CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) haben sich als wichtige zelluläre Regulatoren (Tumorsuppressoren, pro-onkogene Faktoren) von Krebs und Metastasen herausgestellt. Die meisten veröffentlichten Studien konzentrieren sich auf eine einzelne miRNA, wenn es darum geht, die Rolle kleiner RNAs bei Krebs zu charakterisieren. ~ 30% der menschlichen miRNA-Gene sind jedoch in geclusterten Einheiten organisiert, die oft co-exprimiert werden, was auf ein komplexes und koordiniertes System der nicht-kodierenden RNA-Regulation hinweist. Eine klarere Untertreibung der Art und Weise, wie geclusterte miRNA-Netzwerke kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Krebsaggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, ist erforderlich, bevor nicht-kodierende kleine RNAs in die Klinik übersetzt werden.

Die Verwendung eines CRISPR-vermittelten Gen-Editing-Verfahrens (High-Throughput-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde eingesetzt, um die onkogene Rolle eines genomischen Clusters von sieben miRNA-Genen zu untersuchen, die sich in einem Locus mit einer Länge von ~ 35.000 bp im Zusammenhang mit Prostatakrebs befinden. Für diesen Ansatz wurden humane Krebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor für Doxycyclin (DOX)-induzierbare Cas9-Nuklease infiziert, der 48 h lang in DOX-haltigem Medium gezüchtet wurde. Die Zellen wurden anschließend mit synthetischer transaktivierender CRISPR-RNA (tracrRNA) ko-transfiziert, die mit genomischen ortsspezifischen CRISPR-RNA (crRNA)-Oligonukleotiden komplexiert wurde, um die schnelle Erzeugung von Krebszelllinien zu ermöglichen, die die gesamte miRNA-Clusterdeletion und einzelne oder kombinierte miRNA-Gencluster-Deletionen innerhalb eines einzigen Experiments tragen.

Die Vorteile dieses Hochdurchsatz-Gen-Editing-Systems sind die Möglichkeit, zeitaufwändiges Subklonen von DNA-Vektoren zu vermeiden, die Flexibilität bei der Transfektion von Zellen mit einzigartigen Guide-RNA-Kombinationen in einem 24-Well-Format und die kostengünstigere PCR-Genotypisierung mit Rohzelllysaten. Studien, die diesen optimierten Ansatz verwenden, versprechen, funktionelle Redundanzen und synergistische/antagonistische Interaktionen zwischen miRNA-Clustermitgliedern aufzudecken, was dazu beitragen wird, die komplexen kleinen nicht-kodierenden RNA-Netzwerke zu charakterisieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, und das zukünftige therapeutische Design besser zu informieren.

Introduction

Bessere Forschungsinstrumente sind erforderlich, um den Beitrag nicht-kodierender RNAs bei menschlichen Krankheiten zu untersuchen. MiRNA-Dysregulation wird häufig bei menschlichen Erkrankungen wie Krebs beobachtet, wenn die Expressionsprofile dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Geweben und Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin) von Krebspatienten mit Nicht-Krebspatienten, gesunden Personen, unter Verwendung von Microarrays, quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und Tiefensequenzierungstechnologien der nächsten Generation verglichen^{werden 1,2} . Jüngste Arbeiten haben eine große Teilmenge dieser miRNAs als Tumorsuppressor-, onkogene und Metastasenfaktoren charakterisiert, die die Tumorbildung, das Fortschreiten der Krankheit und die Arzneimittelresistenz kontrollieren. Experimentelle Überexpression und/oder Herunterregulierung/Verlust von miRNAs führen zu funktionellen und pleiotropen Konsequenzen in der Zelle, die das breite Spektrum der krebsassoziierten Aktivitäten widerspiegeln, die diese nicht-kodierenden RNAs koordinieren - Wachstum, Apoptose, Differenzierung, Chromatin-Remodeling, Angiogenese, epitheliale zu mesenchymale (EMT) und MET-Übergänge, Metabolismus und Immunantwort³.

MiRNAs werden als einzelne Gene kodiert oder befinden sich in genomischen Clustern, die im Zellkern transkribiert und umfassend verarbeitet werden, bevor sie die biologisch ausgereiften, einzelsträngigen ~ 22 Nukleotid (nt) miRNA-Spezies erzeugen, die im Zytoplasma^{lokalisiert sind 4}. Diese kleinen RNAs üben ihre Wirkung posttranskriptionell aus und fungieren als negative Genregulatoren, die sequenzspezifisch an Boten-RNA (mRNA)-Ziele binden, um den katalytischen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) an die mRNA-Stelle zu bringen, was zu einem mRNA-Abbau und/oder einem Block in der Proteintranslation führt. MiRNAs sind eine extrem häufige Klasse von nicht-kodierenden RNAs in tierischen Systemen, und 2.654 reife miRNAs existieren im menschlichen Genom (miRBase release 22.1)⁵. MiRNAs assoziieren typischerweise mit unvollständiger Komplementarität zu ihren mRNA-Zielen⁴. Daher kann eine einzelne miRNA Dutzende bis Hunderte von verschiedenen mRNA-Zielen regulieren und funktionell eine große Bandbreite biologischer Signalwege beeinflussen. Um die Komplexität von miRNA-basierten Mechanismen zu erhöhen, kann eine einzelne mRNA durch mehrere, unterschiedliche miRNAs reguliert werden. Es ist daher schwierig zu untersuchen, wie die miRNA-Dysregulation das homöostatische Gleichgewicht des Körpers stört und zu menschlicher Malignität führt.

Die Mehrheit der veröffentlichten Studien hat sich bei der Charakterisierung ihrer Rolle bei Krankheitsereignissen auf eine einzelne miRNA konzentriert. ~ 30% der menschlichen miRNA-Gene sind jedoch in geclusterten Einheiten (typischerweise ~ 10 Kilobasen [kb]) organisiert, die oft in der gleichen Orientierung transkribiert und co-exprimiert werden, was auf ein koordiniertes und komplexes System der nicht-kodierenden RNA-Regulation⁶ hinweist. Der größte polycistronische humane miRNA-Cluster ist der 14q32-Cluster mit 54 miRNA-Vorläufern. Eine der am besten untersuchten geclusterten miRNA-Einheiten, die mit menschlichen Krebserkrankungen assoziiert sind, ist der polycistronische miR-17-92-Cluster, bestehend aus miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 und miR-92-1, die sich in Intron 3 der nichtkodierenden RNA c13orf25 befinden. Der miR-17-92-Cluster wird häufig bei hämatopoetischen Malignomen verstärkt und bei soliden Tumoren überexprimiert und hat onkogene Rollen bei der Förderung der Zellzyklusprogression, Apoptose und Angiogenese^{etabliert 7}. Darüber hinaus wird der tumorsuppressive miR-15a- und miR-16-1-Cluster, der sich im Intron des nicht-kodierenden Gens Leu2 befindet, häufig bei Leukämien gelöscht und bei einer Vielzahl von Krebsarten herunterreguliert, wodurch das Tumorwachstum blockiert wird, indem es auf das antiapoptotische Gen BCL2 und zusätzliche Zellzyklus-Progressionsgene⁸ abzielt. Der miR-888-Cluster ist bei Patienten mit hochgradigem Prostatakrebs erhöht und besteht aus sieben miRNA-Genen (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b und -891a), die sich auf dem menschlichen Chromosom Xq27.3 ^9,10 befinden.

Der miR-888-Cluster bildet sich innerhalb des HPCX1-Locus (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) über Xq27-2 ab, der durch Verknüpfungsanalyse der Stammbäume der erblichen Prostatakrebsfamilie 11,12,13,14,15,29 identifiziert wurde. Die funktionelle Charakterisierung einzelner miR-888-geclusterter Mitglieder unter Verwendung herkömmlicher miRNA-Fehlexpressionswerkzeuge - miRNA-Mimics und Antisense-Inhibitoren - zeigte, dass diese miRNAs überlappende Rollen bei der Regulierung des Wachstums und der Invasion von Prostatatumoren spielen ^9,10. Diese experimentellen Methoden eignen sich jedoch nicht leicht für die Untersuchung, wie mehrere miR-888-Clustermitglieder synergistisch oder antagonistisch in einem nicht-kodierenden RNA-Netzwerk handeln, um die Gewebehomöostase und das Fortschreiten von Krebs zu kontrollieren. Dieses beschriebene optimierte Protokoll mit Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Technologie wird modifiziert, um molekular miRNA-Cluster zu sezieren, die mit menschlichen Krebsarten assoziiert sind (z. B. miR-888-Cluster), um diese Wissenslücke zu schließen.

Bakterielle CRISPR- und CRISPR-assoziierte (cas) Gene vermitteln adaptive Immunität gegen Bakteriophagen¹⁶. Die Entdeckung dieses uralten prokaryotischen Überwachungssystems wurde schnell als effizientes wissenschaftliches Werkzeug angepasst, um leicht jeden gewünschten genomischen Locus anzusprechen und DNA-Sequenzänderungen in einer Vielzahl von Tiersystemen und Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo vorzunehmen ^16,17. Diese Technik ist vielversprechend als effektive Methode, um miRNA-Netzwerke im Kontext menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Protokoll zur Untersuchung des miR-888-Clusters, der ~ 35 kb auf dem menschlichen Chromosom X in immortalisierten menschlichen Prostatakrebszelllinien (LNCaP, PC3-ML) umfasst, konstruiert, um zu untersuchen, wie Clustermitglieder Krebsprogressionswege koordinieren. Dieser Ansatz kann auf die Charakterisierung jedes miRNA-Clusters angewendet werden und ermöglicht es den Forschern, schnell menschliche Zelllinien zu erzeugen, die die gesamte miRNA-Cluster-Deletion und einzelne und kombinierte miRNA-Gen-Cluster-Deletionen innerhalb eines einzigen Experiments tragen.

Bei diesem Verfahren werden stabile Zelllinien mit einem Doxycyclin (DOX)-induzierbaren lentiviralen Expressionssystem hergestellt, das es dem Prüfarzt ermöglicht, die Streptococcus pyogenes CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 (csn1)- Genexpression durch den konstitutiven DOX-induzierbaren Promotor TRE3G zu kontrollieren. Das zweiteilige Tet-On 3G-System beinhaltet einen konstitutiven menschlichen Dehnungsfaktor 1 alpha (hEF1alpha) -Promotor, um die Transkription sowohl des Tet-On 3G-Gens als auch des Blasticidin-Resistenzgens (Blast^R) als bizistronisches Transkript voranzutreiben. Das Tet-On 3G-Transaktivatorprotein bindet nur in Gegenwart von DOX an den TRE3G-Promotor , was zu einer robusten Cas9-Transkription führt. In Abwesenheit von DOX gibt es keine oder nur einen sehr minimalen basalen Cas9-Ausdruck. Daher kann der Prüfarzt während der CRISPR-Gen-Editing-Schritte eine hohe Cas9-Proteinproduktion in Zellen induzieren, die in mit DOX ergänzten Medien gezüchtet wurden, und die Kontrolle für eine schnelle CAS9-Protein-Clearance beim DOX-Entzug.

