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Neuroscience

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Abstract

Le cil primaire est un organite de signalisation critique trouvé sur presque toutes les cellules qui transduit les stimuli de signalisation Hedgehog (Hh) de la surface cellulaire. Dans le précurseur des cellules granulaires (GCP), le cilium primaire agit comme un centre de signalisation pivot qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs en modulant la voie de signalisation Hh. L’étude de la machinerie de signalisation Hh primaire dépendante du cilium est facilitée par la manipulation génétique in vitro des composants de la voie pour visualiser leur localisation dynamique vers le cilium primaire. Cependant, la transfection des transgènes dans les cultures primaires de GPC à l’aide des méthodes d’électroporation actuellement connues est généralement coûteuse et entraîne souvent une faible viabilité cellulaire et une efficacité de transfection indésirable. Cet article présente un protocole d’électroporation efficace, rentable et simple qui démontre une efficacité de transfection élevée d’environ 80 à 90% et une viabilité optimale des cellules. Il s’agit d’une méthode de modification génétique simple, reproductible et efficace qui est applicable à l’étude de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium dans les cultures primaires de BPC.

Introduction

Les GCP cérébelleux sont largement utilisés pour étudier la machinerie de la voie de signalisation Hh dans les types de cellules progénitrices neuronales en raison de leur grande abondance et de leur grande sensibilité à la voie de signalisation Hh in vivo1,2,3,4. Dans les GCP, le cilium primaire agit comme un pivot de transduction du signal Hh5 qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs6,7,8. La visualisation in vitro des composants de signalisation Hh sur le cil primaire est souvent difficile en raison de leurs faibles niveaux basaux endogènes. Par conséquent, la modification transgénique des niveaux d’expression des protéines et le marquage fluorophore du gène d’intérêt sont des approches utiles pour étudier la voie à résolution moléculaire. Cependant, la manipulation génétique des cultures primaires GCP à l’aide d’approches de transfection à base de liposomes entraîne souvent une faible efficacité de transfection, ce qui entrave la poursuite des investigations moléculaires9. L’électroporation augmente l’efficacité, mais nécessite généralement des réactifs d’électroporation exorbitants spécifiques au fournisseur et au type de cellule10.

Cet article présente une méthode d’électroporation à haute efficacité et rentable pour manipuler les composants de la voie de signalisation Hh dans les cultures primaires GCP. En utilisant ce protocole d’électroporation modifié, un transgène lissé marqué par une protéine fluorescente verte (GFP) (pEGFP-Smo) a été efficacement administré aux GPC et a atteint des taux élevés de survie cellulaire et de transfection (80-90%). En outre, comme en témoigne la coloration immunocytochimique, les GCP transfectés ont montré une grande sensibilité à l’activation de la voie de signalisation Hh induite par les agonistes lissés par le trafic de l’EGFP-Smo vers les cils primaires. Ce protocole est directement applicable et bénéfique pour les expériences qui impliquent une modification génétique in vitro de types cellulaires difficiles à transfecter, tels que les cultures de cellules primaires humaines et de rongeurs, ainsi que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.

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Protocol

Toutes les procédures liées aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de manipulation des animaux et au protocole approuvé par le ministère de la Santé de Hong Kong. Les licences d’expérimentation animale conformément à l’ordonnance sur les animaux (contrôle des expériences) (cap. 340) ont été obtenues auprès du ministère de la Santé du gouvernement de Hong Kong. Le travail sur les animaux a été effectué conformément à l’éthique de la sécurité animale approuvée par le bureau de recherche et le comité de sécurité des laboratoires de la HKBU. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation préalable à l’expérience

