筋肉浸潤型膀胱癌(NMIBC)は、最も一般的な膀胱癌の診断(70%〜80%)であり、これらの癌はかなりの生物学的不均一性および可変臨床転帰を示す2,3,4。NMIBC患者は、通常、疾患再発のリスクが高く(50〜70%)、がんの3分の1が進行し、有意に攻撃的な筋肉浸潤性膀胱がん(MIBC)に発展する2。NMIBCの5年生存率は高い(>90%)が、これらの患者は長期的な臨床管理を受けなければならない5。一方、局所的に進行した(切除不能な)または転移性MIBCは、一般に不治の病であると考えられる6。その結果、膀胱癌は、癌治療の中で最も高い生涯治療費の1つであり、個人および医療システムの両方にとって大きな負担である3,7。進行性疾患における根底にある遺伝子異常は、膀胱癌の治療管理を臨床的課題とし、浸潤性尿路上皮腫瘍の治療選択肢は、進行性および高リスクNMIBC 8,9の両方に対する免疫療法の承認以来、ごく最近改善された。現在、臨床的意思決定は、個々の膀胱癌腫瘍が疾患攻撃性および治療に対する応答に大きな差を示すにもかかわらず、従来の臨床的および組織病理学的特徴によって導かれている10。個々の患者の予後の予測と効果的な治療法の同定を改善するために、臨床的に有用なモデルの研究を加速することが急務である。
3次元(3D)オルガノイドは、元の腫瘍の固有のin vivoアーキテクチャおよび薬理ゲノムプロファイルを自己組織化および反復する能力、およびそれらが由来する元の組織の天然の細胞機能を反映する能力のために、腫瘍モデルとして大きな可能性を示す11,12,13.確立された膀胱癌細胞株は容易に入手可能であり、比較的費用対効果が高く、スケーラブルで、操作が簡単であるが、in vitro細胞株は、臨床膀胱癌12、14で観察される多様な遺伝的およびエピジェネティックな変化のスペクトルを模倣することにほとんど失敗し、すべて2Dの付着培養条件下で樹立および維持された。さらに、原発性および転移性膀胱腫瘍に由来する細胞株は、元の腫瘍材料から有意な遺伝的相違を有する。8,15。
別のアプローチは、遺伝子操作された発癌物質誘導マウスモデルを使用することである。しかし、これらのモデルは、ヒト新生物形成に関与する天然の発癌性カスケードのいくつかを再現しているが(参考文献16,17,18でレビュー)、腫瘍の不均一性を欠いており、高価であり、浸潤性および転移性膀胱癌をり表さず、腫瘍が発症するのに数ヶ月かかる可能性があるため、迅速な薬物検査には実行可能ではない14,19.がんの患者由来モデル(オルガノイド、条件付き再プログラム初代細胞培養、および異種移植片を含む)は、臨床治療前の薬物治療の効果を理解するための非常に貴重な機会を提供する20。それにもかかわらず、新鮮な一次患者組織へのアクセスが限られており、患者由来オルガノイド(PDO)培養条件を再現性よく生成するために必要な広範な最適化のために、これらの患者近位モデルを日常的に使用するグループはほとんどありません。in vivoの設定において、発癌性細胞は、間質細胞、組織浸潤免疫細胞、およびマトリックス12を含む周囲の構成成分の様々な組成物と相互作用し、通信することができる。同様に、3D形式で成長したPDOの場合、セルラー/マトリックスの複雑さをカスタマイズして、他の関連コンポーネントを含めることができます。PDOは迅速に生成することができ、有限の寿命を有するにもかかわらず、しばしば広範囲に継代または後で使用するために凍結保存することができる21、22、23。薬力学(すなわち、薬物に対する応答)は、オルガノイドの生存率および形態、ならびに免疫組織化学標的または転写変化の特性評価を含む複数の読み出しを用いて評価することができる。
ここでは、膀胱腫瘍の経尿道的切除(TURBT)または膀胱の外科的除去(根治的膀胱切除術)から採取された患者材料からの膀胱癌オルガノイドの確立のための手順が記載されている。PDOを生成する方法は、容易に入手可能な湿式実験材料およびツールを使用して例示される。エンドポイントには、細胞形態学的特性および生存率の変化が含まれる。これらは、蛍光顕微鏡、 インビトロ 生存率(代謝および細胞膜完全性)アッセイ、および組織病理学的分析を用いて測定した。 図1 は、選択的手術中に得られた臨床材料からヒト膀胱癌PDOを確立するためのワークフローを示す。
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Protocol