Dieses Protokoll beschreibt auch das Design von synthetischen CRISPR-RNA (crRNA)-Oligonukleotiden, die auf Regionen abzielen, die den gesamten miRNA-Cluster, einzelne miRNA-Haarnadelregionen (premiRNA) und/oder Untergruppen von miRNA-Genen innerhalb des Clusters flankieren. Jede entworfene crRNA enthält eine einzigartige 5'-terminale 20-nt-Leitliniensequenz (komplementär zur genomischen Sequenz von Interesse), gefolgt von einer invarianten 22 nt S. pyogenes Wiederholungssequenz (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), die eine Basenpaarung mit den universellen transaktivierenden CRISPR RNA (tracrRNA) Oligonukleotiden¹⁸ ermöglicht. Zusammen fungieren die geglühte crRNA und die tracrRNA (gemischtes 1:1-Verhältnis) als Leit-RNA für dieses Protokoll (Abbildung 1A). In jedem Experiment werden zwei synthetische Leit-RNAs in DOX-induzierte Zellen transfiziert, um das bakterielle Cas9-Protein mit den genomischen DNA-Stellen (5' und 3') zu assoziieren und zu eskortieren, die die zur Entfernung angestrebte miRNA-Clusterregion flankieren (Abbildung 1B).

Eine Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Sequenz (5'-NGG-3' für Wildtyp S. pyogenes Cas9) muss im Zellgenom vorhanden sein und sich unmittelbar neben der 20-nt-DNA-Sequenz befinden, auf die die Leit-RNA¹⁷ abzielt. Die PAM-Sequenz dient als Bindungssignal und positioniert die katalytische Region des Endonuklease-Cas9-Enzyms auf der anvisierten genomischen DNA-Stelle, was anschließend zu einer gerichteten, doppelsträngigen (ds) DNA-Spaltung führt, die sich ~ 3 nt vor dem PAM befindet. Die DNA-Reparaturmaschinerie der Zelle repariert die gespaltenen DNA-Enden, was zu einer perfekten Ligatur führen kann, aber oft tritt eine nichthomologe Endverbindung (NHEJ) auf, was zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels) an der Reparaturstelle führt. Da miRNAs nicht-kodierende Gene sind, die sich häufig in intergenen und intronischen Regionen befinden, bergen diese Indels ein geringes Risiko, unerwünschte Unsinns- / Missense-Mutationen zu erzeugen.

Durch den Einsatz von synthetischen RNA-Oligonukleotiden (geglühte crRNA und tracrRNA, Molverhältnis 1:1), die für den Leit-RNA-Komplex in diesen Experimenten kodieren, vermeidet diese Gen-Knockout-Strategie zeitaufwändiges DNA-Vektor-Subkloning und ermöglicht eine enorme Flexibilität bei der Transfizierung einzigartiger Leit-RNA-Kombinationen zu Zellen in einem 24-Well-Format. Die Herstellung von Rohzelllysaten für das PCR-Genotyp-Screening vermeidet auch teure und zeitaufwändige DNA-Aufreinigungsmethoden und ermöglicht gleichzeitig eine optimierte Einzelkolonie-Zellliniengenerierung und phänotypische Analyse. Tatsächlich wurde dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Protokoll erfolgreich eingesetzt, um kultivierte Prostatakrebs-Zelllinien (LNCaP, PC3-ML) mit 32 einzigartigen Guide-RNA-Kombinationen in einem einzigen Experiment zu transfizieren und Knockout-Linien zu erzeugen, die Deletionen für die gesamte ~ 35 kb miR-888-Clusterregion tragen; kleinere Löschkombinationen für miR-888-Clustermitglieder, die zu den Familien miR-743 und miR-891a gehören; sowie Deletionen für einzelne miRNA-Mitglieder innerhalb des miR-888-Clusters. Studien wie diese werden eine klarere Untertreibung darüber liefern, wie geclusterte miRNAs kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Aggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, bevor miRNAs als therapeutische und diagnostische Werkzeuge in die Klinik übertragen werden.

Protocol

1. Vorbereitung für die CRISPR-Genbearbeitung und das RNA-Leitdesign zur Generierung von miRNA-Cluster-Knockout-Zelllinien

1. Erstellen Sie eine DNA-Datei, die die vollständige genomische Sequenz der interessierenden miRNA-Clusterregion (intergen, intronic) und mindestens 1 kB der umgebenden genomischen Regionen enthält, indem Sie eine DNA-Sequenz-Annotationssoftware¹⁹ verwenden.
   1. Verwenden Sie ein Feature-Editing-Tool in der erstellten DNA-Datei, um den Ziel-miRNA-Cluster-Locus (intergen, intronic) und jede einzelne miRNA-Haarnadelsequenz, die zum miRNA-Cluster gehört, zu markieren und andere nahe gelegene kodierende und nicht-kodierende Gene und/oder regulatorische Merkmale^5,20,21,22 zu notieren.
   2. Stellen Sie sicher, dass die miRNA-Regionen, die für die Deletion vorgesehen sind, nicht versehentlich benachbarte proteinkodierende Gene, nichtkodierende Gene oder wichtige regulatorische DNA-Elemente stören.
      HINWEIS: Berücksichtigen Sie die genomische Komplexität (z. B. Chromosomenduplikationen / Fusionen) der in diesem Protokoll verwendeten Zelllinie.
2. Entwerfen Sie synthetische crRNAs, die auf 20 NT genomischer DNA-Sequenz abzielen, die den gesamten miRNA-Cluster, einzelne miRNA-Haarnadelregionen (Pre-miRNA) und/oder Untergruppen von miRNA-Genen innerhalb des Clusters mit einem bioinformatischen Leitfaden-RNA-Design-Softwaretool (z. B.²³). Stellen Sie sicher, dass das entsprechende Cas9-Enzym im Leit-RNA-Design-Tool notiert ist (d. h. S. pyogenes Cas9).
   HINWEIS: Die synthetisierte crRNA wird diese einzigartige 5'-terminale 20-nt-Leitsequenz (komplementär zum DNA-Ziel) enthalten, gefolgt von einer invarianten 22 nt S. pyogenes Wiederholen Sie die Sequenz, um eine Basenpaarung mit dem synthetisierten universellen tracrRNA-Oligonukleotid zu ermöglichen. Zusammengeglüht fungieren sie als Leit-RNA in diesem Protokoll.
   1. Verweisen Sie auf die erstellte DNA-Datei (Schritt 1.1.) und geben Sie ~ 150 nt DNA-Sequenz ein, die sich unmittelbar vor (5') oder stromabwärts (3') des miRNA-Haarnadel-/Clusterlocus befindet, der zur Deletion bestimmt ist, in das RNA-Design-Softwaretool²³ des bioinformatischen Leitfadens.
      HINWEIS: Das Design-Tool identifiziert eindeutige 20-nt-Sequenzen für das crRNA-Oligonukleotid-Design, die sich unmittelbar neben der PAM-Sequenz (auf dem nicht zielgerichteten DNA-Strang) befinden (z. B. S. pyogenes Cas9 PAM-Sequenz NGG). Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für ein crRNA-Design, das auf eine Stelle unmittelbar vor (5') des mir-891a-Genlocus abzielt (insbesondere 5A( 891a ), die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" und in Tabelle 1 erörtert wird).
      1. Öffnen Sie den Leitfaden RNA-Design-Software-Tool²³.
      2. Geben Sie im Fenster Name eingeben den Namen 5A(891a) ein.
      3. Geben Sie im Fenster DNA-Sequenz eingeben 150 nt der genomischen Sequenz ein, die sich unmittelbar vor (5') des Vorläufergens mir-891a befindet: 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTTCTCTTTTTCTCTTTTTCTCTTTTTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Spezifitätsprüfung aktivieren , um Off-Targeting-Websites auszuschließen, die vom Programm rechnerisch erkannt wurden. Wählen Sie den geeigneten Organismus (d.h. den Menschen [Homo sapiens]).
      5. Geben Sie das richtige Cas9-Enzym PAM an, das für die Studien verwendet wurde, in diesem Fall Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, um die folgenden Standardeinstellungen zu generieren: PAM relativ zum Ziel: Nachher; Wiederholung der Sequenz: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Relativ zu Guide: 3; Zielsequenzlänge: 20; Schnitt relativ zum Ziel 5' Start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter, um die Ergebnisse für die synthetische crRNA-Synthese anzuzeigen.
         HINWEIS: In diesem Beispiel erkennt die vorgeschlagene zu synthetisierende crRNA das DNA-Ziel ATACATGCTGATAGTTACAC und befindet sich neben PAM:AGG.
   2. Verweisen Sie auf die DNA-Datei (erstellt in Schritt 1.1.), um die besten Kandidaten-crRNA 20-nt-Zielsequenzen zu bestimmen, die sich am nächsten am zu löschenden miRNA-Locus befinden und die höchste Spezifität für das beabsichtigte genomische Ziel besitzen.
      1. Verwenden Sie computergestützte Off-Targeting-Analysewerkzeuge, um die spezifische Spezifität des Kandidaten-crRNA zu bewerten und potenzielle Off-Targeting-Stellen in genomischen Loci vorherzusagen, die nicht mit der interessierenden Region des Ziel-miRNA-Clusters zusammenhängen (z. B. ^24,25,26,27).
      2. Aufzeichnung potenzieller Off-Targeting-Ergebnisse zur späteren Referenz bei der Genotypisierung von klonalen Einzelkolonie-CRISPR-Zelllinien mittels PCR (Schritt 4.2.6.).
         HINWEIS: Das Ausmaß der Sequenzkomplementarität, die zwischen dem entworfenen crRNA-Oligonukleotid und der genomischen Zielsequenz geteilt wird, bestimmt, wie selektiv das Cas9-Enzym das Genom an diesem Ort spaltet. Da die Leit-RNA in einer 3' bis 5'-Richtung zum genomischen Ziel annekt, blockieren Mismatches am 5'-Ende der DNA-Zielsequenz (die ersten 8-10 Basen) oft die Cas9-vermittelte Spaltung. Wenn die genomische Zielsequenz die Homologie mit einem anderen genomischen Locus teilt, außer innerhalb der ersten acht Basen der DNA-Sequenz, wird vorhergesagt, dass diese Leit-RNA eine geringe Chance hat, an dieser Stelle ein Off-Targeting durchzuführen.
      3. Entwerfen Sie vier einzigartige crRNAs für jeden anvisierten miRNA-Locus: zwei entworfene crRNAs, um komplementäre DNA-Sequenzen sofort 5' der miRNA-Haarnadel/des miRNA-Clusters (5'A, 5'B) anzusprechen, und zwei entworfene crRNAs, um komplementäre DNA-Sequenzen sofort 3' der miRNA-Haarnadel/des miRNA-Clusters (3'A, 3'B) anzusprechen.
         HINWEIS: Bei der Durchführung der CRISPR-Transfektionen (in Abschnitt 3) werden vier mögliche 5'- und 3'-Leit-RNA-Paarkombinationen (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) für jeden anvisierten miRNA-Locus getestet, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, erfolgreiche miRNA-Locus-Deletionen in einem einzigen Experiment zu erzeugen.
      4. Verwenden Sie ein Feature-Bearbeitungswerkzeug in der erstellten DNA-Datei (Schritt 1.1.), um die DNA-Zielsequenz (mit angrenzendem PAM) für jede entworfene crRNA zu markieren, die synthetisiert werden soll.
3. Entwerfen und synthetisieren Sie PCR-Primer (vorwärts, rückwärts), die die anvisierten miRNA-Clusterregionen für die Genotypisierung von CRISPR-Zelllinien flankieren (und markieren Sie die Primer in der erstellten DNA-Datei).
   1. Für die Genotypisierung von Zelllinien, die kleine genomische Deletionen für eng geclusterte oder einzelne miRNAs tragen, entwerfen Sie PCR-Primer (vorwärts, rückwärts), die sich auf jeder Seite der Cas9-Spaltstelle / Knockout-Region befinden und sowohl den Nachweis der Wildtyp- (~ 600 bp) als auch der Knockout- (~ 300 bp) DNA-Fragmente in einer einzigen PCR-Reaktion über Gelelektrophorese ermöglichen.
   2. Für die Genotypisierung von Zelllinien, die große genomische Deletionen für miRNA-Vorläuferkombinationen oder den gesamten miRNA-Cluster tragen, entwerfen Sie erneut PCR-Primer (vorwärts, rückwärts), die sich auf jeder Seite der Cas9-Spaltungs- / Knockout-Stelle etwa 150 bp befinden. Beachten Sie, dass, wenn sich die gezielte miRNA-Clusterdeletion über > 4 kb erstreckt, die PCR-Reaktion wahrscheinlich nur das kleinere (~ 300 bp) Knockout-DNA-Fragment erkennt, aber nicht das Wildtyp-DNA-Fragment. Entwerfen Sie daher zusätzliche PCR-Primer (vorwärts, rückwärts), die das Vorhandensein oder Fehlen von internen miRNA-Cluster-Genen erkennen können, um den Screening-Prozess zu unterstützen und für homozygote Knockout-Zelllinien zu validieren.