  1. Préparation des milieux de culture et des tampons
    1. Milieu sans sérum (MDF)
      1. Pour préparer 50 mL de SFM, ajouter 500 μL de 100x substitut de L-glutamine, 500 μL de pénicilline-streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium et 12,5 μL de 1 M KCl (250 μM final) à 49 mL de milieu neurobasal.
      2. Diviser le SFM en 2 aliquotes de 10 mL et 40 mL dans des tubes coniques de 50 mL et les conserver à 4 °C pendant un mois.
    2. Milieu bloquant la digestion: 10% FBS dans SFM
      1. Ajouter 1,1 mL de FBS inactivé par la chaleur à une aliquote de 10 mL de GDF pour préparer le milieu bloquant la digestion.
    3. Milieu de culture GCP : SFM avec B27
      1. Pour préparer le milieu de culture GCP, ajouter 800 μL de supplément de B-27 sans sérum à une aliquote de 40 mL de GDF.
        REMARQUE: La GDF supplémentée en B-27 peut être conservée à 4 °C jusqu’à un mois. Cependant, les médias fraîchement préparés produisent des résultats optimaux.
    4. Tampon de dissection: EBSS avec glucose + HEPES
      1. Ajouter 6 g/L de glucose à la solution saline équilibrée d’Earle (EBSS) sans calcium et magnésium contenant 10 mM d’HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique).
      2. Stériliser la solution en passant à travers un filtre à seringue de 0,2 μm et la conserver à 4 °C pour un stockage à long terme.
    5. Tampon de digestion
      REMARQUE: Préparer fraîchement avant utilisation.
      1. Préparer 2 mL de tampon de digestion pour la digestion de 2-4 tissus cérébelleux et 4 mL pour 4-10 tissus. Pour préparer 4 mL de tampon de digestion, dissoudre 1,5 mg de L-cystéine (concentration finale 200-400 μg/mL) dans 4 mL d’EBSS. Inverser le tube à plusieurs reprises jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute.
      2. Stériliser la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm et d’une seringue de 5 mL, puis transférer la solution dans une boîte de culture cellulaire stérile de 35 mm.
      3. Ajouter 4 μL de papaïne (dilution 1:1 000 à partir d’une concentration sur le stock de 20 unités/mg) et 40 μL de DNase I (dilution 1:100 à partir d’un stock de 10 mg/mL pour une concentration finale de 0,1 mg/mL).
      4. Incuber la solution à 37 °C dans un incubateur à CO2 pendant au moins 30 min ou jusqu’à utilisation.
        REMARQUE: Cette étape est essentielle pour activer la papaïne. Pour des résultats optimaux, ne pas dépasser 45 min à 37 °C avant utilisation. Assurez-vous que la solution devient transparente et qu’il n’y a pas de précipités blancs avant utilisation.
  2. Revêtements de pré-revêtement
    1. Pour préparer les couvercles pour la fixation cellulaire, incuber des couvercles en verre autoclavés de 12 mm avec 100 μg/mL de poly-D-lysine (PDL, 1 mg/mL dans du dH2O stérile) pendant au moins 1 h à 37 °C. Conserver les couvercles dans la même solution PDL à 4 °C jusqu’à utilisation.
    2. Le jour de la culture cellulaire primaire, recueillir le PDL dans un tube conique propre et rincer les couvercles trois fois avec du dH2O stérile à fond pour éliminer le PDL résiduel.
      REMARQUE: Le PDL peut être stocké à 4 °C pour être réutilisé.
    3. Transférez les couvercles de verre revêtus de PDL sur une plaque de 24 puits en plaçant un couvercle dans chaque puits.
    4. Retirer l’excès d’eau et ajouter 200-300 μL de Matrigel (reconstitué selon les instructions de la fiche technique du produit en DMEM-F12 sans sérum) pour couvrir complètement les couvercles.
    5. Incuber les couvercles dans le Matrigel pendant 1 h à 37 °C dans l’incubateur à CO2 .
      REMARQUE: Retirez le Matrigel avant l’ensemencement cellulaire. Ce Matrigel peut être collecté et stocké à 4 °C pour de multiples réutilisations.
  3. Préparation du plat de culture de préplaquage
    1. Enduire une boîte de culture cellulaire de 60 mm avec 2 mL de 100 μg/mL PDL (reconstituer la solution mère de PDL de 1 mg/mL dans du dH2O stérile) par incubation à 37 °C pendant 1 h.
    2. Immédiatement avant l’ensemencement cellulaire, retirez et collectez la PDL usagée dans un tube conique propre et conservez-la à 4 °C pour de multiples réutilisations. Rincez et lavez le plat enrobé de PDL trois fois avec du dH2O stérile. Séchez à l’air libre le plat de culture avant l’ensemencement cellulaire.
    3. Utilisez une boîte de culture cellulaire de 60 mm pour ensemencer des cellules récoltées à partir d’un maximum de 2 tissus de cervelet entier.
    4. Préparez des plats de culture supplémentaires pour des cervelets supplémentaires.
      REMARQUE: Voir les étapes 2.1.18 et 2.1.19 pour l’utilisation de la boîte de culture de préplaçage.