患者は、オーストラリアのブリスベンにあるプリンセス・アレクサンドラ病院の泌尿器科チームの下で入院した後、この研究に同意しました。この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従い、倫理的および制度的ガイドライン(倫理番号HREC/05/QPAH/95、QUT 1000001165)内で実施された。
注:適格基準として、患者は18歳≥がんに罹患しており、理解して同意を与えることができた。インフォームドコンセントを得られなかった者は除外された。英語以外の第一言語を持つ者は、兵站上および予算上の理由から通訳の提供が不可能であったため、除外された。また、腫瘍が生検にアクセスできない、または日常的な病理後に十分な量で利用可能である可能性が低い患者も除外された。
1. オルガノイド培地調製
注:ヒト膀胱癌オルガノイド培地は、解離した臨床材料に由来するオルガノイドの生存、成長、および継続的な拡大を助ける成長因子を必要とする(表1)。この手順で使用される各サプリメントの詳細については、 材料表を参照してください。
- 冷凍食材を氷の上または冷蔵庫で2〜8°Cで解凍する。 繰り返しの凍結/解凍サイクルを避け、凍結アリコート(-20°Cで保存)から作業してください。
- 基礎培地:高度なダルベッコの改変イーグル培地/ハムのF-12(adDMEM/F12)にHEPES(10mM)とグルタミン(2mM)を補充して基礎培地を調製します。これはまた、輸送媒体として、およびオルガノイド洗浄工程中に使用される。
注:高度なDMEM/F-12は、限られた血清の存在下でオルガノイドの増殖を助けるための基礎培地として使用される。しかしながら, それはHEPESとL-グルタミンの補充を必要とします. - 線維芽細胞増殖因子10(FGF−10)、線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)、上皮増殖因子(EGF)、SB202190、プロスタグランジンE2(PGE2)、およびA83−01を開封前に短時間遠心分離し、成分がバイアルの底にあることを確認した。
- 完全オルガノイド培地:最終濃度5% v/vのヒトノギンおよびR-スポンジン1馴化培地、ヒトEGF(50ng/mL)、ヒトFGF-2(5ng/mL)、ヒトFGF-10(20ng/mL)、A 83-01(500nM)、SB202190(10μM)、B27(1x)、ニコチンアミド(10mM)、N-アセチルシステイン(1.25mM)、Y-27632(10μM)、PGE2(1μM)、および製造業者が示す濃度での広域スペクトル抗生物質形成を補足する。
- オルガノイド培地を暗所4°Cで保存し、2週間以内(最大1ヶ月)に使用してください。凍らないでください。光源への長時間の暴露を避けてください。
注:オルガノイド培地は無血清で調製される。しかし、血清およびペニシリン/ストレプトマイシンは、必要に応じてユーザーごとに補充することができる。
2. 3に概説する前日の手続き
- 成長因子低減基底膜(BME; 材料表参照)を4°Cの冷蔵庫または冷蔵室で使用する前に少なくとも12時間一晩融解する。必要に応じて、凍結融解サイクルを避けるために、BMEを1.5mLポリプロピレンシングルユースチューブ内の1mLアリコートに分注します。
- ろ過したピペットチップを4°Cの冷蔵庫または冷蔵室に入れます。
注:このセクションでは、BMEを取り扱うときに、早期重合を防ぎ、チップの表面上のBMEのコーティングを減らすために使用されるピペットチップを指します。 - 処置に必要なすべての外科用機器を滅菌する。
3. 膀胱腫瘍オルガノイドの生成
注:これは、原発性患者の腫瘍からのPDO確立のための最初のステップである。この手順は、Gaoらによって確立された方法から膀胱癌組織に適合される24。
- クラスIIバイオハザードフードを使用して標本を準備します。ドライアイスとウェットアイスを取り出し、 患者検体処理シート (補足ファイル)を印刷します。
- 外科的切除がほぼ完了したら、研究担当者を手術室に呼んでください。