2. Generierung stabiler lentiviraler Zelllinien, die die DOX-induzierbare Cas9-Expressionskassette tragen

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkultur- und Virusarbeiten in einer zertifizierten Biosicherheitshaube mit BSL2-Verfahren und aseptischer Technik durch.

1. Bestimmen Sie den geeigneten Zelllinientyp für die CRISPR-Studien und bevorzugte Wachstumsmedien.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die humanen Prostatakrebszelllinien LNCaP (bevorzugtes Medium: RPMI, 10% fetales Rinderserum [FBS]) und PC3-ML (bevorzugtes Medium: DMEM, 10% FBS) entwickelt.
2. Führen Sie eine Blasticidin-"Todeskurve" durch, um die optimale Wirkstoffkonzentration zu bestimmen, die für Lentivirus-infizierte Zellen ausgewählt werden soll, die die Blasticidin-Resistenz-Genkassette tragen (Schritt 2.3.).
   1. Plattenzellen in 11 Vertiefungen einer 24-Well-Platte und wachsen bei 37 °C, 5% CO₂ im bevorzugten Medium bis etwa 75% zusammenfließen.
   2. Das Blasticidin (Arbeitsmaterial 1 mg/ml) wird im bevorzugten Medium mit einer Endkonzentration von 0, 1 bis 10 μg/ml verdünnt und in Schritten von 1 μg/ml verdünnt.
   3. Beschriften Sie die Vertiefungen der ausgesäten 24-Well-Platte von 1 bis 11. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch die entsprechenden Blasticidin-Konzentrationen.
   4. Wechseln Sie das Medium mit den entsprechenden Blasticidin-Konzentrationen jeden zweiten Tag für 7-10 Tage.
   5. Untersuchen Sie die Zellen täglich während des Zeitverlaufs und bestimmen Sie die minimale Blasticidin-Konzentration, die erforderlich ist, um alle Zellen innerhalb von 5-7 Tagen abzutöten.
      HINWEIS: Für jede spezifische Zelllinie, die für die CRISPR-Gen-Editing-Experimente verwendet wird, muss eine Blasticidin-"Kill"-Kurve durchgeführt werden.
3. Infizieren Sie die Zellen mit Lentiviren, die die DOX-induzierbare Cas9-Expressionskassette tragen, und führen Sie eine Blasticidin-Selektion mit der in Schritt 2.2 bestimmten optimalen Konzentration durch.
   1. In drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte werden 5 × 10⁴ Zellen pro Well entkernt und im bevorzugten Medium bei 37 °C 5% CO 2 über Nacht (ON) gezüchtet_.
   2. Am nächsten Tag tauen Sie den Lentivirus-Expressionsvektor für DOX-induzierbares Cas9 (Lenti-iCas9) auf Eis auf. Vorsichtig mischen (keine Viruspartikel überwirbeln).
      HINWEIS: Lagern Sie das Lentivirus in Aliquots bei -80 ° C, um mehrere Frost- / Tauzyklen zu vermeiden, die die Virustiter und die Infektionseffizienz verringern.
   3. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 5 × 10 4 Zellen mit Virus bei einer Infektionsvielfalt von 0,3 (MOI = 0,3⁾ basierend auf der viralen Titerkonzentration zu transduzieren.
   4. Das entsprechende Virusvolumen wird in 250 μL (pro Well) des serumfreien und antibiotikafreien bevorzugten Mediums pipettiert, ergänzt mit 0,8 μg/ml Hexadimethrinbromid. Sanft mischen.
      HINWEIS: Hexadimethrinbromid ist ein kationisches Polymer, das die virale Adsorptions- und Infektionseffizienz erhöht.
   5. Entfernen Sie das Medium. Das 250 μL des vorbereiteten Transduktionsmediums mit Lenti-iCas9-Virus (MOI = 0,3) in die Zellen geben und ON bei 37 °C, 5% CO₂ inkubieren. (Verkürzen Sie die Inkubationszeit auf 4-6 h, wenn die Zellen virusbedingte toxische Wirkungen aufweisen.)
   6. Ersetzen Sie das Medium durch frisches bevorzugtes Medium und lassen Sie die Zellen sich für 1-2 Tage erholen.
   7. Führen Sie die Blasticidin-Selektion an den infizierten Zellen für 10-14 Tage unter Verwendung der optimalen Blasticidin-Konzentration durch, die aus der in Schritt 2.2 beschriebenen "Kill"-Kurve abgeleitet ist.
      1. Parallel dazu züchten die nicht infizierten Zellen in Medium mit der optimalen Blasticidin-Konzentration, um als Positivkontrolle für die Virusselektion verwendet zu werden.
   8. Wechseln Sie das mit der optimalen Blasticidinkonzentration ergänzte Medium während des Selektionszeitverlaufs alle 3 Tage, um abgestorbene Zellen zu entfernen.
      HINWEIS: Nur Zellen, die die Blasticidin-Selektion überleben, haben den lentiviralen Vektor integriert.
   9. Erweitern Sie die von Blasticidin ausgewählten Lenti-iCas9-Zelllinien.
      HINWEIS: Notieren Sie sich bei jeder Erweiterung die Zellpassagennummer.
      1. Einen Teil der Lenti-iCas9-Zellen in bevorzugtem Medium einfrieren, ergänzt mit 10%igem Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Langzeitlagerung von Kryozellen.
      2. Analysieren Sie einen Teil der Lenti-iCas9-Zellen mit Western Blot^9, um die Zelllinie mit den robustesten DOX-induzierbaren Cas9-Proteinspiegeln zu identifizieren (siehe Schritt 2.3.).
4. Führen Sie eine Doxycyclin-Konzentrationskurve an neu etablierten Lenti-iCas9-Zelllinien durch, um die optimalen Bedingungen für die Induktion von Cas9-Proteinen zu bestimmen.
   1. Richten Sie vier unabhängige 6-Well-Platten für jede getestete Zelllinie ein, um diesen DOX-Konzentrationszeitverlauf durchzuführen. Platte 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung jeder 6-Well-Platte und wachsen bei 37 °C, 5_{% CO 2} im bevorzugten Medium für 24 h.
   2. Verdünnen Sie DOX (Arbeitsmaterial 1 mg/ml) im bevorzugten Medium mit einer endgültigen DOX-Konzentrationskurve von 0, 50, 100, 150, 250 bis 500 ng/ml.
   3. Beschriften Sie die Vertiefungen jeder ausgesäten 6-Well-Platte von 1 bis 6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch die entsprechenden DOX-Konzentrationen. Wachsen Sie die Platten 1-4 bis zu den folgenden Zeitpunkten: 24 h, 48 h und 72 h DOX-Induktion; und 120 h nach DOX-Entzug (zunächst 72 h DOX-induziert).
   4. Ernten Sie die Vertiefungen der Platte zu jedem Zeitpunkt mit geeigneten Methoden (z. B. Trypsinisierung). Lagern Sie die Zellpellets bei -80 °C. Verarbeiten Sie die Zellpellets im RIPA-Puffer zur Lysatisolierung und Cas9-Western-Blot-Analyse.
      1. Lassen Sie 40 μg Zelllysat für jede Probe des DOX-Induktionszeitverlaufs mit einem denaturierenden 4%-12% Bis-Tris-Gel laufen und übertragen Sie die Proteine auf eine Immunoblot-Membran.
      2. Hybridisieren Sie die Immunoblot-Membran mit einem primären Antikörper gegen Cas9, um das 160-kDa-Protein nachzuweisen. Normalisieren Sie den Cas9-Spiegel mit einem Housekeeping-Gen wie GAPDH (37 kDa).
   5. Basierend auf den Western Blot-Ergebnissen bestimmen Sie die optimale DOX-Konzentration, um Cas9 in den Lenti-iCas9-Zelllinien zu induzieren.
      HINWEIS: Dieser Zeitkurs wird auch zeigen, wie streng der Cas9-Ausdruck bei 120 h Post-DOX-Entfernung reguliert wird.
   6. Etablierung von Einzelzellkolonien für die Lenti-iCas9-Zelllinien mit robuster Cas9-Proteinexpression zur Optimierung der CRISPR-Transfektionen (Abschnitt 3).