2. Jour expérimental 0

  1. Isolement et culture des GCP primaires de souris
    REMARQUE: La méthode de culture GCP a été modifiée à partir d’un protocole standard, et le protocole bref a été brièvement décrit dans nos travaux précédents6,11,12. Pour un rendement optimal en BPC, utilisez des petits postnatals (P) jour 6 ou P7 pour l’isolement des BPC. Effectuez les étapes de dissection suivantes 2.1.6-2.1.10 le plus rapidement possible pour une viabilité cellulaire optimale.
    1. SFM préchaud, milieu bloquant la digestion, milieu de culture et Opti-MEM à 37 °C pendant la dissection.
    2. Sur un banc propre, préfiler tout l’appareil de dissection dans de l’éthanol à 70% pour la désinfection.
    3. Remplissez un plat de culture cellulaire de 60 mm avec 2 à 3 mL de tampon de dissection et refroidissez-le sur de la glace.
    4. Préparer un tampon de digestion frais comme décrit à la rubrique 1.1.5 et le maintenir au chaud à 37 °C.
    5. Utilisez 70% d’éthanol pour essuyer la tête du chiot pour la désinfection.
    6. Décapiter le chiot sans anesthésie. Utilisez des pinces pour tenir la tête et des ciseaux chirurgicaux stérilisés pour couper à l’arrière du crâne pour décapiter le chiot. Retirez soigneusement la peau et le crâne pour découvrir le cerveau à l’aide d’une pince.
    7. Utilisez une pince pour pincer le cervelet et le tremper rapidement dans le tampon de dissection prérefroidi préparé à l’étape 2.1.3.
    8. Retirez les méninges avec le cervelet immergé dans le tampon de dissection sous un microscope à dissection. Les méninges enrichies en vaisseaux sanguins doivent apparaître rosâtres sous le microscope disséquant.
    9. Retirez toutes les méninges à l’aide d’une pince.
      REMARQUE: Un cervelet sans méninges devrait avoir un aspect blanchâtre.
    10. Enlevez tous les tissus visibles du mésencéphale et le plexus choroïde du cervelet.
    11. Transférer le cervelet dans un plat de culture de 35 mm prérempli avec un tampon de digestion chaud préparé à l’étape 2.1.4. Évitez de transférer un tampon de dissection en excès. Coupez le cervelet en fins morceaux à l’aide de ciseaux à microbrassoirs le plus rapidement possible.
    12. Incuber immédiatement le cervelet haché à 37 °C pendant 15 min dans un incubateur à CO2 . Prolongez le temps d’incubation à 20 min si plus de 4 cervelets doivent être traités.
      REMARQUE: Après l’incubation, le tissu s’agglutine.
    13. Transférer immédiatement le tissu digéré au fond d’un nouveau tube de centrifugeuse stérile de 15 mL à l’aide d’une préhumidification de la pointe de pipette P1000 avec un milieu bloquant la digestion (éviter de transférer un tampon de digestion).
    14. Ajouter un volume approprié de milieu bloquant la digestion (1 mL pour 1 cervelet) pour terminer la digestion et pipeter doucement 30 fois à l’aide d’une micropipette P1000 pour dissocier davantage le tissu en une suspension unicellulaire. Évitez la formation de bulles d’air.
    15. Passez doucement la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube de centrifugeuse stérile pour éliminer les amas cellulaires.
    16. Passer 1 mL supplémentaire de milieu bloquant la digestion fraîche à travers la passoire cellulaire pour recueillir les cellules résiduelles de la passoire cellulaire.
    17. Centrifuger le filtrat à 200 × g pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille avec 1 mL de GDF. Répétez cette étape deux fois. Évitez de former des bulles d’air.
    18. Remettre en suspension la pastille dans un volume final de 2 mL de milieu de culture GCP et transférer la suspension cellulaire dans la boîte de culture de préplaçage de 60 mm revêtue de PDL préparée à l’étape 1.3. Incuber pendant 15 min à 37 °C dans un incubateur à CO2 .
      REMARQUE: Ne pas dépasser 20 min.
    19. Après l’incubation, tapotez le plat de culture sur le côté pour déloger les cellules GCP faiblement adhérentes. Recueillir les cellules GCP adhérentes dans un milieu de culture par pipetage doux à l’aide d’une pipette P1000. Collectez cette suspension GCP dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 mL. Jeter le plat de 60 mm.
      REMARQUE: Les cellules astrogliales et fibroblastiques fortement adhérentes resteront attachées sur le fond de la boîte de 60 mm et seront séparées dans cette étape. L’omission de cette étape compromettra la pureté de la culture GCP.