注:患者が適格基準を満たし、参加者の同意書に署名したことを確認します。組織は、臨床病理組織学的評価の要件に余剰がある場合にのみ研究のために提供される。 - 手術から新鮮な巨視的に生存可能な腫瘍標本を採取する。輸送中は、サンプルが輸送媒体(1x adDMEM/F12または1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)のいずれか)に滅菌された50mL円錐管または尿検体ジャーに沈んでいることを確認してください。
注:一部の臨床センターでは、研究に割り当てるために組織を病理学研究所に輸送する必要があるかもしれません。このような状況下では、抗生物質および抗真菌薬を輸送媒体に添加することが推奨される。組織は、手術後最大24時間、基礎培地中で4°Cで保存することができ、それでも生存可能なオルガノイド培養物を生成することができる。 - 組織重量(gまたはmg)、サンプルの説明、血液および尿サンプルに関する詳細を含む検体の詳細を 患者検体処理シート (補足ファイル)に記録します。
- 輸送培地を慎重に取り出し、10mLの基礎培地と交換する。腫瘍組織が重力によって沈降するのを許す。
注:輸送媒体は臨床廃棄物とみなされ、適切な量の除染溶液中の適切なラベルの付いた廃棄物容器に回収されなければならない。液体が化学的に除染されると、有害廃棄物に関する制度上のガイドラインに従って処分することができます。 - 鉗子で腫瘍組織を取り出し、滅菌した90mmシャーレに入れます(図2A)。組織の重量をmgまたはgで臨床検体処理シートおよび解剖グリッドに記録する(図2B)。
- メスハンドルに取り付けられた滅菌鉗子および使い捨てメスブレードを使用して、非癌組織(脂肪組織を含む)および巨視的に見える壊死領域を除去します(図2C)。腫瘍片を冷たい1x DPBSで1〜2回洗浄する。腫瘍片を集め、新しい滅菌90mmペトリ皿に移す。
メモ: メスの刃は鋭いので、手動でスライスする場合は注意してください。腫瘍隣接脂肪組織は、視覚的腫瘍周囲に直結する明らかに柔らかく、ゼラチン状の、淡い領域によって同定することができる。巨視的な脂肪組織、および壊死の領域を表す葉的に暗い領域は、切除膀胱腫瘍生検から解剖する際に個人的な判断を必要とするであろう。 - 写真を撮り、組織の図を描き、臨床処理グリッド上に組織郭清を計画する(図2Bおよび図2C)。
注:個々の巨視的腫瘍特性の視覚的記録と大まかなスケッチを、特定の症例ごとに解剖することが重要です。 - 腫瘍組織片を解剖し、病理組織学的(図2D)および分子分析(図2E)に割り当てる。
- 組織学的分析の場合:約50mgの腫瘍組織を標識された使い捨てプラスチック組織学カセットに入れる(図2D)。組織学カセットを、5倍から10倍容量の10%中性緩衝ホルマリン(NBF)の容器に沈める。RTで一晩インキュベートする。
- 10%NBFを除去し、翌日70%(w / w)エタノールと交換し、組織が日常的な組織処理プロトコルを使用して処理できるようになるまで4°Cで保存する
- 分子分析の場合:液体窒素を使用して、RNase/DNaseフリーの1.5 mLクライオビアで少なくとも1つの1~3 mm 3 腫瘍片をスナップ凍結し、-80 °Cで保存します(図2E)。
- 残りの腫瘍片を含む90mmシャーレに5mLのオルガノイド培地(表1)を分注する。
- 滅菌#10メスブレードで組織をできるだけ細かく(0.5〜1mm3 個以下)機械的にミンチする。
注:より大きな断片または組織の塊全体(>3mm3)は、消化にかなり時間がかかり、標本の生存率を低下させる。組織が脱凝集し、断片が5mL血清学的ピペットチップでピペットするのに十分小さい場合は、上記のステップを省略する。 - 細かく細切した組織を50mLの円錐管に移し、細胞凝集を避けるために、4mLのオルガノイド培地、10xコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ1mL、および0.1mg/mLデオキシリボヌクレアーゼ1(DNase 1)を加える。
注:酵素液は毎回新しく調製する必要があります。培地の体積を、大きなサンプルの腫瘍断片の目に見える量の約10倍になるように増やします。 - ミンチした腫瘍組織および酵素溶液を、インキュベーター(37°C、5%CO2)内のオービタルシェーカーまたはローテーター(150rpm)上で1〜2時間インキュベートし、断片を細胞懸濁液に解離させ、コラーゲンを分解する。これは組織学的解析で確認できる(図3A)。