3. Durchführung von CRISPR-Reaktionen durch Cas9-Induktion und synthetische Leit-RNA-Transfektion von Zellen unter Verwendung eines Hochdurchsatzformats

HINWEIS: Ein Workflow-Diagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Kartieren Sie auf Papier die crRNA-Paarkombinationen, die in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte transfiziert werden, die auf den gesamten miRNA-Cluster, verschiedene geclusterte miRNA-Genkombinationen sowie einzelne miRNA-Clustermitglieder abzielt.
   1. Beschriften Sie auf der Karte vier Vertiefungen pro anvisiertem miRNA-Locus. Lassen Sie jede Bohrung eine Transfektionsreaktion darstellen, wobei zwei einzigartige crRNAs 5' und 3' des gewünschten miRNA-Knockout-Genomlokus und der tracrRNA (geglühtes 1:1-Molverhältnis) positioniert sind.
   2. Stellen Sie sicher, dass jede der vier markierten Vertiefungen ein eindeutiges crRNA-Paar für die Transfektion darstellt (z. B. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      HINWEIS: Das Design von zwei 5' crRNAs und zwei 3' crRNAs, die jeden anvisierten miRNA-Locus flankieren (Abschnitt 1), ermöglicht die Erzeugung von vier möglichen 5'- und 3'-Leit-RNA-Paaren in der Transfektionsreaktion.
2. Die Lenti-iCas9-Zelllinie wird mit 5 x 10 4 Zellen/Well einer 24-Well-Platte im bevorzugten Medium beschichtet, das die optimierte DOX-Konzentration enthält (bestimmt in Schritt^2.4 .). Züchten Sie die Zellen für 24-48 h bei 37 ° C, 5% CO_2, um die Cas9-Proteinexpression zu induzieren.
3. Transfizieren Sie die Lenti-iCas9-Zellen mit den präparierten 5'- und 3'-Leit-RNAs.
   1. Rekonstituieren Sie die synthetisierten crRNA- und tracrRNA-Oligonukleotide mit nukleasefreiem Wasser auf eine Stammkonzentration von 10 μM. Langfristig bei -80 °C lagern.
   2. Beschriften Sie vier 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pro anvisiertem miRNA-Locus basierend auf der in Schritt 3.1. entworfenen experimentellen Abbildung, die die vier möglichen 5'- und 3'-crRNA-Paarkombinationen darstellt (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'B).
   3. Mischen Sie in jeder Röhre ein 1:1-Molverhältnis von tracrRNA und einzigartigen crRNAs (5' und 3') zusammen, um den 2 μM-Leit-RNA-Komplex unter Verwendung der folgenden Reaktion (Endvolumen von 10 μL) zu bilden:
      1. 2,5 μL tracrRNA (10 μM Stamm), 1,25 μL der 5' positionierten crRNA (10 μM Stamm), 1,25 μL der 3' positionierten crRNA (10 μM Stamm) und 5 μL 10 mM TRIS-HCL PH 7,5 zu einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen hinzufügen. Mikrozentrifuge für 30 s bei 16.000 × g zum Mischen . 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   4. Zu jedem Röhrchen werden 40 μL reduziertes Serummedium (z. B. Opti-MEM) zu der 10 μL Leit-RNA-Komplexreaktion (50 μL Gesamtvolumen) hinzugefügt. Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen.
   5. In einem sauberen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen werden 2 μL des Transfektionsreagenzes 28 (siehe ANMERKUNG 3.3.5.1.) und⁴⁸ μL reduziertes Serummedium (z. B. Opti-MEM, Endvolumen von 50 μL) vorsichtig durch Pipettieren nach oben und unten gemischt. 5 min bei RT inkubieren.
      1. Bereiten Sie eine Mastermischung des Transfektionsreagenzes vor, indem Sie die Mengen des Reagenzes (2 μL) und des reduzierten Serummediums (z. B. Opti-MEM, 48 μL) mit der Anzahl der zu transfektierenden Vertiefungen plus 10% zusätzliches Volumen multiplizieren, um leichte Pipettierungenauigkeiten zu berücksichtigen.
         HINWEIS: Wählen Sie ein Transfektionsreagenz, das für kleine RNA- und CRISPR-RNA-Oligonukleotid-Transfektionen sowie für die Zelllinie Typ²⁸ optimiert ist.
   6. Zu jedem Röhrchen, das die 50 μL Leit-RNA-Mischung enthält (aus Schritt 3.3.4.), werden die 50 μL des verdünnten Transfektionsreagenzes (aus Schritt 3.3.5.) zugegeben. Pipettieren Sie die Mischung einmal langsam auf und ab, um sie zu mischen. 20 min bei RT inkubieren.
   7. 400 μL antibiotikafreies Medium, ergänzt mit DOX (optimale Konzentration), in jedes Röhrchen geben, das die 100 μL der Leit-RNA/Transfektionsmischung enthält. Zum Mischen vorsichtig pipettieren.
4. Entfernen Sie das Medium aus den DOX-induzierten Lenti-iCas9-Zellen (Schritt 3.2.). Fügen Sie 500 μL Medien-/DOX-/Leit-RNA/Transfektionsmischung hinzu, basierend auf der experimentellen Karte der 24-Well-Platte (Schritt 3.1.). Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 48 h bei 37 °C, 5% CO₂.
5. Ersetzen Sie das Medium durch das frische bevorzugte Medium ohne DOX (um Cas9-Protein aus den Zellen zu entfernen). Lassen Sie die Zellen für weitere 24-48 h bei 37 ° C, 5% CO₂ erholen.
6. Ernten Sie die transfizierten Zellen (Trypsinisierung) und bereiten Sie sich auf Genotypisierung und Einzelzellverdünnungen vor.
   HINWEIS: Zellen stellen eine gemischte Population dar, die transfizierte CRISPR-Gen-editierte und nicht transfizierte Wildtyp-Zellen enthält. Dieser Schritt bestimmt die Effizienz der CRISPR-Bearbeitung, bevor Zeit / Ressourcen in die Expansion von Einzelzellkolonien investiert werden.
   1. Waschen Sie die Zellen 1x mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Inkubieren Sie die Zellen in 100 μL Trypsin für 5 min bei 37 °C, 5% CO₂ und übertragen Sie die Zellen in ein sauberes 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, das 1 ml Medium enthält.
   2. Invertieren Sie, um die Zellen für 5 min bei 200 × g bei 20 °C zu mischen und mikrozentrifugieren. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS.
   3. Mikrozentrifugieren Sie die gewaschenen Zellen für 5 min bei 200 × g bei 20 °C. Entfernen Sie das PBS und resuspendieren Sie das Zellpellet in 150 μL des bevorzugten Mediums.
7. Bestimmen Sie die Zellzahl pro Mikroliter der 150 μL der resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählgerät.
8. Trennen Sie die 150 μL der resuspendierten Zellen in drei Teile.
   1. Einfrieren von 1/3 transfizierten Zellen (50 μL) in mittlerem plus 10% DMSO (Endvolumen von 150 μL) in Kryovials für zukünftige Expansion/Langzeitlagerung.
   2. Transfer 1/3 der transfizierten Zellen (50 μL) in eine saubere 0,2 mL PCR-Röhre zur Genotypisierung.
      1. Mikrozentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 200 × g bei 4 °C und entfernen Sie das Medium.
      2. Resuspendiert das Zellpellet in 100 μL PBS.
      3. Mikrozentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 200 × g bei 4 °C und entfernen Sie das PBS. Lagern Sie Zellpellets mit gemischter Population langfristig bei -80 °C.
      4. Verarbeiten Sie das Zellpellet für die Genotypisierung mit dem Workflow in Abschnitt 4.
   3. Bereiten Sie die letzten 1/3 der Zellen (50 μL) für die Verdünnung und Beschichtung in einem 96-Well-Plattenformat vor, um Einzelzellkolonien zu erzeugen.
      1. Berechnen Sie basierend auf der Zellzahl in Schritt 3.7. die Verdünnungen, die erforderlich sind, um 10, 5, 2 und 1 Zelle(n) in 100 μL Medium pro Vertiefung einer 96-Well-Platte zu erreichen.
      2. Fügen Sie mit einem 12-Kanal-Multipipettator und einem sterilen Reagenzreservoir 100 μL verdünnte Zellen pro Vertiefung zu zwei Reihen der Platte (insgesamt 24 Vertiefungen) für jede Verdünnung hinzu (10, 5, 2 oder 1 Zelle pro Well). Erlauben Sie 4-6 Wochen, bis die Zellen zu einem Zusammenfluss für die Expansion der Einzelzellkolonie heranwachsen. Beobachten Sie die Zellen wöchentlich unter einem Lichtmikroskop und beachten Sie, ob die Kolonien Einzel- oder Mehrzellkolonien darstellen.
      3. Sammeln Sie ~ 10-15 Einzelzellkolonien für die Genotypisierung (Abschnitt 4). Identifizieren Sie mindestens drei unabhängige, Knockout-Einzelzell-Kolonielinien für jeden anvisierten miRNA-Locus. Behalten Sie Wildtyp-Einzelzelllinien als Kontrollen bei.
         HINWEIS: Die Screening-Zahl hängt vom Zelllinientyp und den Auswirkungen des miRNA-Knockout-Phänotyps auf das Zellwachstum / die Zelllebensfähigkeit ab.