    20. Comptez les cellules et procédez immédiatement à l’électroporation.
  2. Jour in vitro (DIV) 0 : Électroporation pour la surexpression du transgène du récepteur Hh : pEGFP-Smo
    1. Pour l’électroporation à l’aide d’une cuvette à intervalles de 2 mm, préparer le mélange d’électroporation plasmidique-cellule suivant pour chaque réaction d’électroporation : 1,2 × 106 cellules et 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuster la concentration du stock d’ADN à ~2-5 μg/μL dans le tampon Tris-EDTA ou le dH2O stérile) dans 100 μL d’Opti-MEM.
      REMARQUE: Réduisez le nombre total de cellules si les cellules sont insuffisantes (bien que cela puisse réduire l’efficacité de l’électroporation). Cependant, n’ajustez pas la quantité de plasmide ni le volume total d’Opti-MEM utilisé par cuvette. Si le nombre total de cellules requis pour l’expérience dépasse 1,5 × 106 cellules, augmentez le mélange d’électroporation en conséquence et effectuez plusieurs réactions d’électroporation séparément. La cuvette peut être réutilisée jusqu’à 5 fois.
    2. Préparer la plaque d’ensemencement de la cellule post-électroporation en ajoutant 0,5 mL de milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture de 24 puits contenant des couvercles enduits (à partir de l’étape 1.2) et la maintenir au chaud à 37 °C dans un incubateur à CO2 .
    3. À partir de l’étape 2.1.20, pipeter le nombre requis de cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et filer à 200 × g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL d’Opti-MEM. Répétez cette étape deux fois avec Opti-MEM pour vous assurer qu’aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le tube.
      REMARQUE: Pour chaque puits / couvercle d’une plaque de 24 puits, électroporate et graine 1,2-1,3 × 106 cellules / puits pour obtenir ~ 70-75% de confluence cellulaire le lendemain de la culture.
    4. Définissez les paramètres d’électroporation comme indiqué dans le tableau 1.
    5. Pipettez doucement la réaction d’électroporation pour bien mélanger et utilisez une longue pointe P200 pour transférer un volume exact de 100 μL du mélange dans la cuvette à espace de 2 mm. Évitez de former des bulles.
    6. Placez la cuvette dans la chambre de la cuvette.
    7. Appuyez sur le bouton Ω de l’électroporateur (voir le tableau des matériaux) et notez la valeur d’impédance, qui doit être ~ 30-35. Pour vous assurer que la valeur d’impédance électrique Ω se situe dans la plage de 30-35, respectez un volume précis de 100 μL.
    8. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer l’impulsion.
    9. Enregistrez les valeurs du courant mesuré et des joules indiqués sur le cadre de lecture.
    10. Retirez la cuvette de la chambre de la cuvette.
    11. Ajouter immédiatement 100 μL de milieu de culture préavertissé dans la cuvette et le remettre en suspension en pipetant doucement de haut en bas 2 à 3 fois. Transférer immédiatement la suspension de la cellule dans la plaque de 24 puits préparée à l’étape 2.2.2.
      REMARQUE: Pour minimiser la mort cellulaire, ensemencez les cellules immédiatement après l’électroporation.
    12. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à CO2 . Laissez les cellules intactes pendant 3 h pour éviter le détachement cellulaire.
    13. À 3 h après l’ensemencement, aspirer doucement et jeter la moitié du milieu surnageant pour éliminer les cellules mortes flottantes et les débris et les remplacer par la même quantité de milieu de culture préavertis.
    14. Incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur à CO2 et reconstituer la moitié du milieu tous les deux jours.
    15. Observez les cellules sous le microscope à fluorescence le lendemain, c’est-à-dire DIV1 (Figure 1) pour le signal GFP afin de déterminer l’efficacité de la surexpression Smo.
    16. Pour la stimulation de la voie de signalisation Hh sur DIV 1 après avoir reconstitué la moitié du milieu, ajoutez 0,2 μM d’agoniste lissé (SAG) aux cellules tout en ajoutant un volume égal de DMSO au contrôle. Incuber pendant 24 h avant la fixation des cellules.
      REMARQUE: Gardez le volume de DMSO / SAG ajouté aussi bas que possible. Ici, 0,5 μL de DMSO ou 0,5 μL de 0,2 mM de SAG a été ajouté pour 500 μL de milieu par puits, ce qui représente un taux de dilution de 1:1 000.

