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Biology

माइक्रोआरएनए क्लस्टर नेटवर्क विश्लेषण के लिए सीआरआईएसपीआर जीन संपादन उपकरण

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल माइक्रोआरएनए क्लस्टर नेटवर्क विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) जीन संपादन वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों के एक पैनल की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है जो अद्वितीय एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्य विलोपन संयोजनों को एक प्रयोग के भीतर 35 केबी जितना बड़ा होता है।

Abstract

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) कैंसर और मेटास्टेसिस के महत्वपूर्ण सेलुलर नियामकों (ट्यूमर सप्रेसर, प्रो-ऑन्कोजेनिक कारक) के रूप में उभरे हैं। अधिकांश प्रकाशित अध्ययन कैंसर में छोटे आरएनए की भूमिका की विशेषता के दौरान एक एकल एमआईआरएनए पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, मानव एमआईआरएनए जीन का ~ 30% क्लस्टर इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है जो अक्सर सह-व्यक्त होते हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए विनियमन की एक जटिल और समन्वित प्रणाली का संकेत देते हैं। क्लिनिक में नॉनकोडिंग छोटे आरएनए का अनुवाद करने से पहले ट्यूमर के विकास, कैंसर की आक्रामकता और दवा प्रतिरोध को विनियमित करने के लिए क्लस्टर एमआईआरएनए नेटवर्क सहकारी रूप से कैसे कार्य करते हैं, इसका एक स्पष्ट अंडरटेलिंग आवश्यक है।

प्रोस्टेट कैंसर के संदर्भ में ~ 35,000 बीपी लंबाई में फैले स्थान के भीतर स्थित सात एमआईआरएनए जीन के जीनोमिक क्लस्टर की ऑन्कोजेनिक भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) -मध्यस्थता जीन संपादन प्रक्रिया का उपयोग नियोजित किया गया है। इस दृष्टिकोण के लिए, मानव कैंसर सेल लाइनों को 48 घंटे के लिए डॉक्स युक्त माध्यम में उगाए गए डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) -इंड्यूसिबल कैस 9 न्यूक्लियस के लिए एक लेंटीवायरस वेक्टर से संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को बाद में सिंथेटिक ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (टीआरएसआरएनए) के साथ सह-संक्रमित किया गया था, जो जीनोमिक साइट-विशिष्ट सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ जटिल था ताकि कैंसर सेल लाइनों की तेजी से पीढ़ी को एक ही प्रयोग के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन और व्यक्तिगत या संयोजन एमआईआरएनए जीन क्लस्टर विलोपन की अनुमति मिल सके।

इस उच्च थ्रूपुट जीन संपादन प्रणाली के फायदे समय लेने वाली डीएनए वेक्टर सबक्लोनिंग से बचने की क्षमता, 24-अच्छी तरह से प्रारूप में अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों के साथ ट्रांसफेक्टिंग कोशिकाओं में लचीलापन, और क्रूड सेल लाइसेट्स का उपयोग करके कम लागत वाले पीसीआर जीनोटाइपिंग हैं। इस सुव्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले अध्ययन एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्यों के बीच कार्यात्मक अतिरेक और सहक्रियात्मक / विरोधी बातचीत को उजागर करने का वादा करते हैं, जो मानव रोग में शामिल जटिल छोटे नॉनकोडिंग आरएनए नेटवर्क को चिह्नित करने में सहायता करेगा और भविष्य के चिकित्सीय डिजाइन को बेहतर ढंग से सूचित करेगा।

Introduction

मानव रोग में नॉनकोडिंग आरएनए के योगदान की जांच के लिए बेहतर शोध उपकरणों की आवश्यकता है। एमआईआरएनए डिसरेगुलेशन अक्सर कैंसर जैसे मानव विकारों में देखा जाता है जब कैंसर रोगियों के ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थों (जैसे, रक्त, मूत्र) में इन छोटे नॉनकोडिंग आरएनए की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना गैर-कैंसर, स्वस्थ व्यक्ति, माइक्रोएरे, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर), और अगली पीढ़ी की गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को नियोजित करते हैं 1,2 . हाल के काम ने इन एमआईआरएनए के एक बड़े सबसेट को ट्यूमर सप्रेसर, ऑन्कोजेनिक और मेटास्टेसिस कारकों के रूप में चिह्नित किया है जो ट्यूमर के गठन, रोग प्रगति और दवा प्रतिरोध को नियंत्रित करते हैं। एमआईआरएनए के प्रायोगिक ओवरएक्सप्रेशन और / या डाउनरेगुलेशन / हानि के परिणामस्वरूप कोशिका में कार्यात्मक और प्लियोट्रोपिक परिणाम होते हैं, जो कैंसर से जुड़ी गतिविधियों की विस्तृत श्रृंखला को दर्शाते हैं, ये नॉनकोडिंग आरएनए समन्वय करते हैं - विकास, एपोप्टोसिस, भेदभाव, क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग, एंजियोजेनेसिस, मेसेनकाइमल (ईएमटी) और एमईटी संक्रमण, चयापचय और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए उपकला3.

एमआईआरएनए को एकल जीन के रूप में एन्कोड किया जाता है या जीनोमिक क्लस्टर में रहते हैं, जो नाभिक में स्थानांतरित होते हैं और साइटोप्लाज्म4 में स्थानीयकृत जैविक रूप से परिपक्व, एकल-फंसे ~ 22 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) एमआईआरएनए प्रजातियों को उत्पन्न करने से पहले बड़े पैमाने पर संसाधित होते हैं। ये छोटे आरएनए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से अपने प्रभाव डालते हैं और नकारात्मक जीन नियामकों के रूप में कार्य करते हैं जो उत्प्रेरक आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (आरआईएससी) को एमआरएनए साइट पर लाने के लिए अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) लक्ष्यों को बांधते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एमआरएनए गिरावट और / एमआईआरएनए पशु प्रणालियों में नॉनकोडिंग आरएनए का एक अत्यंत प्रचुर मात्रा में वर्ग है, और मानव जीनोम में 2,654 परिपक्व एमआईआरएनए मौजूद हैं (एमआईआरबेस रिलीज 22.1)5। एमआईआरएनए आमतौर पर अपने एमआरएनए लक्ष्यों के लिए अपूर्ण पूरकता के साथ संबद्धहोते हैं 4. इसलिए, एक एकल एमआईआरएनए दसियों से सैकड़ों अलग-अलग एमआरएनए लक्ष्यों को विनियमित कर सकता है और कार्यात्मक रूप से जैविक मार्गों की एक बड़ी श्रृंखला को प्रभावित कर सकता है। एमआईआरएनए-आधारित तंत्र की जटिलता को जोड़ने के लिए, एक एकल एमआरएनए को कई, अलग-अलग एमआईआरएनए द्वारा विनियमित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह जांचना चुनौतीपूर्ण है कि कैसे एमआईआरएनए डिसरेगुलेशन शरीर के होमियोस्टैटिक संतुलन को बाधित करता है और मानव दुर्दमता की ओर जाता है।