注:組織の量が多い場合、または1〜1.5時間後に明らかな解離が観察されない場合は、30分ごとに解離のレベルを確認するインキュベーション時間を増やしてください。このステップのタイミングはサンプルに依存し、毎回経験的に決定する必要があります。目には識別できない組織断片(または非常に少数の断片)を含む著しく透明な溶液は、消化が成功したことを示す。 - サンプルに2倍容量(20mL)の基礎培地を添加して消化を終了します。
- 試料を室温(RT)で5分間261 x g で遠心分離し、吸引し、上清を捨てる。
- 汚染赤血球(RBC)を溶解するには、上記の工程から得られたペレットを5mLの塩化アンモニウム-塩化カリウム(ACK)緩衝液に再懸濁する。RTでチューブを3分間、またはRBCの完全な溶解が見られる(懸濁液が透明になるまで)インキュベートする。
注:赤血球がペレット中に小さな赤い塊として観察されない場合は、このステップを省略してもよい。 - 20mLの基礎培地をチューブに加える。チューブを261 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を吸引する。
- このステップでは、2xおよび1xオルガノイド培地の10mLアリコートを37°Cのウォーターバスに入れて加温する。
- 予め濡れたリバーシブル 100 μm ストレーナーを通してサンプルを新しい 50 mL チューブにろ過し、大きな不溶性物質を除去します。
注:フィルターによって収集された大きな未消化物(>100μm)には、目的の細胞が含まれている場合があり、オルガノイド培地中の90mmシャーレまたは6ウェル細胞培養プレートで培養して、2D培養を導出することができます(図1(ステップ5)および図3B)。 - 溶出液をプリウェット可逆的な37μmストレーナーでろ過し、単一細胞および免疫細胞単離用の単一細胞および小さなクラスターを収集する(チューブ37-1;図1(ステップ6)および図3B)。
注:この工程中の腫瘍細胞の収量は、濾過した細胞懸濁液を再びストレーナーに通すことによって増加させることができる。 - 37 μm のストレーナーを逆にし、10 mL の基礎培地を使用して、中小規模のクラスター (37-100 μm) を収集します (チューブ 70-1;図3B)。
- 新しい 50 mL チューブ (チューブ 70-1 および 37-1) のそれぞれに DPBS を 40 mL まで補充します。懸濁液を261 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
- チューブ 37-1 に10mLの基礎培地を加え、トリパンブルー排除色素および自動セルカウンター(製造業者の仕様による)を使用して細胞をカウントする。細胞数と細胞の生存率を決定します。
- 残りのサンプルを 261 x g で RT で 5 分間遠心分離します。培地を吸引し、10% ウシ胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む細胞凍結溶液または基礎培地と交換します。
- サンプルを1.5 mLのクライオバイアルに入れ、細胞凍結容器に保管します。容器を直ちに-80°Cの冷凍庫に移し、最適な冷却速度を得る。-80°Cで一晩冷凍庫保管した後、クライオバイアルを極低温液体または気相貯蔵(-196°C)に移して長期保存する。
- チューブ 70-1 の細胞を、予め加温した2倍オルガノイド培地500μLで再懸濁する。
注: オルガノイドの繁殖を成功させるには、播種密度を高くする必要があります。オルガノイド培地および続いてBMEの体積は、濾過工程から単離された細胞の数について経験的に変化させるべきである。このステップは、私たちの研究室での研究に基づいて、関連する出発点を提供します。 - BMEを氷冷P1000滅菌フィルターピペットチップで細胞に(2倍のオルガノイド培地で1:1の比率で)加え、穏やかに混合して細胞を懸濁させる。再構成された細胞/BME混合物100 μLを、超低付着平底96ウェルプレートのウェルに迅速かつ慎重にピペットします。96ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れ、20〜30分間、固化させた。
- 経験的に評価された体積に応じてBME細胞懸濁液の上に1xオルガノイド培地の1:2の比率を加える。関連する開始点で、100 μLの再構成細胞/BME混合物の上に50 μLの1xオルガノイド培地培地を加える。