3. DIV 2 : Visualisation des cils primaires et étude de la voie de signalisation Hh

  1. Fixation des cellules
    1. 24 h après le traitement, retirez le milieu de culture et rincez les cellules 2 à 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette Pasteur jetable tout en évitant de déloger les cellules.
    2. Fixez les cellules en ajoutant ~400 μL de paraformaldéhyde à 4% (préparé dans du PBS) et incubez à RT pendant 10 min.
    3. Rincer et laver 2-3 fois avec PBS à l’aide d’une pipette Pasteur jetable.
    4. Conserver dans le PBS à 4 °C jusqu’à 2 mois ou procéder à l’immunocoloration.
  2. Coloration immunocytochimique des GCP et du marqueur primaire du cilium
    1. Dans une assiette de 24 puits, laver les cellules deux fois dans pbS en agitant doucement pendant 5 minutes à chaque fois.
    2. Ajouter 0,5 mL de chlorure d’ammonium de 100 mM à la cellule et incuber à RT pendant 10 min pour éteindre le fixateur.
    3. Rincez une fois et lavez 2-3 fois avec PBS en secouant doucement pendant 10 minutes à chaque fois.
    4. Pipettez doucement 30 μL de tampon bloquant (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% de sérum de cheval inactivé par la chaleur dans PBS) sur un morceau de parafilm pour former une gouttelette sans bulles d’air.
    5. Transférez doucement le couvercle du puits sur la gouttelette BB avec le côté ensemencé vers le bas. Incuber les cellules avec BB dans une chambre humide pendant 1 h à RT.
    6. Préparez le mélange d’anticorps primaires en BB comme indiqué dans le tableau des matériaux. Pour sonder les cellules avec des anticorps primaires, répétez les étapes 3.2.4 et 3.2.5, en remplaçant BB par le mélange d’anticorps primaires. Incuber les cellules avec l’anticorps primaire pendant 2 h à TA.
    7. À l’aide d’une pince, transférez les couvercles vers la plaque de 24 puits avec le côté ensemencé vers le haut. Rincez les cellules une fois et lavez 3-4 fois dans pbS en secouant doucement pendant 10 minutes à chaque fois.
    8. Préparez le mélange d’anticorps secondaires en BB comme indiqué dans le tableau des matériaux. Pour incuber les cellules avec l’anticorps secondaire, répétez les étapes 3.2.4 et 3.2.5, en remplaçant BB par le mélange d’anticorps secondaires. Incuber dans l’obscurité pendant 1 h à RT.
    9. Répétez l’étape 3.2.7 pour le lavage postsecondaire de l’incubation d’anticorps.
    10. Montez le couvercle sur une glissière de verre microscopique propre à l’aide d’un support de montage.
    11. Séchez la lame à l’air libre dans l’obscurité pendant la nuit et passez à l’imagerie confocale13.