अधिकांश प्रकाशित अध्ययनों ने बीमारी की घटनाओं में उनकी भूमिका की विशेषता के दौरान एक एकल एमआईआरएनए पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, मानव एमआईआरएनए जीन का ~ 30% क्लस्टर इकाइयों (आमतौर पर ~ 10 किलोबेस [केबी]) में व्यवस्थित किया जाता है जो अक्सर एक ही अभिविन्यास और सह-व्यक्त में प्रतिलेखित होते हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए विनियमन 6 की एक समन्वित और जटिल प्रणाली का संकेतदेते हैं। सबसे बड़ा पॉलीसिस्ट्रोनिक मानव एमआईआरएनए क्लस्टर 14q32 क्लस्टर है जिसमें 54 एमआईआरएनए अग्रदूत शामिल हैं। मानव कैंसर से जुड़ी सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई क्लस्टर एमआईआरएनए इकाइयों में से एक एमआईआर -17-92 पॉलीसिस्ट्रोनिक क्लस्टर है जिसमें एमआईआर -17, एमआईआर -18 ए, एमआईआर -19 ए, एमआईआर -20 ए, एमआईआर -19 बी -1, और एमआईआर -92-1 शामिल हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए, सी 13 ओआरएफ 25 के इंट्रॉन 3 के भीतर रहते हैं। एमआईआर -17-92 क्लस्टर को अक्सर हेमटोपोइएटिक दुर्दमताओं में प्रवर्धित किया जाता है और ठोस ट्यूमर में अतिरंजित किया जाता है और सेल चक्र प्रगति, एपोप्टोसिस और एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने में ऑन्कोजेनिक भूमिकाएं स्थापितकी हैं। इसके अलावा, नॉनकोडिंग जीन ल्यू 2 के इंट्रॉन के भीतर स्थित ट्यूमर दमनकारी एमआईआर -15 ए और एमआईआर -16-1 क्लस्टर को अक्सर ल्यूकेमिया में हटा दिया जाता है और कैंसर की एक बड़ी श्रृंखला में डाउनरेगुलेट किया जाता है, जो एंटीएपोप्टोटिक जीन बीसीएल 2 और अतिरिक्त सेल चक्र प्रगति जीन 8 को लक्षित करके ट्यूमर के विकास को अवरुद्ध करनेके लिए कार्य करता है। एमआईआर -888 क्लस्टर उच्च ग्रेड प्रोस्टेट कैंसर वाले रोगियों में ऊंचा है और इसमें मानव गुणसूत्र एक्सक्यू 27.3 9,10 पर स्थित सात एमआईआरएनए जीन (एमआईआर -892 सी, -890, -888, -892 ए, -892 बी, -891 बी और -891 ए) शामिल हैं।

एचपीसीएक्स 1 लोकस (वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर, एक्स-लिंक्ड 1) के भीतर एमआईआर -888 क्लस्टर मानचित्र एक्सक्यू 27-2 में फैले हुए हैं, जिसे वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर परिवार वंशावली 11,12,13,14,15,29 के लिंकेज विश्लेषण द्वारा पहचाना गया था। पारंपरिक एमआईआरएनए मिसएक्सप्रेशन टूल - एमआईआरएनए मिमिक्स और एंटीसेंस इनहिबिटर का उपयोग करके व्यक्तिगत एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन ने संकेत दिया कि ये एमआईआरएनए प्रोस्टेट ट्यूमर के विकास और आक्रमण 9,10 को विनियमित करने में अतिव्यापी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, ये प्रयोगात्मक तरीके खुद को यह अध्ययन करने के लिए आसानी से उधार नहीं देते हैं कि ऊतक होमियोस्टेसिस और कैंसर की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए कई एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्य एक नॉनकोडिंग आरएनए नेटवर्क में सहक्रियात्मक या विरोधी रूप से कैसे कार्य करते हैं। उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन तकनीक का उपयोग करके इस वर्णित सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल को इस ज्ञान अंतर को पाटने के लिए मानव कैंसर (जैसे, एमआईआर -888 क्लस्टर) से जुड़े एमआईआरएनए क्लस्टर को आणविक रूप से विच्छेदन करने के लिए संशोधित किया गया है।

बैक्टीरियल सीआरआईएसपीआर और सीआरआईएसपीआर से जुड़े (सीएएस) जीन बैक्टीरियोफेज के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा की मध्यस्थता करते हैं16. इस प्राचीन प्रोकैरियोटिक निगरानी प्रणाली की खोज को किसी भी वांछित जीनोमिक लोकस को आसानी से लक्षित करने और इन विट्रो और विवो16,17 दोनों में पशु प्रणालियों और सेल प्रकारों की एक बड़ी श्रृंखला के भीतर डीएनए अनुक्रम परिवर्तन करने के लिए एक कुशल वैज्ञानिक उपकरण के रूप में जल्दी से अनुकूलित किया गया था। यह तकनीक मानव रोग के संदर्भ में एमआईआरएनए नेटवर्क से पूछताछ करने के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में महान वादा करती है। यह अंत करने के लिए, अमर मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों (एलएनसीएपी, पीसी 3-एमएल) में मानव गुणसूत्र एक्स पर ~ 35 केबी फैले एमआईआर -888 क्लस्टर का अध्ययन करने के लिए यह उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रोटोकॉल का निर्माण यह पूछताछ करने के लिए किया जाता है कि क्लस्टर सदस्य कैंसर प्रगति मार्गों का समन्वय कैसे करते हैं। इस दृष्टिकोण को किसी भी एमआईआरएनए क्लस्टर की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है और जांचकर्ताओं को एक ही प्रयोग के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन और व्यक्तिगत और संयोजन एमआईआरएनए जीन क्लस्टर विलोपन को ले जाने वाली मानव सेल लाइनों को तेजी से उत्पन्न करने की अनुमति देता है।

इस प्रक्रिया में, स्थिर सेल लाइनों को एक डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) -इंड्यूसिबल लेंटिवायरल अभिव्यक्ति प्रणाली ले जाने में स्थापित किया जाता है जो अन्वेषक को संवैधानिक डॉक्स-इंड्यूसिबल प्रमोटर टीआरई 3 जी के माध्यम से स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस सीआरआईएसपीआर-जुड़े एंडोन्यूक्लाइज कैस 9 (सीएसएन 1) जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है। टेट-ऑन 3 जी द्विदलीय प्रणाली में टेट-ऑन 3 जी जीन और ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोध जीन (ब्लास्टआर) दोनों के प्रतिलेखन को द्विसिस्ट्रोनिक प्रतिलेख के रूप में चलाने के लिए एक संवैधानिक मानव बढ़ाव कारक 1 अल्फा (एचईएफ 1 अल्फा) प्रमोटर शामिल है। टेट-ऑन 3 जी ट्रांसएक्टिवेटर प्रोटीन केवल डॉक्स की उपस्थिति में टीआरई 3 जी प्रमोटर को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप मजबूत कैस 9 प्रतिलेखन होता है। डॉक्स की अनुपस्थिति में, कोई या बहुत कम बेसल कैस 9 अभिव्यक्ति नहीं है। इसलिए, अन्वेषक सीआरआईएसपीआर जीन संपादन चरणों के दौरान डॉक्स के साथ पूरक मीडिया में उगाई गई कोशिकाओं में उच्च कैस 9 प्रोटीन उत्पादन को प्रेरित कर सकता है और डॉक्स निकासी पर तेजी से सीएएस 9 प्रोटीन निकासी के लिए नियंत्रण कर सकता है।

यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के डिजाइन का भी वर्णन करता है जो क्लस्टर के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर, व्यक्तिगत एमआईआरएनए हेयरपिन (प्रीमिरना) क्षेत्रों और / प्रत्येक डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए में एक अद्वितीय 5'-टर्मिनल 20 एनटी गाइड अनुक्रम (लक्षित होने के लिए ब्याज के जीनोमिक अनुक्रम के पूरक) होता है, इसके बाद एक अपरिवर्तनीय 22 एनटी एस पायोजेनेस रिपीट सीक्वेंस (5'-एक्स -3 ')होता है जो सार्वभौमिक ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (ट्रैक) के साथ बेस-पेयरिंग को सक्षम बनाता है। साथ में, एनील्ड सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए (मिश्रित 1: 1 अनुपात) इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए) के लिए गाइड आरएनए के रूप में कार्य करते हैं। प्रत्येक प्रयोग में, दो सिंथेटिक गाइड आरएनए को डॉक्स-प्रेरित कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है ताकि बैक्टीरिया कैस 9 प्रोटीन को जीनोमिक डीएनए साइटों (5 'और 3') को हटाने के लिए लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्र (चित्रा 1 बी) को जोड़ा और एस्कॉर्ट किया जा सके।

एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम (जंगली प्रकार एस पायोजेनेस कैस 9 के लिए 5'-एनजीजी -3') सेल जीनोम में मौजूद होना चाहिए और गाइड आरएनए17 द्वारा लक्षित 20 एनटी डीएनए अनुक्रम के तुरंत निकट स्थित होना चाहिए। पीएएम अनुक्रम एक बाध्यकारी संकेत के रूप में कार्य करता है और लक्षित जीनोमिक डीएनए साइट पर एंडोन्यूक्लाइज कैस 9 एंजाइम के उत्प्रेरक क्षेत्र को स्थित करता है, बाद में पीएएम के ~ 3 एनटी अपस्ट्रीम स्थित निर्देशित, डबल-फंसे (डीएस) डीएनए दरार की ओर जाता है। सेल की डीएनए मरम्मत मशीनरी क्लीव्ड डीएनए सिरों की मरम्मत करती है, जिसके परिणामस्वरूप सही बंधाव हो सकता है, लेकिन अक्सर नॉनहोमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) होता है, जिससे मरम्मत स्थल पर छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडेल) होते हैं। चूंकि एमआईआरएनए नॉनकोडिंग जीन हैं जो अक्सर इंटरजेनिक और इंट्रोनिक क्षेत्रों के भीतर स्थित होते हैं, इसलिए इन इंडेल में अवांछित बकवास /

इन प्रयोगों में गाइड आरएनए कॉम्प्लेक्स के लिए सिंथेटिक आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एनील्ड सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए, 1: 1 दाढ़ अनुपात) एन्कोडिंग को नियोजित करके, यह जीन नॉकआउट रणनीति समय लेने वाली डीएनए वेक्टर सबक्लोनिंग से बचती है और 24-अच्छी तरह से प्रारूप में कोशिकाओं को अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों को ट्रांसफेक्ट करने में भारी लचीलेपन की अनुमति देती है। पीसीआर जीनोटाइप स्क्रीनिंग के लिए क्रूड सेल लाइसेट्स की तैयारी भी महंगी और समय लेने वाली डीएनए शुद्धि विधियों से बचती है, जबकि सुव्यवस्थित एकल कॉलोनी सेल लाइन पीढ़ी और फेनोटाइपिक विश्लेषण की अनुमति देती है। दरअसल, इस उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही प्रयोग में 32 अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों के साथ सुसंस्कृत प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों (एलएनसीएपी, पीसी 3-एमएल) को ट्रांसफेक्ट करने और पूरे ~ 35 केबी एमआईआर -888 क्लस्टर क्षेत्र के लिए विलोपन ले जाने वाली नॉकआउट लाइनों को उत्पन्न करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है; एमआईआर -743 और एमआईआर -891 ए परिवारों से संबंधित एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के लिए छोटे विलोपन संयोजन; साथ ही एमआईआर -888 क्लस्टर के भीतर व्यक्तिगत एमआईआरएनए सदस्यों के लिए विलोपन। इस तरह के अध्ययन एक स्पष्ट समझ प्रदान करेंगे कि चिकित्सीय और नैदानिक उपकरण के रूप में क्लिनिक में एमआईआरएनए का अनुवाद करने से पहले ट्यूमर के विकास, आक्रामकता और दवा प्रतिरोध को विनियमित करने के लिए क्लस्टर एमआईआरएनए सहकारी रूप से कैसे कार्य करते हैं।

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Protocol

1. सीआरआईएसपीआर जीन संपादन के लिए तैयारी और एमआईआरएनए क्लस्टर नॉकआउट सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए आरएनए डिजाइन का मार्गदर्शन करें