- 96ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に20分間置き、平衡化した。
- 細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡のステージ上の検体ホルダーに組み立てます。オルガノイドを位相コントラストまたは明視野設定で視覚的に評価します。
注:画像は、微分干渉(DIC)光学系、デジタルカメラ、および関連ソフトウェアを備えた倒相差顕微鏡によって取得され、エンドポイント分析の準備として球面PDOの形成を観察するのが最善です。- 明確なクラスターが見える場合は、細胞培養プレートをステージ上の電子加熱顕微鏡チャンバー(37°C、5%CO2)に置き、最初の24〜72時間にわたって生細胞イメージングを行います。
- 熱ドリフトを低減するために、フレキシブルな加熱カラーがレンズに取り付けられ、加湿器がdH2Oで満たされていることを確認します。
- 4倍または10倍の対物レンズ(N.A. 0.30、幅15.2 mm)を使用して初期イメージングを実行します。位相コントラスト設定で5〜10分ごとにタイムラプスします。
- 24〜72時間後にウェルあたり>10個の自己組織化オルガノイドの出現によって特徴付けられる単離が成功したかどうかを確認します。
- オルガノイド数が少ない場合は、培養を最大2週間継続させる(図3C)。
- 50 μLの予備加温オルガノイド培地を使用して2〜3日ごとに培地を補充し、枯渇した成長因子および総量を補充する。
- 1 日目、2 日目、3 日目 (タイムラプス系列) と、継代前の 5 日目、7 日目、10 日目 (該当する場合) に (手順 3.30 で説明) 画像を取得します。
注:オルガノイド(個々の細胞の縁が見えない一般的に丸い構造として観察される)は、単離の成功に応じて、通常、セットアップ後7〜10日間継代される。継代前または継代後に、オルガノイドを細胞傷害性または治療剤で最大6日間処理し、細胞生存率および細胞傷害性アッセイを用いて薬物応答を測定することができる。あるいは、オルガノイドをBMEから取り出し(1mg/mLディスパーゼを使用)、凍結保存(バイオバンク)、分子試験用に調製するか、包埋して組織学的に評価することもできます(図4)。
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Representative Results
ヒト膀胱癌患者TURBTおよび膀胱摘出組織から3Dオルガノイドが樹立された。簡単に言えば、この技術は、組織学的評価、分子特性評価(免疫組織化学または定量的リアルタイムPCRによる)、および薬物スクリーニングなどの他のエンドポイント分析に実行可能で適切な3D多細胞構造の迅速な形成を強調する。手順(図1)では、ろ過段階(図1、ステップ1~6)中のさまざまな溶出液を利用して単一細胞を凍結保存し、腫瘍浸潤性免疫細胞(TIL)の単離と単一細胞バイオバンクの生成を行うことができました。この手順により、組織学(図2C、D)および新鮮な凍結サンプル(図2E)を含む、患者間で追跡できる方法で、異種原発腫瘍の複数の側面を適切かつ追跡可能な方法でバイオバンク化することができます。
市販のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼおよびDNase 1による2時間の消化は、膀胱の固有層および筋肉層内の腫瘍細胞を含む、より複雑な膀胱切除術生検組織の0.5〜1mm3 個の十分な消化を可能にする(図3A)。より大きな消化後断片(>100ミクロン)は、新規2D培養物の単離のために、あらゆるサイズの標準的な組織培養プレートでの培養に適していることが証明されています(図3B)。しかしながら、このような細胞株の癌起源を検証するためには、広範な分子特性評価が必要である。このプロトコルで首尾よく生成されたオルガノイドは、凝集、圧縮、および最終形成の段階を含む動的自己組織化のプロセスを経ることにより、それらは、標準的な治療に対する応答について評価することができるタイトな細胞構造(図3C)に形成される。 図3C は、オルガノイドの効率的な自己組織化特性を強調する。組織学的には、これらの構造は元の患者の腫瘍を再現する(図4)。この手順で生成されるオルガノイドは、さらなる特性評価、バイオバンキング、および薬物有効性試験を含む多数の目的に適しています(図5)。