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Representative Results

En utilisant l’Opti-MEM (voir le tableau des matériaux) comme réactif universel, cette méthodologie d’électroporation proposée pourrait atteindre une efficacité d’électroporation constamment élevée à ~ 80-90% (Figure 1). L’efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP a été déterminée à DIV 2 après l’électroporation par quantification du pourcentage de cellules vertes à fluorescence positive dans toutes les cellules GCP exprimant la protéine 6 de la boîte appariée (Pax6). L’efficacité d’électroporation des groupes traités par DMSO et SAG semblait comparable (figure 1 et tableau 2).

En outre, l’immunocoloration du marqueur primaire du cilium, Arl13b, démontre que le taux de ciliation des BPC à div 2 de la culture était d’environ 18 % dans les groupes traités par véhicule et par SAG (DMSO : 17,35 % ± 0,59 % ; SAG: 18,24% ± 0,88%). Le taux de ciliation est illustré par le pourcentage de GCP exprimant Pax6 portant un cilium primaire (Arl13b-positif) à la surface de la cellule à DIV 2 après électroporation (Figure 2 et Tableau 3).

Pour déchiffrer la voie de signalisation Hh dépendante du cilium primaire, un agoniste de Smo, SAG, a été utilisé pour activer la voie de signalisation Hh. Lors de l’activation de la voie Hh, le récepteur Smo est enrichi au niveau de l’axoneme du cilium primaire14. Nos résultats montrent une augmentation significative de la localisation de Smo-EGFP sur l’axoneme de cilium primaire des cellules GCP exprimant Pax6 à 24 heures après le traitement SAG (Figure 3, données de quantification modifiées par rapport aux travaux précédents6), indiquant une activation profonde de la voie de signalisation Hh primaire dépendante du cilium.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de l’électroporation et efficacité de l’électroporation des GCP. (A) Configuration de l’électroporation. À droite, la pointe de flèche noire indique une cuvette d’électroporation. (B, C) Des images représentatives illustrent l’efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP déterminée par la quantification du pourcentage de cellules GFP positives dans toutes les cellules GCP exprimant Pax6 (tableau 2). Des images représentatives représentent les signaux fluorescents verts sur les cellules GCP exprimant Pax6 (violet) sur DIV 2 post-électroporation après 24 heures de traitement avec (B) DMSO et (C) SAG. Les noyaux ont été marqués avec DAPI (bleu). Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : GCP = précurseurs de cellules granulaires; GFP = protéine fluorescente verte; Pax6 = protéine de boîte appariée-6; DIV = jour in vitro; DMSO = diméthylsulfoxyde; SAG = Agoniste lissé; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Pourcentage de ciliation sur div 2 de la culture primaire GCP. (A, B) Des images représentatives représentent le pourcentage de ciliation sur DIV 2 de la culture primaire GCP. Des images représentatives représentent les cils primaires (verts) sur les cellules GCP exprimant Pax6 (rouges) sur DIV 2 après électroporation après 24 heures de traitement par (A) DMSO et (B) SAG. Les noyaux ont été marqués avec DAPI (bleu). Le cil primaire (vert) est désigné par des pointes de flèches blanches. Barres d’échelle = 20 μm. (C) Le graphique illustre les données de quantification de 4 expériences indépendantes. Analyse statistique, Test t de l’étudiant non apparié. Les barres d’erreur représentent ±SEM. Abréviations: GCP = précurseur de cellules granulaires; Pax6 = protéine de boîte appariée-6; DIV = jour in vitro; DMSO = diméthylsulfoxyde; SAG = Agoniste lissé; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; n.s. = Non significatif; SEM = erreur-type de la moyenne; Arl13b = protéine de type facteur de ribosylation ADP 13B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Augmentation de la localisation du Smo sur le ciliium primaire des cellules GCP exprimant Pax6 lors du traitement SAG. (A) Des images représentatives représentent la localisation du Smo-EGFP (vert) sur le cilium primaire (rouge, boîte carrée blanche) sur les cellules GCP exprimant Pax6 (violet) à DIV 2 après électroporation après 24 h de traitement par DMSO et SAG. Les noyaux ont été marqués avec DAPI (bleu). Barres d’échelle = 5 μm. (B) Le graphique illustre les données de quantification de 4 expériences indépendantes. Analyse statistique, test t de Student non apparié. P ≤ 0,001. Les barres d’erreur représentent ± SEM. Total n pour le groupe DMSO = 97, total n pour le groupe SAG = 130. La figure 3B a été modifiée par rapport à la figure 6. Abréviations : GCP = précurseur de cellules granulaires; Smo = Lissé; Pax6 = protéine de boîte appariée-6; DIV = jour in vitro; DMSO = diméthylsulfoxyde; SAG = Agoniste lissé; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; SEM = erreur-type de la moyenne; Arl13b = protéine de type facteur de ribosylation ADP 13B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Réglage de l’impulsion de poring Réglage de l’impulsion de transfert
GCP primaires de souris Neurones primaires GCP primaires de souris Neurones primaires
Tension 275 V 275 V 20 V 20 V
Longueur 1 ms 0,5 ms 50 ms 50 ms
Intervalle 50 ms 50 ms 50 ms 50 ms
Non. 2 2 5 5
Taux D 10% 10% 40% 40%
Polarité + + ± ±

Tableau 1 : Paramètres d’électroporation des GCP primaires de souris et des neurones primaires utilisant Super Electroporator NEPA21 TYPE II. Abréviation : GCP = précurseur de cellules granulaires.

Efficacité de l’électroporation Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) Moyenne
Groupe traité par DMSO 90,57 % ± 10,12 % 96,62 % ± 3,09 % 98,89 % ± 0,97 % 90,72 % ± 11,31 % 94,02 % ± 1,36 %
Groupe traité par SAG 91,8 % ± 8,69 % 79,97 % ± 2,77 % 89,35 % ± 5,67 % 88,59 % ± 13,54 % 87,42 % ± 1,71 %
Efficacité moyenne de l’électroporation 91,31 % ± 7,99 % 88,27 % ± 10,81 % 94,12 % ± 6,36 % 89,65 % ± 11,21 % 90,84 % ± 0,84 %

Tableau 2: Efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP déterminée par quantification du pourcentage de cellules GFP positives dans toutes les cellules GCP exprimant Pax6. Les données de quatre expériences indépendantes (Exp.) sont présentées. (Total n = 2980). Abréviations: Smo = Lissé; GFP = protéine fluorescente verte; GCP = précurseur de cellules granulaires; Pax6 = protéine de boîte appariée-6.

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 moyenne
Taux de ciliation - DMSO 18,88 % ± 3,61 % 19,58 % ± 7,42 % 16,60 % ± 1,48 % 14,35 % ± 7,99 % 17,35 % ± 0,59 %
Taux de ciliation - SAG 13,93 % ± 3,39 % 17,30 % ± 2,15 % 22,19 % ± 10,35 % 19,56 % ± 1,15 % 18,24 % ± 0,88 %

Tableau 3 : Pourcentage de ciliation sur la DIV 2 de la culture primaire GCP. Les données de quatre expériences indépendantes (Exp.) sont présentées. (Total n pour le groupe DMSO = 1169, Total n pour le groupe SAG = 816). Abréviations : GCP = précurseur de cellules granulaires; DIV = jour in vitro; DMSO = diméthylsulfoxyde; SAG = Agoniste lissé.