  1. एक डीएनए अनुक्रम एनोटेशन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम19 का उपयोग करके ब्याज के एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्र (इंटरजेनिक, इंट्रोनिक) और आसपास के जीनोमिक क्षेत्रों के कम से कम 1 केबी के पूर्ण जीनोमिक अनुक्रम युक्त डीएनए फ़ाइल बनाएं।
    1. लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर लोकस (इंटरजेनिक, इंट्रोनिक) और एमआईआरएनए क्लस्टर से संबंधित प्रत्येक व्यक्तिगत एमआईआरएनए हेयरपिन अनुक्रम को चिह्नित करने के लिए बनाई गई डीएनए फ़ाइल में एक फीचर एडिटिंग टूल का उपयोग करें, साथ ही अन्य आस-पास के कोडिंग और नॉनकोडिंग जीन और /
    2. सुनिश्चित करें कि विलोपन के लिए लक्षित एमआईआरएनए क्षेत्र अनजाने में आस-पास के प्रोटीन-कोडिंग जीन, नॉनकोडिंग जीन या महत्वपूर्ण नियामक डीएनए तत्वों को बाधित नहीं करते हैं।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सेल लाइन की जीनोमिक जटिलता (जैसे, गुणसूत्र दोहराव /
  2. जैव सूचनात्मक गाइड आरएनए डिजाइन सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके क्लस्टर के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर, व्यक्तिगत एमआईआरएनए हेयरपिन (प्री-एमआईआरएनए) क्षेत्रों और / या एमआईआरएनए जीन के सबसेट को फ़्लैंक करने वाले जीनोमिक डीएनए अनुक्रम के 20 एनटी को लक्षित करने वाले सिंथेटिक सीआरआरएनए डिजाइन करें (उदा।23). सुनिश्चित करें कि उपयुक्त कैस 9 एंजाइम गाइड आरएनए डिजाइन टूल (यानी, S. pyogenes कैस 9)।
    नोट: संश्लेषित सीआरआरएनए में यह अद्वितीय 5'-टर्मिनल 20 एनटी गाइड अनुक्रम (डीएनए लक्ष्य के पूरक) के बाद एक अपरिवर्तनीय 22 एनटी होगा S. pyogenes संश्लेषित सार्वभौमिक ट्रेकरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ बेस-पेयरिंग की अनुमति देने के लिए अनुक्रम दोहराएं। एक साथ, वे इस प्रोटोकॉल में गाइड आरएनए के रूप में कार्य करेंगे।
    1. बनाई गई डीएनए फ़ाइल (चरण 1.1.) का संदर्भ देते हुए, जैव सूचनात्मक गाइड आरएनए डिज़ाइन सॉफ्टवेयर टूल23 में विलोपन के लिए लक्षित एमआईआरएनए हेयरपिन / क्लस्टर लोकस के तुरंत अपस्ट्रीम (5') या डाउनस्ट्रीम (3') रहने वाले डीएनए अनुक्रम के ~ 150 एनटी दर्ज करें।
      नोट: डिजाइन टूल सीआरआरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिज़ाइन के लिए अद्वितीय 20 एनटी अनुक्रमों की पहचान करेगा जो पीएएम अनुक्रम (गैर-लक्षित डीएनए स्ट्रैंड पर) (जैसे, एस। नीचे प्रदान किया गया सीआरआरएनए डिजाइन का एक उदाहरण है जो मीर -891 ए जीन लोकस (विशेष रूप से 5 ए (891 ए) प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग और तालिका 1 में चर्चा की गई साइट को तुरंत ऊपर (5') को लक्षित करता है।
      1. गाइड आरएनए डिजाइन सॉफ्टवेयर टूलखोलें 23.
      2. नाम दर्ज करें विंडो में नाम 5A(891a) दर्ज करें ।
      3. एक डीएनए अनुक्रम विंडो दर्ज करें में, मीर -891 ए अग्रदूत जीन के तुरंत ऊपर (5') रहने वाले जीनोमिक अनुक्रम के 150 एनटी दर्ज करें:5'-आगा आप ने कहा कि आप इस प्रकार हैं
        टीटीजीटीएटी
        टैगटेक्टकैटगटीजीटीएजीटीएटीएसीटीटीए
        एटीटीएसीटी
        सीसीसीएटीएटीजीटीसीटी-3'
      4. प्रोग्राम द्वारा कम्प्यूटेशनल रूप से पता लगाई गई ऑफ-टार्गेटिंग साइटों को छोड़ने के लिए विशिष्टता सक्षम करें चेक चिह्नित बॉक्स को चेक करें। उपयुक्त जीव चुनें (यानी, मानव [होमो सेपियन्स])।
      5. अध्ययन के लिए नियोजित सही कैस 9 एंजाइम पीएएम निर्दिष्ट करें, इस मामले में, स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस कैस 9-पीएएम: एनजीजी, निम्नलिखित डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स उत्पन्न करने के लिए: लक्ष्य के सापेक्ष पीएएम: बाद में; अनुक्रम दोहराएं: गुउआगगगुगुग्सकुउग; गाइड के सापेक्ष: 3; लक्ष्य अनुक्रम लंबाई: 20; लक्ष्य 5 'शुरुआत के सापेक्ष कटौती: सेंस 17 एंटी-सेंस 17।
      6. सिंथेटिक सीआरआरएनए संश्लेषण के परिणाम देखने के लिए अगला बटन पर क्लिक करें।
        नोट: इस उदाहरण में, संश्लेषित होने के लिए सुझाए गए सीआरआरएनए डीएनए लक्ष्य एटीएसएटीजीसीटीजीएटीएजीटीएसीसी को पहचान लेंगे और पीएएम: एजीजी के निकट स्थित होंगे।