図1:手術からエンドポイント分析までの腫瘍サンプルの収集からのオルガノイド組織培養の概略図。 URN、ユニットレコード番号。TIL, 腫瘍浸潤リンパ球.(1)組織は、滅菌メス刃(0.5〜1mm3 枚)で、90mmシャーレ内で機械的にできるだけ細かく刻む。(2)腫瘍片を、オルガノイド培地、コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ、DNase 1からなる酵素解離培地に再懸濁する。(3)細切された腫瘍組織および酵素溶液を回転器インキュベーター(150rpm、37°C、5%CO2)上で1〜2時間インキュベートし、続いてペレット化して(4)断片をより微細な細胞懸濁液に解離させる。サンプルは、プリウェット可逆性(5)100 μmおよび(6)37 μmストレーナーを新しい50 mLチューブにろ過し、大きな不溶性物質を除去し、37-100 μmクラスターを単離します。(7)37μmストレーナーの逆から単離した画分の遠心分離に続いて、細胞集塊を(8)BMEおよびオルガノイド培地に懸濁し、(9)生細胞イメージングを行う。BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オルガノイド樹立のための滅菌腫瘍組織の取り扱い。 (A)切除および実験室への輸送時に、標本を滅菌シャーレに入れ、秤量し、続いて解剖する。(B)試料分解グリッドは、様々なプロセスのために試料をマークするために使用される。解剖の例を(C)に示し、腫瘍周辺部からサンプルを採取して中心壊死の領域をできるだけ避け、(D)組織固定前に組織をグロスする前に注釈を付け(差し込み)する。スケールバー:6ミリメートル。(E)小さな新鮮な断片を、その後の凍結およびバイオバンキングのために採取する。スケールバー:5ミリメートル。このイメージの要素は、BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:膀胱腫瘍オルガノイドの酵素的誘導および動的集合(A)ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色された親膀胱癌組織の代表的な写真(病理学はT3bN0としてレビュー)即時固定(左)および1xコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼによる消化後2時間(右)。スケールバー:500μm。(B)>100μm、37-1および70-1(2日目)単離の代表的な画像。スケールバーは画像内に表示されます。(C)48時間および7日目のオルガノイドH&E染色にわたる膀胱癌オルガノイド単離の代表的な画像が示されている。スケールバー:50μm。差し込み図の画像のスケール バー: 20 μm. DIC: 微分干渉コントラスト。この画像の要素は BioRender.com で作成されました この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。
図4:膀胱癌由来オルガノイド培養物は、親腫瘍の組織学的構造を維持している。 低悪性度膀胱癌(Ta)の代表的なH&E画像および培養7日目におけるオルガノイドの対応する明視野画像。右端のパネルは、7日目のオルガノイドの関連するH&E染色を示す。スケールバーは図に示されています。LG:低悪性度、BC:膀胱癌、H&E:ヘマトキシリンおよびエオジン、およびDIC:差動干渉コントラスト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:膀胱癌患者由来オルガノイドを用いた下流用途。 BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 添加物 | ファイナルコンク | ストックコンク | 溶媒 | |
| 基礎メディア | グルタマックス | 2ミリオンユーロ | 1 M | ナクル |
| ヘーペス | 10ミリオンメートル | 1 M | NaCl/NaHPO4 緩衝溶液 | |
| 完全な媒体のための補足 | R-スポンジン 1 馴化培地 | 5% v/v | コンディショニングメディア | アドバンスト DMEM/F-12 |
| ノギン条件付けメディア | 5% v/v | コンディショニングメディア | アドバンスト DMEM/F-12 | |