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Discussion

La transfection de transgènes en culture primaire de BPC par électroporation est généralement associée à une faible viabilité cellulaire et à une faible efficacité de transfection9,10. Cet article présente un protocole d’électroporation rentable et reproductible qui a démontré une efficacité et une viabilité élevées. En outre, nous démontrons également une méthode simple d’étude de la voie de signalisation Hh dépendante du cilium primaire dans les cellules GCP primaires.

D’autres méthodes d’électroporation courantes nécessitent souvent des réactifs d’électroporation coûteux spécifiques au type de cellule qui doivent être achetés auprès de fabricants spécifiques. La méthode décrite ici est jugée favorable car elle utilise un réactif d’électroporation commun et économique pour différents types de cellules. De plus, ces données ont montré que l’efficacité de l’électroporation atteignait environ 80 à 90%, ce qui est très efficace par rapport aux autres méthodes d’électroporation et de transfection9,10.

Pour maintenir une viabilité cellulaire plus élevée, il y a quelques étapes critiques que l’on devrait prendre en considération. Les procédures de dissection et de dissociation du cervelet doivent être effectuées dans les plus brefs délais de 1 à 2 h. Une autre étape critique consiste à éviter la formation de bulles dans le mélange d’électroporation plasmidique-cellule avant les impulsions pendant l’électroporation. Après les légumineuses, le milieu de culture préavertis doit être ajouté immédiatement dans les cuvettes et les cellules ensemencées le plus rapidement possible. Les cellules ne doivent pas être perturbées dans les 3 premières heures suivant l’ensemencement cellulaire. Les précautions susmentionnées amélioreront la viabilité cellulaire jusqu’à environ 70 à 80% le deuxième jour de culture.

Une limitation notable de l’étude du cilium primaire dans la plate-forme de culture primaire est que le taux de ciliation dans les cellules cultivées est généralement inférieur à celui observé in vivo. Les données précédentes 6 ont montré que le taux de ciliation in vivo sur GCP à E15,5 et P15 était d’environ 60-80%. En revanche, le taux de ciliation in vitro dans la culture primaire de BPC était d’environ 20 %6. Néanmoins, il s’agit d’un phénomène général qui est perceptible dans la plupart (sinon tous) les types de cellules lorsque l’on compare le taux de ciliation entre les études in vitro et in vivo .

Notamment, cette méthode est également applicable à d’autres cultures primaires telles que les cellules progénitrices neurales et la culture de neurones corticaux et hippocampiques, ce qui est réalisable en modifiant le paramètre d’électroporation, c’est-à-dire la tension, la longueur et le nombre d’impulsions poreuses. Afin d’étendre l’application de ce protocole à un champ d’étude plus large, les paramètres d’électroporation recommandés pour les neurones primaires sont fournis dans le tableau 1. En outre, le réactif universel d’électroporation, c’est-à-dire Opti-MEM utilisé dans ce protocole, permet également d’éviter un effort d’optimisation fastidieux supplémentaire par rapport à d’autres protocoles d’électroporation qui nécessitent une optimisation en ce qui concerne la compatibilité des réactifs. Ce protocole d’électroporation optimisé et rentable pour l’étude de la signalisation primaire du cilium et de l’Hh dans les cultures primaires de BPC pourrait être utilisé comme procédure de référence pour d’autres études primaires liées au cilium utilisant des cultures primaires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par le HKBU Seed Fund et la Subvention de démarrage de niveau 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), le Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) à C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

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References

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Neurosciences Numéro 177 Cils primaires précurseur de granules cérébelleux électroporation in vitro voie de signalisation Hedgehog culture primaire de GCP Smoothened
Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires
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Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C.… More

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

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