    2. डीएनए फ़ाइल का संदर्भ लें (चरण 1.1 में बनाया गया है.) सर्वोत्तम उम्मीदवार सीआरआरएनए 20 एनटी लक्ष्य अनुक्रमों को निर्धारित करने के लिए जो एमआईआरएनए लोकस के सबसे करीब रहते हैं और इच्छित जीनोमिक लक्ष्य के लिए उच्चतम विशिष्टता रखते हैं।
      1. उम्मीदवार सीआरआरएनए विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए कम्प्यूटेशनल ऑफ-टारगेटिंग विश्लेषण टूल का उपयोग करें और ब्याज के लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्र (जैसे, 24,25,26,27) से असंबंधित जीनोमिक लोकी में संभावित ऑफ-टारगेटिंग साइटों की भविष्यवाणी करें।
      2. पीसीआर द्वारा एकल-कॉलोनी सीआरआईएसपीआर क्लोनल सेल लाइनों को जीनोटाइप करते समय बाद के संदर्भ के लिए संभावित ऑफ-टारगेटिंग परिणाम रिकॉर्ड करें (चरण 4.2.6.)।
        नोट: डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड और जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम के बीच साझा अनुक्रम पूरकता की सीमा यह निर्धारित करेगी कि कैस 9 एंजाइम उस स्थान पर जीनोम को कितनी चुनिंदा रूप से क्लीव करता है। चूंकि गाइड आरएनए 3 'से 5' दिशा में जीनोमिक लक्ष्य के लिए एनील करता है, डीएनए लक्ष्य अनुक्रम (पहले 8-10 ठिकानों) के 5 'अंत में बेमेल अक्सर कैस 9-मध्यस्थता दरार को अवरुद्ध करेगा। यदि जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम डीएनए अनुक्रम के पहले आठ ठिकानों को छोड़कर, किसी अन्य जीनोमिक लोकस के साथ होमोलॉजी साझा करता है, तो इस गाइड आरएनए को इस साइट पर ऑफ-टारगेटिंग की कम संभावना होने की भविष्यवाणी की जाती है।
      3. प्रत्येक लक्षित एमआईआरएनए लोकस के लिए चार अद्वितीय सीआरआरएनए डिजाइन करें: एमआईआरएनए हेयरपिन / क्लस्टर (5'ए, 5'बी) के पूरक डीएनए अनुक्रमों को तुरंत 5 'लक्षित करने के लिए दो डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए और एमआईआरएनए हेयरपिन / क्लस्टर (3'ए, 3'बी) के पूरक डीएनए अनुक्रमों को तुरंत 3 'लक्षित करने के लिए दो डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए।
        नोट: सीआरआईएसपीआर अभिकर्मक (धारा 3 में) का प्रदर्शन करते समय, चार संभावित 5 'और 3' गाइड आरएनए जोड़ी संयोजन (5'ए + 3'ए; 5'ए + 3'बी; 5'बी + 3'ए; 5'बी + 3'बी) प्रत्येक लक्षित एमआईआरएनए लोकस के लिए परीक्षण किया जाएगा ताकि एक ही प्रयोग में सफल एमआईआरएनए लोकस विलोपन उत्पन्न करने की संभावना बढ़ सके।
      4. संश्लेषित किए जाने वाले प्रत्येक डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए के लिए डीएनए लक्ष्य अनुक्रम (आसन्न पीएएम के साथ) को चिह्नित करने के लिए बनाई गई डीएनए फ़ाइल (चरण 1.1.) में एक सुविधा संपादन उपकरण का उपयोग करें।
  3. सीआरआईएसपीआर सेल लाइनों को जीनोटाइप करने के लिए लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्रों को फ़्लैंक करने वाले पीसीआर प्राइमरों (आगे, रिवर्स) को डिजाइन और संश्लेषित करें (और बनाई गई डीएनए फ़ाइल में प्राइमरों को लेबल करें)।
    1. बारीकी से क्लस्टर या व्यक्तिगत एमआईआरएनए के लिए छोटे जीनोमिक विलोपन ले जाने वाली जीनोटाइपिंग सेल लाइनों के लिए, कैस 9 दरार साइट / नॉकआउट क्षेत्र के प्रत्येक तरफ लगभग 150 बीपी रहने वाले पीसीआर प्राइमर (आगे, रिवर्स) डिजाइन करें जो जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से एक पीसीआर प्रतिक्रिया में वाइल्डटाइप (~ 600 बीपी) और नॉकआउट (~ 300 बीपी) डीएनए टुकड़ों दोनों का पता लगाने में सक्षम होंगे।
    2. एमआईआरएनए अग्रदूत संयोजनों या पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर के लिए बड़े जीनोमिक विलोपन ले जाने वाली जीनोटाइपिंग सेल लाइनों के लिए, फिर से कैस 9 दरार / नॉकआउट साइट के प्रत्येक तरफ लगभग 150 बीपी रहने वाले पीसीआर प्राइमरों (आगे, रिवर्स) को डिजाइन करें। ध्यान दें कि, यदि लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन लंबाई में >4 केबी तक फैला हुआ है, तो पीसीआर प्रतिक्रिया केवल छोटे (~ 300 बीपी) नॉकआउट डीएनए टुकड़े का पता लगाएगी लेकिन वाइल्डटाइप डीएनए टुकड़ा नहीं। इसलिए, अतिरिक्त पीसीआर प्राइमरों (आगे, रिवर्स) को डिज़ाइन करें जो स्क्रीनिंग प्रक्रिया में सहायता के लिए आंतरिक एमआईआरएनए क्लस्टर जीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का पता लगा सकते हैं और समरूप नॉकआउट सेल लाइनों के लिए मान्य कर सकते हैं।