4. PCR-Genotypisierung von CRISPR-Zelllinien mit Rohzelllysaten

1. Ernten Sie einzelne, einzellige Kolonien aus fast zusammenfließenden Bohrlöchern einer 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Die in diesen Schritten beschriebene Entfernung von Medium/PBS kann manuell mit einem Vakuumsauger in der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, aber achten Sie darauf, Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie beim Absaugen eine neue sterile "gelbe" 200-μL-Pipettenspitze für jede Vertiefung der 96-Well-Platte, in der jede ausgetauschte gelbe Spitze fest am Ende einer sterilen Glasweidepipette platziert ist, die am Vakuumsauger befestigt ist.
   1. Waschen Sie die Vertiefungen 1x mit 100 μL PBS. Aspirieren Sie das PBS.
   2. 50 μL Trypsin zugeben und für 2-5 min bei 37 °C, 5% CO₂ inkubieren.
   3. Vorsichtig auf und ab pipettieren und die resuspendierten Zellen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Medium überführen.
   4. Invertieren, um die Zellen in einer Mikrozentrifuge zu mischen und vorsichtig für 5 min bei 200 × g bei 20 °C zu pelletieren.
   5. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Bewegen Sie vorsichtig das Rohr, um das Pellet zu stören, und kehren Sie es mehrmals um, um es zu mischen.
   6. Mikrozentrifuge für 5 min bei 200 × g bei 20 °C zur Pelletierung der Zellen.
   7. Entfernen Sie das PBS und suspendieren Sie das Pellet in 300 μL frischem PBS.
   8. Teilen Sie die 300-μL-Probe in zwei Teile.
      1. Übertragen Sie 200 μL der Zellen (2/3 des Pellets) auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 1 ml des bevorzugten Mediums enthält. Sobald der Genotyp validiert ist, verwenden Sie diese Zellen, um die CRISPR-vermittelten Knockout-Zelllinien für die Funktionsanalyse zu erweitern.
      2. Übertragen Sie 100 μL der Zellen (1/3 des Pellets) auf eine 0,2 mL PCR-Röhre. Mikrozentrifuge für 5 min bei 3.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie die PBS. Lagern Sie das Pellet bei -80 °C.
2. Bereiten Sie Rohzelllysate für die Genotypisierung und Sequenzanalyse mit den in Schritt 1.3 entwickelten PCR-Primern vor. Schließen Sie die Zelllysate ein, die aus nicht transfizierten Zellen hergestellt wurden, in diese Experimente, um sie als Wildtyp-Positivkontrollen zu verwenden.
   1. Resuspendiert das Zellpellet in 4 μL 5x DNA-Polymerase-Puffer (siehe Materialtabelle, Endkonzentration 1x), 1 μL Proteinase K (20 ng/ml-Stamm), 1 μL RNase A (10 ng/ml-Stamm) und nukleasefreiem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 μL.
   2. Lysieren Sie die Zellen in einem Thermocycler mit einem PCR-Programm: 56 °C für 30 min und 96 °C für 5 min. Lagern Sie die Zelllysate bei -20 °C.
   3. Führen Sie eine PCR-Reaktion mit den entworfenen PCR-Primern (vorwärts, rückwärts) durch, die die Leit-RNA-5'- und 3'-Leit-RNA-Zielstellen flankieren (Tabelle 1).
      HINWEIS: Der DNA-Polymerase-Puffer und die Thermocycler-Bedingungen hängen von dem Taq-DNA-Polymerase-Enzym ab, das für die PCR-Reaktion verwendet wird. Dieses Protokoll wurde für eine Phusion HF DNA Polymerase optimiert.
      1. Stellen Sie die PCR-Reaktionsmischung auf Eis auf: 5 μL 5x DNA-Polymerase-Puffer, 0,5 μL Forward-PCR-Primer (10 μM-Stamm), 0,5 μL Reverse-PCR-Primer (10 μM-Stamm), 0,5 μL 10 mM dNTPs, 0,25 μL DNA-Polymerase, 1-4 μL Zelllysat und nukleasefreies Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 μL.
      2. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit dem Programm durch: 98 °C für 3 min und 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 62 °C für 15 s, 72 °C für 15 s und dann 72 °C für 10 min. Halten Sie für 4 °C. Siehe ANMERKUNG 4.2.3. über.
   4. Laden Sie die PCR-Produkte zur Elektrophoreseanalyse auf ein 1% iges Agarosegel.
   5. Extrahieren Sie DNA aus den isolierten PCR-Fragmenten der vorhergesagten Molekülgröße für die Knockout- (und Wildtyp-) Genotypen. Bereiten Sie die Proben für die DNA-Sequenzierung vor.
   6. Validieren Sie, dass die CRISPR-Reaktion erfolgreich war, und führen Sie eine DNA-Sequenzierung der isolierten PCR-Fragmente durch, um die Cas9-Spaltungsstelle zu identifizieren und die miRNA-Locus-Deletion zu bestätigen.
      1. Isolieren Sie mindestens drei unabhängige Knockout-Zelllinien für jeden miRNA-Locus, auf den CRISPR abzielt. Behalten Sie Wildtyp- (und heterozygote) Zelllinien bei, um sie als Kontrollen in nachgelagerten Funktionsstudien zu verwenden.
      2. Führen Sie eine qRT-PCR- oder Northern-Blot-Analyse durch, um zu bestätigen, dass die Knockout-Zelllinien keine reife miRNA für den gelöschten Lokus exprimieren.
         HINWEIS: Die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) ist die definitivste Methode zur Validierung der CRISPR-Genbearbeitung und des Off-Targeting.
      3. Test auf CRISPR-Off-Targeting-Effekte durch PCR, die rechnerisch vorhergesagt wurden (Schritt 1.2.3.) ^24,25,26,27
      4. Wenn ein umfangreiches Einzelzell-Kolonie-Screening nur zu heterozygoten Genotypen führt, wiederholen Sie die Leit-RNA-Transfektion in den einzelligen heterozygoten Linien.
         HINWEIS: Die Unfähigkeit, homozygote Knockout-Zelllinien zu erhalten, könnte auf tödliche Wirkungen aufgrund von miRNA-Verlust oder inhärenter genomischer Komplexität (z. B. Chromosomenduplikationen / Fusionen) der elterlichen Zelllinie hinweisen, die einer weiteren Analyse bedürfen.

Representative Results

Dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Deletionsprotokoll wurde erfolgreich unter Verwendung der Transfektion von Cas9-induzierbaren LNCaP- und PC3-ML-Zelllinien für den menschlichen Krebs mit synthetischen Oligonukleotid-Guide-RNAs eingesetzt, die auf den miR-888-Cluster abzielen und im Zusammenhang mit Prostatakrebs untersucht wurden. Der miR-888-Cluster wurde zunächst in einem Expressionsprofilierungsbildschirm als erhöht bei Prostatakrebspatienten mit hochgradiger Erkrankung im Vergleich zu Patienten mit niedrigem Grad und Nicht-Krebs identifiziert ^9,10. Der miR-888-Cluster, der 35.124 bp umfasst, besteht aus sieben miRNAs (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b und -891a) auf dem menschlichen Chromosom Xq27.3 (Abbildung 2A). Dieser Locus liegt innerhalb des HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1, Xq27-28), das mit hereditärem Prostatakrebs ^{11,12,13,14,15,29} assoziiert ist. miR-888, -890, -892a, -892b und -892c teilen sich die Sequenzhomologie und gehören zur säugetierkonservierten miR-743-Familie. Die Clustermitglieder miR-891a und miR-891b teilen sich nur die Sequenzhomologie miteinander und gehören zur primatenspezifischen miR-891-Familie. Die genomische Organisation des miR-888-Clusters ist bei Primaten konserviert, was die funktionelle Erhaltung eines wichtigen Signalnetzwerks^{impliziert 30}.

Frühere Arbeiten mit experimentellen Überexpressions- (miRNA-Mimimen) und Hemmungsstudien (Antisense-Oligonukleotide) zur Bewertung der individuellen miR-888-Cluster-Mitgliederaktivität zeigten eine überlappende Rolle für alle miR-888-Clustermitglieder bei der Förderung der Invasivität von Prostatakrebszellen unter Verwendung von Matrigel Boyden-Kammerassays ^9,10. Vor allem miR-888 und miR-891a induzierten ähnlich das Wachstum von Prostatazellen (WST-1-Assays), beschleunigten die Prostatatumorbelastung in Maus-Xenotransplantaten und regulierten gemeinsame Ziele (z. B. TIMP-2^)9,10. Diese Arbeit deutete jedoch auf eine komplexere Interaktion zwischen den miR-888-Clustermitgliedern hin. Zum Beispiel zeigten miR-888 und miR-891a synergistische Effekte bei der Förderung der PC3-N-Prostatazellproliferation, während sowohl miR-890 als auch miR-892c hemmende Wachstumseffekte unter Verwendung von WST-1-Assays⁹ zeigten. Daher wurde dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Protokoll eingesetzt, um das miR-888-Clusternetzwerk im Zusammenhang mit Prostatakrebs genetisch abzufragen.

Der beschriebene Workflow für die CRISPR Cas9-Genbearbeitung (Abbildung 1) ermöglichte das Testen von 32 einzigartigen CRISPR-Leit-RNA-Transfektionsreaktionen in einem einzigen Experiment mit einem 24-Well-Format. Dieses Protokoll führte zur erfolgreichen Identifizierung eines Panels von menschlichen Prostatakrebs-Knockout-Zelllinien, die Deletionen für den gesamten miR-888-Cluster, spezifische miRNA-Cluster-Member-Kombinationen und einzelne miRNA-Mitglieder enthielten. Die Erzeugung stabiler induzierbarer Cas9-Zelllinien wurde erstmals etabliert. Kurz gesagt, PC3-ML und LNCaP humane Prostatakrebszellen wurden mit einem DOX-induzierbaren Streptococcus pyogenes Cas9 Lentivirus-Vektor (Lenti-iCas9; EditR induzierbare lentivirale hEF1aBlastCas9 Nuklaspenpartikel; MOI 0,3) für 6 h (LNCaP) oder über Nacht (PC3-ML), abhängig von der inhärenten Zelllinienempfindlichkeit für Virustoxizität.

Die infizierten Zelllinien durchliefen anschließend eine Blasticidin-Selektion (7,5 μg/ml) und eine Einzelzellkolonieexpansion. Western-Blot-Studien wurden verwendet, um die Einzelkolonie-PC3-ML- und LNCaP-Lenti-iCas9-Zelllinien auszuwählen, die die robusteste Cas9-Expression basierend auf einem DOX-Induktionszeitverlauf aufweisen (Abbildung 2A). Dieses lentivirale Cas9-induzierbare System wurde streng kontrolliert, und nach dem DOX-Entzug für 120 h wurde der größte Teil des Cas9-Proteins aus den Zellen entfernt (Abbildung 2A). Eine DOX-Konzentrationskurve bestimmte, dass 250 ng/ml DOX die optimale Dosis war, um eine robuste Cas9-Proteinexpression in diesen Lenti-iCas9-Prostatazelllinien zu induzieren (Abbildung 2B). Unter Verwendung eines Online-crRNA-Design-Tools²³ wurden einzigartige crRNAs (zwei 5'- und zwei 3'-crRNAs, die jeden geplanten miRNA-Knockout-Locus flankieren, um vier mögliche 5'- und 3'-Leit-RNA-Kombinationen zu ermöglichen) entworfen, die auf die gesamte ~35 kb miR-888-Clusterregion abzielten; kleinere Clusterkombinationen innerhalb der miR-743-Familie oder der miR-891-Familie; sowie einzelne miRNA-Deletionen (miR-888, -891a) (Abbildung 3A). Bei der Durchführung der CRISPR-Experimente wurden Lenti-iCas9-Zelllinien für menschlichen Prostatakrebs in Medium gezüchtet, ergänzt mit 250 ng / ml DOX für 48 h, um die Cas9-Expression zu induzieren.