| ティッカー | 50 ng/mL | 0.5 ミリグラム/mL | PBS/0.1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/mL | 100 μg/mL | PBS/0.1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/mL | 50 μg/mL | PBS/0.1% BSA | |
| ニコチンアミド | 10ミリオンメートル | 1 M | 1 g in 8.2 mL ddH20 | |
| N-アセチル-L-システイン | 1.25 ミリアン ペア月間 | 500ミリアンペア月間 | 40 mL ddH20 | |
| A 83-01 | 0.5 μM | 50ミリオンメートル | ティッカー | |
| SB202190 · | 10 μM | 50ミリオンメートル | ティッカー | |
| Y27632 · | 10 μM | 100ミリアンペア月間 | ddH20 | |
| B-27 添加剤 | 1倍速 | 50倍速 | ||
| プロスタグランジンE2 | 1 μM | 10ミリオンメートル | ティッカー | |
| プリモシン | 100 μg/mL | 50ミリグラム/ミリリットル | ||
表1:基底および完全オルガノイド培地に使用されるサプリメント
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Discussion
膀胱癌組織に由来する3Dオルガノイドプロトコルはまだ初期段階にありますが、活発な研究と臨床研究の分野です。ここでは、NMIBC検体とMIBC検体の両方に適した膀胱癌PDOを首尾よく確立するための最適化されたプロトコルが詳述されている。このワークフローは、病院ベースの臨床試験に並行して統合され、組織学的サンプル処理や臨床オルガノイドパイプラインの重要な考慮事項である新鮮な凍結組織バンキングなど、バイオバンクサンプルの見越計上を考慮します。このプロトコルは、既存の方法に基づいて構築され、オルガノイド精密医療パイプラインを構築するための統合された方法論を提供します。
このプロトコルの現在の成功率は、他のプロトコルと同様に約70%です25。これは、膀胱癌腫瘍微小環境の単離技術および特性評価が進化するにつれて改善されることが期待される。予想通り、最初の試料の品質は成功率に影響を与え、重要な制限ステップです。化学療法のナイーブ患者から得られた検体は最も高い成功率を提供するが、ネオアジュバント化学療法を受けた患者の検体は生細胞数が減少している可能性がある26,27。典型的には、(TURBTおよび膀胱切除術の両方からの)膀胱癌検体は、高い腫瘍細胞性を有する十分な量の試料を提供する。これにより、24~72時間の成長期間内に30~100 μmの範囲のオルガノイドを堅牢に生成できます(ろ過ステップで約<40 μmのクラスターが保持されます)。重要なことに、オルガノイドサンプルにおいて観察される不均一性(すなわち、嚢胞形成およびより緻密な構造)は、このプロトコールが不均一な腫瘍細胞集団を導出するのに適した条件を提供することを示す。
当社の最適化されたプロトコルは、限られた出発物質(TURBT手順や臨床試験で患者から取得した検体など、一部の選択的手術の場合と同様)に対して実行することができ、複数の分析を組み込んで検体価値を最大化することができます。このプロトコールは、最初の濾過ステップ中に処理された大きな不溶性組織に存在する可能性のある関心のある無関係な腫瘍細胞から2D培養を増殖させるステップを記述する方法を含む。術後24時間以内に標本を処理することを示唆する他の研究グループと同様に、28,29、この時間枠内に起こる組織低酸素症は、生存可能なオルガノイドの生成を妨げるものではないことが観察される。ウェルあたりの細胞(ネイティブクラスター)播種の密度を決定するには、最適化が必要です。私たちの経験では、過剰な数のクラスターは培養物の成長不良をもたらす可能性があり、視覚密度の低い培養は細胞死につながる可能性があります。これは、必要に応じて範囲内で希釈することができるそれらの体積の文脈において、ユーザによって経験的に決定され得る。さらに、TURBT標本には、切除プロセスのために焼けた縁が含まれることが多く、これは顕著な壊死領域として明らかである。重要なステップは、巨視的な腫瘍組織の慎重な単離とその後の解剖である。これは、実行可能な培養物を導き出す上で最も重要であり、外科チームと連絡を取る必要があります。場合によっては、これが手順に対する最初の制限である可能性があります。