2. डॉक्स-प्रेरक कैस 9 अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने वाली स्थिर लेंटिवायरल सेल लाइनों की पीढ़ी

नोट: बीएसएल 2 प्रक्रियाओं और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक प्रमाणित जैव सुरक्षा हुड में सभी सेल संस्कृति और वायरस का काम करें।

  1. सीआरआईएसपीआर अध्ययन और पसंदीदा विकास मीडिया के लिए उपयुक्त सेल लाइन प्रकार निर्धारित करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों एलएनसीएपी (पसंदीदा माध्यम: आरपीएमआई, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]) और पीसी 3-एमएल (पसंदीदा माध्यम: डीएमईएम, 10% एफबीएस) के लिए विकसित किया गया था।
  2. ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोध जीन कैसेट (चरण 2.3)) ले जाने वाले लेंटीवायरस-संक्रमित कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए इष्टतम दवा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक ब्लास्टिसिडिन "मृत्यु" वक्र करें।
    1. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के 11 कुओं में प्लेट कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं, लगभग 75% संगम तक पसंदीदा माध्यम में 5% सीओ2 ।
    2. 0, 1, से 10 μg /एमएल तक की अंतिम एकाग्रता के साथ पसंदीदा माध्यम में ब्लास्टिसिडिन (वर्किंग स्टॉक 1 मिलीग्राम / एमएल) को पतला करें और 1 μg / एमएल वेतन वृद्धि में पतला करें।
    3. 1 से 11 तक वरीयता प्राप्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को लेबल करें। कुओं से विकास माध्यम निकालें और उपयुक्त ब्लास्टिसिडिन सांद्रता के साथ बदलें।
    4. 7-10 दिनों के लिए हर दूसरे दिन उपयुक्त ब्लास्टिसिडिन सांद्रता के साथ माध्यम बदलें।
    5. समय पाठ्यक्रम के दौरान दैनिक कोशिकाओं की जांच करें और 5-7 दिनों के भीतर सभी कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक न्यूनतम ब्लास्टिसिडिन एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रयोगों के लिए नियोजित प्रत्येक विशिष्ट सेल लाइन के लिए एक ब्लास्टिसिडिन "मार" वक्र करने की आवश्यकता होगी।
  3. डॉक्स-इंड्यूसिबल कैस 9 अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने वाले लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें और चरण 2.2 में निर्धारित इष्टतम एकाग्रता का उपयोग करके ब्लास्टिसिडिन चयन करें।
    1. 6-अच्छी तरह से प्लेट के तीन कुओं में, बीज 5 × 104 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात (ऑन) पर पसंदीदा माध्यम में बढ़ते हैं।
    2. अगले दिन, बर्फ पर डॉक्स-इंड्यूसिबल कैस 9 (लेंटी-आईकैस 9) के लिए लेंटीवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर को पिघलाएं। धीरे से मिश्रण (भंवर वायरस कणों नहीं है)।
      नोट: कई फ्रीज /पिघलना चक्रों से बचने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य में लेंटिवायरस स्टोर करें, जो वायरल टाइटर्स और संक्रमण दक्षता को कम करेगा।
    3. वायरल टिटर एकाग्रता के आधार पर 0.3 (एमओआई = 0.3) के संक्रमण की बहुलता पर वायरस के साथ 5 × 104 कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    4. एमएल हेक्साडीमेथ्राइन ब्रोमाइड के साथ पूरक सीरम मुक्त और एंटीबायोटिक मुक्त पसंदीदा माध्यम के 250 μL (प्रति अच्छी तरह से) में उपयुक्त वायरस की मात्रा को पिपेट करें। धीरे-धीरे मिलाएं।
      नोट: हेक्साडीमेथ्राइन ब्रोमाइड वायरल सोखना और संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए पाया जाने वाला एक धनायनिक बहुलक है।
    5. माध्यम निकालें। कोशिकाओं के लिए लेंटी-आईसीएएस 9 वायरस (एमओआई = 0.3) के साथ तैयार पारगमन माध्यम के 250 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेते हैं। (यदि कोशिकाएं वायरस से संबंधित विषाक्त प्रभाव प्रदर्शित करती हैं तो इनक्यूबेशन समय को 4-6 घंटे तक छोटा करें।
    6. ताजा पसंदीदा माध्यम के साथ माध्यम को बदलें और कोशिकाओं को 1-2 दिनों के लिए ठीक होने दें।
    7. चरण 2.2 में वर्णित "मार" वक्र से प्राप्त इष्टतम ब्लास्टिसिडिन एकाग्रता का उपयोग करके 10-14 दिनों के लिए संक्रमित कोशिकाओं पर ब्लास्टिसिडिन चयन करें।
      1. समानांतर में, वायरल चयन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले इष्टतम ब्लास्टिसिडिन एकाग्रता के साथ मध्यम में असंक्रमित कोशिकाओं को विकसित करें।
    8. मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए चयन समय पाठ्यक्रम के दौरान हर 3 दिनों में इष्टतम ब्लास्टिसिडिन एकाग्रता के साथ पूरक माध्यम बदलें।
      नोट: केवल कोशिकाएं जो ब्लास्टिसिडिन चयन से बच जाती हैं, उन्होंने लेंटिवायरल वेक्टर को एकीकृत किया होगा।
    9. ब्लास्टिसिडिन-चयनित लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों का विस्तार करें।
      नोट: प्रत्येक विस्तार पर सेल मार्ग संख्या रिकॉर्ड करें।
      1. दीर्घकालिक क्रायोवियल भंडारण के लिए 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ पूरक पसंदीदा माध्यम में लेंटी-आईसीएएस 9 कोशिकाओं के एक हिस्से को फ्रीज करें।
      2. सबसे मजबूत डॉक्स-प्रेरक कैस 9 प्रोटीन स्तरों को प्रदर्शित करने वाली सेल लाइन की पहचान करने के लिए पश्चिमी धब्बा9 द्वारा लेंटी-आईसीएस 9 कोशिकाओं के एक हिस्से का विश्लेषण करें (चरण 2.3 देखें।
  4. कैस 9 प्रोटीन प्रेरण के लिए इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए नव स्थापित लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों पर एक डॉक्सीसाइक्लिन एकाग्रता वक्र करें।
    1. इस डॉक्स एकाग्रता समय पाठ्यक्रम को करने के लिए परीक्षण की गई प्रत्येक सेल लाइन के लिए चार स्वतंत्र 6-अच्छी तरह से प्लेटें सेट करें। प्लेट 5 × प्रत्येक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रतिअच्छी तरह से 10 4 कोशिकाएं और 24 घंटे के लिए पसंदीदामाध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर बढ़ती हैं।
    2. एमएल) को 0, 50, 100, 150, 250 से 500 एनजी / एमएल तक अंतिम डॉक्स एकाग्रता वक्र के साथ पसंदीदा माध्यम में पतला डॉक्स (वर्किंग स्टॉक 1 मिलीग्राम /
    3. प्रत्येक वरीयता प्राप्त 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को 1 से 6 तक लेबल करें। माध्यम निकालें और उपयुक्त डॉक्स सांद्रता के साथ बदलें। निम्नलिखित समय बिंदुओं तक प्लेटों को 1-4 बढ़ाएं: 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे डॉक्स प्रेरण; और 120 घंटे पोस्ट डॉक्स निकासी (शुरू में 72 एच डॉक्स-प्रेरित)।
    4. उपयुक्त तरीकों (जैसे, ट्रिप्सिनाइजेशन) का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर प्लेट के कुओं को हार्वेस्ट करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों स्टोर करें। लाइसेट अलगाव और कैस 9 पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए आरआईपीए बफर में सेल छर्रों को संसाधित करें।
      1. एक विकृत 4% -12% बिस-ट्रिस जेल का उपयोग करके डॉक्स-प्रेरण समय पाठ्यक्रम के प्रत्येक नमूने के लिए सेल लाइसेट के 40 μg चलाएं और प्रोटीन को इम्यूनोब्लॉट झिल्ली में स्थानांतरित करें।
      2. 160 केडीए प्रोटीन का पता लगाने के लिए कैस 9 के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लोट झिल्ली को संकरित करें। जीएपीडीएच (37 केडीए) जैसे हाउसकीपिंग जीन का उपयोग करके कैस 9 के स्तर को सामान्य करें।
    5. पश्चिमी धब्बा परिणामों के आधार पर, लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों में कैस 9 को प्रेरित करने के लिए इष्टतम डॉक्स एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: इस बार पाठ्यक्रम यह भी पता चल जाएगा कि कैस 9 अभिव्यक्ति को 120 घंटे पोस्ट डॉक्स हटाने पर कितनी कसकर विनियमित किया जाता है।
    6. सीआरआईएसपीआर अभिकर्मकों (धारा 3 में) को अनुकूलित करने के लिए मजबूत कैस 9 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाते हुए लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों के लिए एकल-सेल कॉलोनियों की स्थापना करें।