Die Zellen wurden dann in einem 24-Well-Plattenformat mit der synthetischen universellen tracrRNA-Komplexierung (1:1 molaren Verhältnis) mit einem einzigartigen Satz von 5' und 3' genomischen stellenspezifischen crRNAs transfiziert (Tabelle 2). DOX wurde 48 h nach der Transfektion aus dem Zellkulturmedium entfernt, um das Cas9-Protein aus den Prostatakrebszellen zu entfernen. Die Bohrlöcher wurden 48 h später (96 h nach der Transfektion) geerntet und ein Drittel jedes geernteten Zellpellets wurde für die PCR-Genotypisierung mit Rohzelllysaten vorbereitet (Tabelle 3). Die Gelelektrophorese-Analyse der PCR-Reaktionen ergab, dass die vorhergesagte DNA-Fragmentgröße, die den Knockout-Genotyp darstellt, für jede CRISPR-Transfektion amplifiziert wurde (Abbildung 3B). Die DNA-Sequenzierung dieser isolierten Knockout-PCR-Fragmente bestätigte, dass die transfizierten 5'- und 3'-Leit-RNAs die Cas9-Spaltung/Ligatur ~3 nt vor den PAM-Stellen steuerten und den genomischen Verlust des zielgerichteten miRNA-Locus validierten (repräsentatives Beispiel in Abbildung 4C). Da sich der miR-888-Cluster in einer intergenen Region von Chromosom X befindet (weit entfernt von proteinkodierenden Genen), wurde nicht erwartet, dass Knockout-Zelllinien, die aufgrund von NHEJ oft INDELs an der Cas9-Spaltungsstelle besaßen, nachgeschaltete Artefakteffekte verursachen würden.

Obwohl die CRISPR-Transfektionsreaktionen erfolgreich waren (Abbildung 3B), stellten die transfizierten Zellen eine gemischtzellige Population von transfizierten (Knockout) und nicht transfizierten (Wildtyp) Zellen dar. Diese Population stellte auch eine Mischung aus Zellen dar, die homozygote und heterozygote Deletionen für den zielgerichteten miRNA-Locus trugen. LNCaP- und PC3-Prostatakrebs-Zelllinien stammen von Männern ab, die abnormale Karyotypen besitzen, die zwei X-Chromosomen^31,32 enthalten. Daher wurde ein Teil jeder Zelltransfektionsreaktion seriell in einem 96-Well-Plattenformat verdünnt, um Einzelzellkolonielinien zu erhalten. Diese Kolonien wurden mittels PCR untersucht, um nach homozygoten Zelllinien zu suchen, denen alle Kopien des anvisierten miRNA-Locus fehlten.

Es war wichtig, dieses Verfahren rechtzeitig zu befolgen, da frühere Daten eine Rolle für den miR-888-Cluster bei der Förderung des Tumorzellwachstums und der Krankheitsaggressivität gezeigt haben. Es wurde vorhergesagt, dass Krebszellen, die CRISPR-Deletionen für die miR-888-Clustermitglieder tragen, langsamer wachsen als Wildtypzellen. Eine berechtigte Sorge war, dass die Leit-RNA-transfizierten Wells, die eine gemischte Population von miRNA-Knockout- und Wildtyp-Zellen enthielten, im Laufe der Zeit dazu führen würden, dass Wildtypzellen die kompromittierten mutierten Zellen in Kultur schnell übertreffen würden. Dies wurde festgestellt und war besonders ausgeprägt in Experimenten mit den hochaggressiven PC3-ML-Zelllinien. Daher wurden Schritte mit seriellen Verdünnungen zur Erzeugung von Einzelzellkolonielinien oder Zellpräparation für die Kryolagerung innerhalb von 48-72 Stunden nach Durchführung der CRISPR-Transfektionsexperimente durchgeführt, um die Knockout-Zellen in den gemischten Populationsproben zu erhalten.

Der aufwendigste Teil des CRISPR-Workflows für den miR-888-Cluster war die Erzeugung homozygoter, einzelliger miRNA-Deletionen in Einzelzellkolonien. Eine Herausforderung in diesem Prozess bestand darin, dass die kultivierten LNCaP- und PC3-ML-Zellen typischerweise nicht gut gedeihen, wenn sie bei Einzelzelldichten plattiert wurden. Darüber hinaus schien das Zellwachstum beim kombinatorischen Verlust von miR-888-Clustermitgliedern phänotypisch beeinträchtigt zu sein (und korrelierte mit der Aggressivität der Zelllinie). Daher waren für einige der Transfektionsreaktionen, die auf bestimmte miRNA-Locus-Kombinationen abzielten, zusätzliche Zellverdünnungen (unter Verwendung eines 96-Well-Formats) erforderlich, um genügend Einzelzellkolonielinien für die Genotypisierung zu erzeugen. Beim Screening der Genotypen der Einzelzellkolonien mittels Elektrophorese-Gelbildgebung war es hilfreich, die Bandenintensität des Wildtyps im Vergleich zu den Knockout-PCR-Fragmenten zu vergleichen und festzustellen, ob die Zelllinie heterozygot (gleiche Bandintensität) war oder eine Mehrzellkolonie (ungleiche Bandintensität) darstellte, was von zusätzlichen Runden von Einzelzellverdünnungen profitieren würde. Wenn festgestellt wurde, dass Zellkolonien PCR-Fragmente von abnormaler Größe besitzen und nicht mit Wildtyp- oder Knockout-Genotypen übereinstimmen, wurden diese Linien aus der Studie eliminiert.

Die DNA-Sequenzierung isolierter PCR-Fragmente, die für die Wildtyp- und Knockout-Genotypen konsistent sind, wurde für jede etablierte Einzelzellkolonie revalidiert und mit unabhängigen Methoden (d.h. qRT-PCR, WGS) bestätigt. In Bezug auf die typische Effizienz der Erzeugung homozygoter Nullzelllinien in diesen Experimenten variierte dies mit dem anvisierten miRNA-Locus und dem verwendeten Zelltyp. Zum Beispiel betrug die Effizienz bei der Gewinnung von Einkolonie-mir-891a-Knockout-Linien mit LNCaP 30%, sank aber in PC3-ML-Zellen auf ~ 7%. Dieser Unterschied könnte auf inhärente Zelltypunterschiede zurückzuführen sein (z. B. besitzen PC3-ML-Zellen höhere Teilungsraten / metastasierendes Potential als LNCaP-Zellen). CRISPR-Effizienzunterschiede könnten auch die funktionellen Auswirkungen des miRNA-Verlusts widerspiegeln (z. B. fördert miR-891a das Zellwachstum und die Aggressivität ^9,10) und somit könnten Knockout-Phänotypen in aggressiveren Zelllinien wie PC3-ML vergrößert werden. Die Gewinnung von Einzelkolonielinien für größere miRNA-Locus-Deletionen des miR-888-Clusters zeigte reduzierte Wirkungsgrade. Wir konnten nicht feststellen, ob dies auf das Ausschalten größerer Regionen der DNA zurückzuführen war oder die wesentlichen und überlappenden funktionellen Rollen von miR-888-Mitgliedern in Prostatakrebszellen unterstrich.

Eine detaillierte Beschreibung und phänotypische Analyse der Einzelzellkolonie-expandierten miR-888-Clusterzelllinien, die aus diesem Workflow generiert wurden, sind im Gange und werden an anderer Stelle veröffentlicht. Als repräsentatives Ergebnis der in diesen CRISPR-Gen-Editing-Studien erzeugten miRNA-Deletionen werden die Ergebnisse für LNCaP-Prostatakrebszellen gezeigt, die eine individuelle mir-891a-Deletion tragen. Einzelzellkolonien wurden mittels PCR genotypisiert und sequenzverifiziert (Abbildung 4A-C). Zelllinien mit abnormal großen PCR-Fragmenten wurden nicht analysiert (z. B. Klon L14 H7 in Abbildung 4D). Nachdem Knockout- und Wildtyp-Einzelzellkolonien für den Mir-891a-Locus erhalten wurden, wurden funktionelle Studien durchgeführt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine Überexpression von miR-891a (miRNA mimic lentiviral vector) das Wachstum von Prostatazellen^{induziert 9} und daher wurde vorhergesagt, dass der Verlust von miR-891a Wechselwirkungen zeigen würde. WST-1-Proliferationsassays, die mir-891a-Knockout- und Wildtyp-Zellen vergleichen, bestätigten diese Hypothese, und der Verlust von miR-891a führte zu einem verlangsamten Wachstum (Abbildung 4D, E).