現在の技術に対するさらなる制限は、オルガノイドに平行な腫瘍微小環境の欠如である。必要な開発は、細胞の複雑さを増大させ、腫瘍微小環境の他の構成要素(すなわち、間質および免疫細胞)を提供する将来の共培養システムである。オルガノイドは、その増殖を自己永続する能力を有する自己組織化構造として定義されるので、インビトロ増殖特性の改善を可能にする可能性のある離散的な癌幹細胞(CD44およびCD49など)を解明するためにさらなる研究が必要となる31、32、33。PDOが腫瘍組織に由来することを確実に確立することは、機能的および分子的分析における正常な尿路上皮細胞からの寄与が薬物耐性の調査を混乱させるため、重要である。PDOにおける尿路上皮細胞の腫瘍起源は、転移性組織または乳頭腫瘍の使用により明らかである場合があるが(ここでの場合のように;図4参照)、発生源組織が膀胱粘膜から切除され、したがって良性尿路皮の縁を含む場合、得られたPDOが分子技術を用いて腫瘍細胞からなることを確認することが重要である。したがって、確立されたオルガノイドとそれらが由来する原発巣との間の免疫組織化学的およびゲノム的比較が必要である30。
ウェルあたりのオルガノイドの数とサイズ分布に関しては、細胞毒性解析のために3Dオルガノイドの均一なメッキ密度を維持することは困難である。これは、フィルターを使用して定義された範囲を分離することによってわずかに軽減されますが、小さなクラスターと大きなオルガノイドが同じウェル内で分離されている場合、依然として制限があります。大型粒子選別機はこの問題を緩和するかもしれないが、医学研究所では広く利用できない。それにもかかわらず、治療前および治療後の生存率シグナルを測定する技術は、膀胱癌オルガノイド34において首尾よく使用されている。この技術が進歩するにつれて、研究者は、さまざまなゲノムプロファイルと、新しい治療法を調査するために探索できる薬力学的応答を有する膀胱癌PDOのライブラリを開発することができます。さらに、本明細書に記載の検体採取手順および解離法は、腫瘍空間プロファイリング、マルチパラメトリックフローサイトメトリー、および単一細胞RNAシーケンシングのための同時調製を可能にする。まとめると、これにより、患者の腫瘍の不均一性と免疫療法などの薬物の適用可能性を探るためにまとめることができる多様な強力なエンドポイントが可能になります。
要約すると、我々は、精密医療エンドポイントの出現における3D患者由来の膀胱癌オルガノイドの培養を確立し、評価するためのプロトコルを記述する。ここで説明する手順と注意事項は、私たちの研究室で膀胱がんPDOを単離するために使用される日常的なアプローチであることに注意することが重要です。我々の手順で使用された培養培地は、もともと前立腺癌細胞について記載され、現在では膀胱癌の培養に適していることが証明されている。重要なことに、このプロトコルは集中型であり、実験室での日常的な使用に適しており、泌尿器科がんタイプ全体に広く適用可能である。忠実度の高い分子表現型および薬物応答エンドポイントと組み合わせて、この技術は、膀胱癌患者の正確な治療管理を迅速に探求するための有用なツールを提供する。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は、トランスレーショナル・リサーチ・インスティテュート組織学コア・生物資源ファシリティの技術支援を認める。この研究は、プリンセス・アレクサンドラ・リサーチ・ファウンデーション賞(I.V.、E.D.W.)および医学研究未来基金(MRFF)ラピッド・アプライド・リサーチ・トランスレーション・プログラム(Center for Personalized Analysis of Cancers(CPAC;E.D.W.、I.V.)。トランスレーショナル・リサーチ・インスティテュートはオーストラリア政府から支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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