3. एक उच्च थ्रूपुट प्रारूप का उपयोग करके कोशिकाओं के कैस 9 प्रेरण और सिंथेटिक गाइड आरएनए अभिकर्मक द्वारा सीआरआईएसपीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करना

नोट: एक वर्कफ़्लो आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है।

  1. कागज पर, सीआरआरएनए जोड़ी संयोजनों को मैप करें जो पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर, विभिन्न क्लस्टर एमआईआरएनए जीन संयोजनों के साथ-साथ व्यक्तिगत एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्यों को लक्षित करने वाली 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्ट हो जाएंगे।
    1. मानचित्र पर, लक्षित एमआईआरएनए लोकस प्रति चार कुओं को लेबल करें। प्रत्येक अच्छी तरह से एक अभिकर्मक प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें दो अद्वितीय सीआरआरएनए वांछित एमआईआरएनए नॉकआउट जीनोमिक लोकस और ट्रैकआरएनए (एनील्ड 1: 1 दाढ़ अनुपात) के 5 'और 3' तैनात हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि चार लेबल वाले कुओं में से प्रत्येक अभिकर्मक के लिए एक अद्वितीय सीआरआरएनए जोड़ी का प्रतिनिधित्व करता है (उदाहरण के लिए, 5'ए + 3'ए; 5'ए + 3'बी; 5'बी + 3'ए; 5'बी + 3'बी)।
      नोट: प्रत्येक लक्षित एमआईआरएनए लोकस (धारा 1) को फ्लैंक करने वाले दो 5 'सीआरआरएनए और दो 3' सीआरआरएनए का डिज़ाइन अभिकर्मक प्रतिक्रिया में चार संभावित 5 'और 3' गाइड आरएनए जोड़े की पीढ़ी को सक्षम बनाता है।
  2. अनुकूलित डॉक्स एकाग्रता युक्त पसंदीदा माध्यम में24-अच्छी तरह से प्लेट के 5 x 10 4 कोशिकाओं /अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्लेट पर लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइन प्लेट करें (चरण 2.4 में निर्धारित। कैस 9 प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 24-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  3. तैयार 5 'और 3' गाइड आरएनए के साथ लेंटी-आईसीएएस 9 कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें।
    1. संश्लेषित सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ 10 μM की स्टॉक एकाग्रता में पुनर्गठित करें।
    2. चरण 3.1 में डिज़ाइन किए गए प्रयोगात्मक मानचित्र के आधार पर लक्षित एमआईआरएनए लोकस प्रति चार 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें, चार संभावित 5 'और 3' सीआरआरएनए जोड़ी संयोजनों (5'ए + 3'ए; 5'ए + 3'बी; 5'बी + 3'ए; 5'बी + 3'बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    3. प्रत्येक ट्यूब में, निम्नलिखित प्रतिक्रिया (10 μL की अंतिम मात्रा) का उपयोग करके 2 μM गाइड आरएनए कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए ट्रैकआरएनए और अद्वितीय सीआरआरएनए (5 'और 3') के 1: 1 दाढ़ अनुपात को एक साथ मिलाएं:
      1. 2.5 μL ट्रेकआरएनए (10 μM स्टॉक), 5 'तैनात सीआरआरएनए (10 μM स्टॉक) का 1.25 μL, 3' स्थित सीआरआरएनए (10 μM स्टॉक) का 1.25 μL, और 10 mM TRIS-एचसीएल पीएच 7.5 के 5 μL को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 16,000 × ग्राम पर 30 एस के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं।
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए, गाइड आरएनए जटिल प्रतिक्रिया (50 μL कुल मात्रा) के 10 μL करने के लिए कम सीरम माध्यम (उदाहरण के लिए, ऑप्टी-एमईएम) के 40 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं।
    5. एक साफ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, अभिकर्मक अभिकर्मक28 के 2 μL मिश्रण (नोट 3.3.5.1.) और कम सीरम माध्यम के 48 μL (उदाहरण के लिए, ऑप्टी-एमईएम, 50 μL की अंतिम मात्रा) धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      1. अभिकर्मक (2 μL) और कम सीरम माध्यम (जैसे, ऑप्टी-एमईएम, 48 μL) राशियों को ट्रांसफ़ेक्ट होने वाले कुओं की संख्या से गुणा करके अभिकर्मक अभिकर्मक का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें, साथ ही मामूली पाइपिंग अशुद्धियों के लिए खाते में 10% अतिरिक्त मात्रा।
        नोट: एक अभिकर्मक अभिकर्मक का चयन करें जो छोटे आरएनए और सीआरआईएसपीआर आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अभिकर्मक के साथ-साथ सेल लाइन प्रकार28 के लिए अनुकूलित है।
    6. गाइड आरएनए मिश्रण (चरण 3.3.4 से) के 50 μL युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए, पतला अभिकर्मक अभिकर्मक के 50 μL (चरण 3.3.5 से.) जोड़ें। मिश्रण को एक बार मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करें। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    7. अभिकर्मक मिश्रण के 100 μL युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए डॉक्स (इष्टतम एकाग्रता) के साथ पूरक एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के 400 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट करें।
  4. डॉक्स-प्रेरित लेंटी-आईसीएएस 9 कोशिकाओं से माध्यम निकालें (चरण 3.2.)। 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रयोगात्मक मानचित्र (चरण 3.1.) के आधार पर मीडिया/डॉक्स/गाइड आरएनए/अभिकर्मक मिश्रण के 500 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं सेते हैं।
  5. डॉक्स के बिना ताजा पसंदीदा माध्यम के साथ माध्यम को बदलें (कोशिकाओं से कैस 9 प्रोटीन को साफ़ करने के लिए)। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक और 24-48 घंटे के लिए ठीक करने की अनुमति दें।
  6. ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (ट्रिप्सिनाइजेशन) को हार्वेस्ट करें और जीनोटाइपिंग और सिंगल-सेल कमजोर पड़ने के लिए तैयार करें।
    नोट: कोशिकाएं एक मिश्रित आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसमें ट्रांसफेक्टेड सीआरआईएसपीआर जीन-संपादित और असंक्रमित जंगली प्रकार की कोशिकाएं होती हैं। यह कदम एकल-सेल कॉलोनी विस्तार में समय / संसाधनों का निवेश करने से पहले सीआरआईएसपीआर संपादन की दक्षता निर्धारित करेगा।
    1. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं 1x धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 100 μL में कोशिकाओं सेते हैं और मध्यम के 1 एमएल युक्त एक साफ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए कोशिकाओं हस्तांतरण।
    2. मिश्रण और 20 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं माइक्रोसेंट्रिफ्यूज करने के लिए पलटें। माध्यम निकालें और पीबीएस के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए धोया कोशिकाओं माइक्रोसेंट्रिफ्यूज। पीबीएस निकालें और पसंदीदा माध्यम के 150 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल गिनती उपकरण का उपयोग करके पुन: निलंबित कोशिकाओं के 150 μL के प्रति माइक्रोलीटर सेल संख्या निर्धारित करें।
  8. पुन: निलंबित कोशिकाओं के 150 μL को तीन भागों में अलग करें।
    1. दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोवियल्स में मध्यम प्लस 10% डीएमएसओ (150 μL की अंतिम मात्रा) में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (50 μL) के 1/3 फ्रीज करें।
    2. जीनोटाइपिंग के लिए एक साफ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (50 μL) के 1/3 स्थानांतरण।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज करें और माध्यम को हटा दें।
      2. पीबीएस के 100 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज करें और पीबीएस को हटा दें। -80 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित-जनसंख्या सेल छर्रों को लंबे समय तक स्टोर करें।
      4. धारा 4 में वर्कफ़्लो का उपयोग करके जीनोटाइपिंग के लिए सेल गोली को संसाधित करें।
    3. एकल सेल कालोनियों उत्पन्न करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में कमजोर पड़ने और चढ़ाना के लिए कोशिकाओं (50 μL) के अंतिम 1/3 तैयार करें।
      1. चरण 3.7 में सेल गिनती के आधार पर, 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 100 μL में 10, 5, 2, और 1 सेल (ओं) को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की गणना करें।
      2. एक 12-चैनल मल्टी-पिपेटर और एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय का उपयोग करके, प्रत्येक कमजोर पड़ने (10, 5, 2, या 1 सेल प्रति अच्छी तरह से) के लिए प्लेट की दो पंक्तियों (कुल 24 कुओं) में प्रति पतला कोशिकाओं के 100 μL जोड़ें। कोशिकाओं को एकल-कोशिका कॉलोनी विस्तार के लिए संगम तक बढ़ने के लिए 4-6 सप्ताह की अनुमति दें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत साप्ताहिक कोशिकाओं का निरीक्षण करें और ध्यान दें कि क्या कॉलोनियां एकल- या एकाधिक-सेल कॉलोनियों का प्रतिनिधित्व करती हैं।
      3. जीनोटाइपिंग (धारा 4) के लिए ~ 10-15 एकल सेल कालोनियों ले लीजिए। प्रत्येक लक्षित एमआईआरएनए लोकस के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र, नॉकआउट, एकल-सेल कॉलोनी लाइनों की पहचान करें। नियंत्रण के रूप में जंगली-प्रकार एकल-कक्ष रेखाएँ बनाए रखें.
        नोट: स्क्रीनिंग संख्या सेल लाइन प्रकार और सेल विकास / व्यवहार्यता पर एमआईआरएनए नॉकआउट फेनोटाइप के प्रभाव पर निर्भर करेगी।

4. क्रूड सेल लाइसेट्स का उपयोग करके सीआरआईएसपीआर सेल लाइनों का पीसीआर जीनोटाइपिंग