Abbildung 1: CRISPR-Gen-Editing-Workflow zur Generierung von miRNA-Cluster-Deletionen. (A) Die Leit-RNA besteht aus den geglühten synthetischen crRNA- und tracrRNA-Oligonukleotiden (gemischtes 1:1-Molverhältnis). Das crRNA-Oligonukleotid wurde entwickelt, um eine einzigartige 5'-terminale 20-nt-Leitliniensequenz (gelb) zu enthalten, die komplementär zur anvisierten genomischen DNA-Stelle ist, gefolgt von einer invarianten 22 nt Streptococcus pyogenes Wiederholungssequenz (grün), die sich mit dem tracrRNA-Oligonukleotid paart. Rote Pfeile weisen auf doppelsträngige DNA-Spaltungsstellen des Cas9-Enzyms hin, die sich typischerweise 3 NT stromaufwärts des PAM befinden. (B) Dieser experimentelle Arbeitsablauf zeigt eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zellen, die mit einem DOX-induzierbaren Cas9-Lentivirus-Vektor (Lenti-iCas9, MOI 0.3) infiziert sind, werden in Medium mit DOX für 48 h gezüchtet, um die Cas9-Proteinexpression zu induzieren. Zwei synthetische Guide-RNAs (gemischtes 1:1-Molverhältnis von crRNA::tracrRNA) werden in Cas9-induzierte Zellen transfiziert. Die Leit-RNAs eskortieren Cas9 zu den genomischen DNA-Stellen (5' und 3'), die die miRNA-Clusterregion flankieren, die zur Entfernung bestimmt ist. Die Zellen werden 48 h nach der Transfektion für die Verdünnung unter Verwendung eines 96-Well-Formats vorbereitet, um Einzelzellkolonien für die PCR-Genotypisierung und nachgelagerte phänotypische Analysen zu erzeugen. Abkürzungen: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; miRNA = microRNA; crRNA = CRISPR-RNA; tracrRNA = transaktivierende CRISPR-RNA; nt = Nukleotid; Cas9 = CRISPR-assoziierte Endonuklease; PAM = Protospacer benachbartes Motiv; DOX = Doxycyclin; MOI = Multiplizität der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Krebszelllinien, die eine doxycyclinduzierbare Cas9-lentivirale Kassette tragen, die eine strenge Cas9-Proteinregulation aufweist . (A) Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass humane Prostatakrebs-PC3-ML-Zelllinien, die mit dem Lenti-iCas9-Vektor (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) infiziert und 48 h in einem Medium mit 250 ng/ml DOX gezüchtet wurden, optimale Cas9-Proteinspiegel exprimierten. Der Cas9-Ausdruck wurde auf den GAPDH-Ausdruck normalisiert. (B) PC3-ML-Zellen, die in Medium mit 250 ng/ml DOX für 48 h und 120 h (+DOX) gezüchtet wurden, zeigten eine robuste Cas9-Proteinexpression. Die DOX-Entfernung aus dem Medium (-DOX) für 120 h (120 h post) führte zu einer Cas9-Protein-Clearance, gemessen durch Western-Blot-Analyse. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Generierung der LNCaP Lenti-iCas9-Zelllinie erzielt (nicht gezeigt). Abkürzungen: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas9 = CRISPR-assoziierte Endonuklease; DOX = Doxycyclin; MOI = Multiplizität der Infektion; GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: CRISPR-Versuchsdesign mit hohem Durchsatz zur Generierung mehrerer miR-888-Cluster-Deletionskombinationen in einem einzigen Experiment. (A) Diagramm des miR-888-Clusters auf dem menschlichen Chromosom Xq27.3, das die säugetierkonservierten miR-743-Familienmitglieder mir-892c, -890, -888, -892a und -892b (blaue Kästchen) und die primatenspezifischen miR-891-Familienmitglieder miR-891a und -891b (kastanienbraune Boxen) angibt. Einzigartige synthetische crRNA-Oligonukleotide (grüne Pfeile) wurden verwendet, um die miR-888-Cluster-Knockout-Kombinationen zu erzeugen. Forward- und Reverse-PCR-Primer (kleine rote Rechtecke) wurden entwickelt, um Zellen zu genotypisieren und nach Knockouts zu suchen. (B) Dieses repräsentative Ergebnis zeigt 25 CRISPR-Reaktionen in transfizierten PC3-ML-Zellen (Lenti-iCas9), die in einem einzigen Experiment auf eine Reihe von miR-888-Cluster-Knockout-Kombinationen abzielten. Jede transfizierte Vertiefung einer 24-Well-Platte enthielt zwei einzigartige gRNAs, die die 5'- und 3'-Seite des anvisierten miRNA-Genomlokus (Δ) flankierten (wie in Tabelle 2 aufgeführt). Rohzelllysate wurden für jede CRISPR-Reaktion hergestellt und PCR-genotypisiert. Isolierte PCR-Fragmente, die durch Gelelektrophorese mit den vorhergesagten Knockout-Größen migrierten, wurden DNA-sequenziert und für die gezielte Cas9-Spaltung und die Entfernung des miRNA-Locus validiert. Vorhergesagte WT PCR Fragment bp Größen sind in Klammern angegeben, und die gewünschten CRISPR KO PCR Fragmentgrößen werden am unteren Rand des Gels angezeigt. Abkürzungen: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas9 = CRISPR-assoziierte Endonuklease; gRNA = Leit-RNA; DOX = Doxycyclin; bp = Basenpaar; WT = Wildtyp; KO = Knockout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Prostatakrebszellen, die für mir-891a mittels CRISPR-Gen-Editing gelöscht wurden, zeigen eine unterdrückte Proliferation. (A) Design von PCR-Primern (lila) und den beiden 5'- und zwei 3'-Leit-RNAs (orange), die auf genomische Sequenzen abzielen, die das mir-891a-Gen flankieren (grün). (B) Die PCR-Genotypisierung transfizierter LNCaP-Zellen mit angezeigten 5'- und 3'-Leit-RNAs bestätigte, dass Δ-mir-891a-Deletionen für alle vierGuide-RNA-Kombinationen erhalten wurden. Zelllysate wurden 48 h nach der Transfektion aus gemischtzelligen Populationen hergestellt. (C) PCR-Fragmente wurden sequenziert und validiert. Ein repräsentatives Beispiel zeigt die DNA-Sequenz transfizierter Zellen, die mit 5A(891a)- und 3B(891a)-Leit-RNAs behandelt wurden, was zur vorhergesagten Cas9-Spaltungsstelle (3 NT vor der PAM-Stelle) und CRISPR Δmir-891a-Deletion führt. (D) Einzelzellkolonien wurden erhalten und PCR-genotypisiert. Klon L14 G9 wurde sequenzvalidiert als KO und Klon L14 G9 als WT für das mir-891a-Gen. (E) Es wurde zuvor gezeigt, dass miR-891a das Wachstum von Prostatakrebszellen induziert, und daher wurde vorhergesagt, dass der Verlust von miR-891a den reziproken Phänotyp aufweist. WST-1-Assays von Prostatakrebszellen, die für mir-891a gelöscht wurden (L14 G9 [KO], blau), zeigten eine unterdrückte Proliferation im Vergleich zu WT-Zellen (L14 G9 [WT], rot). Abkürzungen: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas9 = CRISPR-assoziierte Endonuklease; WT = Wildtyp; KO = Knockout; WST-1 = wasserlösliches Tetrazoliumsalz-1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die PCR-Reaktion wird auf Eis aufgebaut.
Bestandteil	25 μL Reaktion	Endkonzentration
5x DNA-Polymerase-Puffer	5 μL	1x
Forward PCR Primer (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
Reverse PCR Primer (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
10 mM dNTPs	0,5 μL	200 μM
DNA-Polymerase (2 HE/μL)	0,25 μL	0,125 U/ 25 μL
Rohzelllysat	1 - 4 μL	Variable
Nukleasefreies Wasser	bis 25 μL
Thermocycler-Bedingungen für die PCR-Reaktion:
Schritt	Temperatur	Zeit
Anfängliche Denaturierung	98 °C	3 Minuten
	98 °C	10 s
35 Zyklen	62 °C	15 s
	72 °C	15 s
Letzte Verlängerung	72 °C	10 Minuten
Halten	4 °C

Tabelle 1: PCR-Reaktionsbedingungen für die Genotypisierung von Rohlysat. Abkürzung: dNTP = Desoxynukleotide.

CRISPR-gezielte Löschseite	Leitfaden RNA Kombination	Wildtyp (bp)	Knockout (bp)	PCR-Primer-Paare
∆Vollständiger Cluster	5A(891a)+3A(892c) 5B(891a)+3A(892c) 5A(891a)+3B(892c) 5B(891a)+3B(892c)	35,664	389 496 378 485	891a FWD 892c REV
∆892C/890/888	5A'(888)+3A(892c) 5B'(888)+3A(892c) 5A'(888)+3B(892c) 5B'(888)+3B(892c)	2,739	478 487 467 476	888 FWD 892c REV
∆892C/890	3A'(888)+3A(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3A'(888)+3B(892c) 3B'(888)+3B(892c)	2,739	710 754 699 743	888 FWD 892c REV
∆892B/892a	5A'(888)+5A(892b) 5B'(888)+5A(892b) 5A'(888)+5B(892b) 5B'(888)+5B(892b)	2,938	554 547 573 566	892b FWD 888 REV
∆892B/892A/888	5A(892b )+3A'(888) 5A(892b )+3B'(888) 5B(892b )+3A'(888)	2,938	322 278 341	892b FWD 888 REV
∆743 Familie	5A(892b)+3A(892c) 5B(892b)+3A(892c) 5A(892b)+3B(892c) 5B(892b)+3B(892c)	5,015	370 389 359 378	892b FWD 892c REV
∆891 Familie	5A(891a)+3A(891b) 5B(891a)+3A(891b )	27,294	330 270	891a FWD 891b REV
∆891a	5A(891a)+3A(891a) 5A(891a)+3B(891a) 5B(891a)+3A(891a) 5B(891a)+3B(891a)	554	333 273 454 394	891a FWD 891a REV

Tabelle 2: CRISPR-Leit-RNAs, die zur Erzeugung von miR-888-Cluster-Knockout-Kombinationen verwendet werden. Abkürzungen: CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats; bp = Basenpaar; FWD = vorwärts; REV = umgekehrt.

Fibel	Reihenfolge	Tm (°C)
888 FWD	AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG	52.2
888 REV	CTGGATGATGGCCAAGACAAG	55.9
891a FWD	TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA	53.9
891a REV	TTCATCTTGCTGCTACCTGTC	54.8
891b REV	TCATCTTGCTGCTATACGTCCT	55.6
892b FWD	GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA	53.5
892b REV	CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC	53.5
892c FWD	TGTGAGCACCTACAGGTTAG	53.9
892c REV	CACTCTCACTTGGCTTCATG	53.5

Tabelle 3: PCR-Primer für die Genotypisierung Abkürzungen: FWD = vorwärts; REV = umgekehrt; Tm = Schmelztemperatur.

Discussion

Dieses CRISPR-Gen-Editing-Verfahren ermöglicht es dem Forscher, schnell ein ganzes Panel von Zelllinien zu generieren, die einzigartige miRNA-Cluster-Deletionskombinationen tragen. Die Transfektion von synthetischen Leit-RNAs, die aus 5'- und 3'-genomischen stellenspezifischen crRNAs bestehen, die mit synthetischer TracrRNA (1:1-Molverhältnis) in diesem Protokoll geglüht sind, vermeidet zeitaufwändiges Plasmidvektor-Subklonen und ermöglicht ein flexibleres und hochdurchsatzorientiertes experimentelles Design mit einem 24-Well-Format. Die Erzeugung von Zelllinien, die eine DOX-induzierbare Cas9-Lentiviruskassette tragen, ermöglicht eine streng DOX-regulierte und robuste Cas9-Expression während der Zelltransfektion von Leit-RNAs und eine schnelle Clearance dieses bakteriellen Proteins bei DOX-Entzug aus dem Kulturmedium in nachfolgenden Schritten. Dieses Verfahren stützt sich auch auf Rohzelllysate für die PCR-Genotypisierung, die minimales Zellmaterial für die Analyse erfordert und die Verwendung kostspieliger und arbeitsintensiver Kieselsäuresäulen-DNA-Aufreinigungsmethoden oder die Notwendigkeit, Nukleinsäurekonzentrationen mit einem Spektralphotometer zu messen, vermeidet, wodurch die Methoden für den Prüfer weiter rationalisiert werden.

Tatsächlich zeigten die hier geteilten repräsentativen Ergebnisse eine erfolgreiche Anpassung dieser Methode, um menschliche Prostatakrebs-Zelllinien mit 32 einzigartigen Leit-RNA-Kombinationen in einem einzigen Experiment zu transfizieren und mehrere Einzelzellkolonie-Knockout-Linien zu erzeugen, die Deletionen für die gesamte ~ 35 kb miR-888-Clusterregion tragen; kleinere Löschkombinationen für miR-888-Clustermitglieder, die zu den Familien miR-743 und miR-891a gehören; sowie Deletionen für einzelne miRNA-Mitglieder innerhalb des miR-888-Clusters. Dieser Workflow generierte eine wertvolle Zelllinienressource, um mit der molekularen Sezierung des miR-888-Clusternetzwerks im Kontext menschlicher Prostataerkrankungen zu beginnen und zu bestimmen, wie sich miR-888-Clustermitglieder funktionell überlappen oder synergistisch / antagonistisch miteinander interagieren, um das Wachstum von Prostatatumoren, Krebsaggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren (an anderer Stelle veröffentlicht). Diese Studien werden von entscheidender Bedeutung sein, da sich diese Forschung in Richtung diagnostischer und therapeutischer Anwendungen für die Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenen und metastasierenden Formen von Prostatakrebs bewegt.

Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Protokoll, die Forscher sorgfältig berücksichtigen sollten, wenn sie diese Methode anpassen, um zusätzliche miRNA-Cluster-Netzwerke in anderen Krankheitskontexten zu untersuchen. Der wichtigste Schritt in diesem Prozess ist zunächst das sorgfältige Design der Leit-RNAs, die den miRNA-Cluster für die CRISPR-medikamentöse Entfernung flankieren, sowie zusätzlicher Führungs-RNAs zur Löschung einzelner miRNAs oder Kombinationen von miRNA-Clustermitgliedern. Der Prüfer sollte sorgfältig überlegen, ob die umgebenden Gene oder regulatorischen Elemente nicht gestört werden, insbesondere wenn sich der miRNA-Cluster in einem Gen-Intron befindet oder sich gegen ein anderes Gen befindet. Es gibt CRISPR-Off-Targeting-Vorhersageressourcen^24,25,26,27, die dem Forscher bei der Auswahl der anspruchsvollsten crRNA-Oligonukleotide zur Synthese helfen können. Dieser Workflow beschreibt das Design von zwei 5'- und zwei 3'-crRNAs, die jeden anvisierten miRNA-Locus flankieren, die es ermöglichen, vier einzigartige Guide-RNA-Kombinationen im CRISPR-Transfektionsschritt zu testen und die Chancen zu erhöhen, die gewünschte Knockout-Zelllinie zu erzeugen. Der Forscher benötigt jedoch nur eine dieser Leit-RNA-Kombinationen, um erfolgreich einen bestimmten miRNA-Genort zu stören.

Zweitens sollte der Prüfarzt die am besten geeignete Methode für die Abgabe von Cas9 an die Zellen zur CRISPR-Genbearbeitung entscheiden. Dieses Verfahren verwendete das DOX-induzierbare Cas9-lentivirale Expressionssystem, aber alternative Ansätze für die Cas9-Proteinproduktion (z. B. Cas9-rekombinantes Protein, Cas9-mRNA-Delivery oder die Verwendung herkömmlicher Cas9-Expressionsplasmid-Vektorsysteme) können leicht für dieses Protokoll angepasst werden. Zum Beispiel könnten experimentelle Überlegungen die Verwendung der transienten Cas9-Expression im Vergleich zur Erzeugung stabiler lentiviraler Expressionszelllinien, den Promotor, der zur Antrieb von Cas9 verwendet wird (allgegenwärtig, zelltypspezifisch, induzierbar), und die Einbeziehung positiver / negativer Selektionssysteme diktieren, um die Cas9-Expressionsvektorlieferung an die interessierenden Zellen sicherzustellen (dh Antibiotikaresistenz).

Drittens ist es wichtig, transfizierte Zellen mit gemischter Population innerhalb von 48-72 h nach der Guide-RNA-Abgabe schnell zu genotypisieren, falls der Verlust des miRNA-Clusters die Lebensfähigkeit / das Wachstum der Zellen negativ beeinflussen kann. Zum Beispiel wurde beim Löschen von tumorfördernden Faktoren wie miR-891a in Prostatakrebs-Zelllinien festgestellt, dass diese mir-891a-Knockout-Zellen langsamer wuchsen als unbehandelte Zellen und anschließend die Wildtypzellen schnell die Zellpopulation überholten. Schließlich ist es von entscheidender Bedeutung, zusätzliche Validierungsmethoden zu integrieren, um die Entfernung des miRNA-Locus während des genotypischen Screening-Prozesses sicherzustellen, insbesondere bei größeren genomischen Deletionen. Zu diesen Maßnahmen gehören die Verwendung interner PCR-Genotypisierungskontrollen, die nur erkannt werden, wenn das Wildtyp-Allel vorhanden ist, und die Durchführung einer qRT-PCR-Analyse an Einzelzellkolonien, um sicherzustellen, dass Knockout-Zelllinien die anvisierten miRNAs nicht exprimieren. All diese Überlegungen werden erfolgreiche Ergebnisse für den Prüfer sicherstellen.

Bei der Integration dieser CRISPR-Technik in das Labor gab es einige offensichtliche Einschränkungen. Zum Beispiel war trotz des Hochdurchsatzcharakters der in diesem Protokoll beschriebenen Leit-RNA-Transfektionsschritte zur schnellen Generierung mehrerer miRNA-Cluster-Deletionskombinationen der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt dieses Verfahrens das Genotyp-Screening und die Erweiterung von Einzelkolonie-Zelllinien für jede CRISPR-vermittelte miRNA-Deletion. Die Einbeziehung positiver Selektionsstrategien in dieses Protokoll wäre von Vorteil; Es würde jedoch immer noch ~ 3-4 Wochen dauern, um eine Linie von einer einzelligen Kolonie zu erweitern, die in einem 96-Well-Format gezüchtet wurde. Tatsächlich wird die Sammlung von mindestens drei unabhängigen Einzelkolonie-Zelllinien pro miRNA-Locus-Knockout plus Wildtypzellen dazu beitragen, sicherzustellen, dass die untersuchten Phänotypen nicht auf Artefakt- / Off-Targeting-Effekte zurückzuführen sind, aber dies trägt wiederum zum zeitaufwändigen Charakter dieses Verfahrens bei. Der Ermittler muss möglicherweise auch mehrere Runden der CRISPR-Genbearbeitung durchführen, um homozygote Nullzelllinien zu erhalten. Dies ist besonders ausgeprägt in Studien mit etablierten immortalisierten Krebszelllinien, die oft eine komplexe genomische Landschaft von chromosomalen Umlagerungen und abnormalen Karyotypen besitzen.

Zum Beispiel verwendete diese repräsentative Studie LNCaP- und PC3-abgeleitete menschliche Prostatakrebszelllinien, um Deletionen für den miR-888-Cluster zu generieren, die auf das X-Chromosom abgebildet wurden. Es war wichtig zu erkennen, dass diese männlich abgeleiteten Prostatakrebs-Zelllinien abnormale Karyotypen aufweisen und zwei X-Chromosomen besitzen (und PC3-Zellen haben auch partielle X-Chromosom-Translokationen auf anderen Autosomen)^31,32. Trotz dieser Bedingungen war die CRISPR-Genbearbeitung robust genug, um homozygote Knockouts mit diesen Prostatazelllinien zu erzeugen. Es kann jedoch Fälle geben, in denen die Zelllinie eines Prüfarztes mit einem abnormalen Karyotyp (z. B. Insertionen, Deletionen, Inversionen, Duplikationen) "unsichtbare Mutationen" beherbergen könnte, die den Nachweis von zweiten (oder mehr) Kopien des Zielgenorts aufgrund fehlender Elemente, die für eine erfolgreiche Erkennung mit den entwickelten PCR-Primern / Leit-RNAs erforderlich sind, verschleiern. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, die homozygoten Null-CRISPR-Zelllinien mit unabhängigen Methoden (d.h. qRT-PCR, Northern Blot, WGS) zu überprüfen, bevor funktionelle Assays durchgeführt werden. Schließlich ist dieses Protokoll so konzipiert, dass es nur miRNA-Cluster-Kombinationen ausschaltet, die nebeneinander abgebildet werden. Wenn ein Forscher miRNAs ausschalten möchte, die zwischen anderen miRNA-Genen getrennt sind, sind mehrere Runden von CRISPR-Transfektionen erforderlich, die eine sorgfältige Genotypisierung und Validierung erfordern.

Trotz dieser Herausforderungen ist die Möglichkeit, mit diesem beschriebenen Protokoll schnell ein komplettes Panel von miRNA-Deletionskombinationen für jeden beliebigen miRNA-Cluster zu generieren, ein großer Vorteil gegenüber den bestehenden Methoden in der miRNA-Forschungs-Toolbox. Überexpressionsstudien mit miRNA-Nachahmungen zur Charakterisierung der nicht-kodierenden RNA-Funktion können zu unbeabsichtigten Artefakten oder Zelltoxizitäten führen. Ebenso kann die Verwendung von Antisense-Antimir-Oligonukleotid-Inhibitoren zur Bestimmung von Funktionsverlust-Phänotypen schwierig sein, da Antimirs normalerweise zu einem Knockdown und nicht zu einer vollständigen Eliminierung der miRNA-Aktivität führen. Der Versuch, Kombinationen von miRNA-Mimiken oder miRNA-Antimirs zu verwenden, um die miRNA-Cluster-Netzwerksignalisierung aufzuklären, hat sich als mühsam und schwierig zu interpretieren erwiesen. Daher wird die Einbeziehung der CRISPR-Gen-Editing-Technologie, um zu untersuchen, wie miRNA-Mitglieder innerhalb eines bestimmten nicht-kodierenden genomischen Clusters interagieren, es den Forschern ermöglichen, ein klareres Verständnis davon zu erlangen, wie nicht-kodierende RNAs Krankheitssignalwege beeinflussen und verspricht, enorme Auswirkungen auf die Bereiche Diagnostik und Arzneimittelforschung zu haben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system