  1. 96-अच्छी तरह से प्लेट के निकट-संगम कुओं से व्यक्तिगत, एकल-कोशिका कॉलोनियों को हार्वेस्ट करें।
    नोट: इन चरणों में वर्णित मध्यम / पीबीएस को हटाने को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, लेकिन क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए सावधान रहें। एस्पिरेटिंग करते समय 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक नया बाँझ "पीला" 200 μL पिपेटमैन टिप का उपयोग करें, जिसमें प्रत्येक आदान-प्रदान की गई पीली टिप को वैक्यूम एस्पिरेटर से जुड़े बाँझ ग्लास चरागाह पिपेट के अंत में दृढ़ता से रखा जाता है।
    1. पीबीएस के 100 μL के साथ कुओं 1x धो लें। पीबीएस की आकांक्षा करें।
    2. ट्रिप्सिन के 50 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर2-5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करें और पुन: निलंबित कोशिकाओं को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल मध्यम हो।
    4. मिश्रण और धीरे 20 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज में कोशिकाओं गोली करने के लिए पलटना।
    5. माध्यम निकालें और पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। गोली को बाधित करने और मिश्रण करने के लिए कई बार उल्टा करने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे झटका दें।
    6. कोशिकाओं गोली करने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज।
    7. पीबीएस निकालें और ताजा पीबीएस के 300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    8. 300 μL नमूने को दो भागों में विभाजित करें।
      1. कोशिकाओं के 200 μL स्थानांतरण (गोली के 2/3) पसंदीदा माध्यम के 1 एमएल युक्त एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के लिए। एक बार जीनोटाइप मान्य हो जाने के बाद, कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता नॉकआउट सेल लाइनों का विस्तार करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करें।
      2. एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए कोशिकाओं (गोली के 1/3) के 100 μL स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज। पीबीएस निकालें। गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. चरण 1.3 में डिज़ाइन किए गए पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करके जीनोटाइपिंग और अनुक्रम विश्लेषण के लिए क्रूड सेल लाइसेट्स तैयार करें। जंगली प्रकार के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए इन प्रयोगों में अपरिवर्तित कोशिकाओं से तैयार सेल लाइसेट्स शामिल करें।
    1. 5x डीएनए पोलीमरेज़ बफर के 4 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका, अंतिम एकाग्रता 1x देखें), प्रोटीनेज के 1 μL (20 एनजी / एमएल स्टॉक), आरएनएएसई ए के 1 μL (10 एनजी / एमएल स्टॉक), और 20 μL की कुल मात्रा तक न्यूक्लियस मुक्त पानी।
    2. एक पीसीआर कार्यक्रम का उपयोग कर एक थर्मोसाइक्लर में कोशिकाओं को लाइज़ करें: 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस। -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल लाइसेट्स स्टोर करें।
    3. डिज़ाइन किए गए पीसीआर प्राइमरों (आगे, रिवर्स) का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया करें जो गाइड आरएनए 5 'और 3' गाइड आरएनए लक्षित साइटों (तालिका 1) को फ्लैंक करते हैं।
      नोट: डीएनए पोलीमरेज़ बफर और थर्मोसाइक्लर की स्थिति पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले टैक डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम पर निर्भर करेगी। इस प्रोटोकॉल को एक फुजन एचएफ डीएनए पोलीमरेज़ के लिए अनुकूलित किया गया था।
      1. बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें: 5 एक्स डीएनए पोलीमरेज़ बफर के 5 μL, फॉरवर्ड पीसीआर प्राइमर (10 μM स्टॉक) के 0.5 μL, रिवर्स पीसीआर प्राइमर (10 μM स्टॉक) के 0.5 μL, 10 एमएम डीएनटीपी के 0.5 μL, डीएनए पोलीमरेज़ के 0.25 μL, सेल लाइसेट के 1-4 μL, और न्यूक्लियस मुक्त पानी की कुल मात्रा तक
      2. कार्यक्रम का उपयोग करके थर्मोसाइक्लर में पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं: 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, और 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 15 एस के लिए 62 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और फिर 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पकड़ो। नोट 4.2.3 देखें। ऊपर।
    4. वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के लिए पीसीआर उत्पादों को 1% एगरोज जेल पर लोड करें।
    5. नॉकआउट (और जंगली प्रकार) जीनोटाइप के लिए भविष्यवाणी की आणविक आकार के पृथक पीसीआर टुकड़ों से डीएनए निकालें। डीएनए अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करें।
    6. मान्य करें कि सीआरआईएसपीआर प्रतिक्रिया सफल रही और कैस 9 दरार साइट की पहचान करने और एमआईआरएनए लोकस विलोपन की पुष्टि करने के लिए पृथक पीसीआर टुकड़ों के डीएनए अनुक्रमण का प्रदर्शन करें।
      1. सीआरआईएसपीआर द्वारा लक्षित प्रत्येक एमआईआरएनए लोकस के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र नॉकआउट सेल लाइनों को अलग करें। डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक अध्ययनों में नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए जंगली प्रकार (और विषमयुग्मजी) सेल लाइनों को बनाए रखें।
      2. यह पुष्टि करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर या उत्तरी धब्बा विश्लेषण करें कि नॉकआउट सेल लाइनें हटाए गए स्थान के लिए परिपक्व एमआईआरएनए व्यक्त नहीं करती हैं।
        नोट: पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) सीआरआईएसपीआर जीन संपादन और ऑफ-टारगेटिंग को मान्य करने के लिए सबसे निश्चित तरीका है।
      3. पीसीआर द्वारा सीआरआईएसपीआर ऑफ-टारगेटिंग प्रभावों के लिए परीक्षण, जो कम्प्यूटेशनल रूप से भविष्यवाणी की गई थी (चरण 1.2.3। 24,25,26,27.
      4. यदि व्यापक एकल-कोशिका कॉलोनी स्क्रीनिंग के परिणामस्वरूप केवल विषमयुग्मजी जीनोटाइप होते हैं, तो एकल-कोशिका विषमयुग्मजी लाइनों में गाइड आरएनए अभिकर्मक दोहराएं।
        नोट: समरूप नॉकआउट सेल लाइनों को प्राप्त करने में असमर्थता एमआईआरएनए हानि या माता-पिता की सेल लाइन के अंतर्निहित जीनोमिक जटिलता (जैसे, गुणसूत्र दोहराव /

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Representative Results

इस उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर विलोपन प्रोटोकॉल को एमआईआर -888 क्लस्टर को लक्षित करने वाले सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड गाइड आरएनए के साथ कैस 9-इंड्यूसिबल एलएनसीएपी और पीसी 3-एमएल मानव कैंसर सेल लाइनों के अभिकर्मक का उपयोग करके सफलतापूर्वक नियोजित किया गया था, जिसका अध्ययन प्रोस्टेट कैंसर के संदर्भ में किया गया था। एमआईआर -888 क्लस्टर को शुरू में एक अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग स्क्रीन में निम्न-ग्रेड और गैर-कैंसर रोगियों 9,10 की तुलना में उच्च ग्रेड रोग वाले प्रोस्टेट कैंसर रोगियों में ऊंचा होने के रूप में पहचाना गया था। 35,124 बीपी तक फैले एमआईआर -888 क्लस्टर में मानव गुणसूत्र एक्सक्यू 27.3 (चित्रा 2 ए) पर सात एमआईआरएनए (एमआईआर -892 सी, -890, -888, -892 ए, -892 बी, -891 बी और -891 ए) शामिल हैं। यह स्थान एचपीसीएक्स 1 (वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर, एक्स-लिंक्ड 1, एक्सक्यू 27-28) के भीतर स्थित है, जो वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर 11,12,13,14,15,29 से जुड़ा हुआ है। एमआईआर -888, -890, -892 ए, -892 बी, और -892 सी शेयर अनुक्रम होमोलॉजी और स्तनधारी-संरक्षित एमआईआर -743 परिवार से संबंधित हैं। क्लस्टर सदस्य एमआईआर -891 ए और एमआईआर -891 बी केवल एक दूसरे के साथ अनुक्रम होमोलॉजी साझा करते हैं और प्राइमेट-विशिष्ट एमआईआर -891 परिवार से संबंधित हैं। एमआईआर -888 क्लस्टर का जीनोमिक संगठन प्राइमेट्स में संरक्षित है, जो एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग नेटवर्क30 के कार्यात्मक संरक्षण को दर्शाता है।

व्यक्तिगत एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्य गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक ओवरएक्सप्रेशन (एमआईआरएनए मिमिक्स) और निषेध (एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स) अध्ययनों का उपयोग करके पिछले काम ने मैट्रिगेल बॉयडेन चैंबर परख 9,10 का उपयोग करके प्रोस्टेट कैंसर सेल आक्रामकता को बढ़ावा देने के लिए सभी एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के लिए एक अतिव्यापी भूमिका का खुलासा किया। सबसे विशेष रूप से, एमआईआर -888 और एमआईआर -891 ए ने प्रोस्टेट सेल विकास (डब्ल्यूएसटी -1 परख) को प्रेरित करने, माउस ज़ेनोग्राफ्ट में प्रोस्टेट ट्यूमर लोड में तेजी लाने और सामान्य लक्ष्यों (जैसे, टीआईएमपी -2) 9,10 को विनियमित करने के लिए इसी तरह कार्य किया। हालांकि, इस काम ने एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के बीच अधिक जटिल बातचीत का सुझाव दिया। उदाहरण के लिए, एमआईआर -888 और एमआईआर -891 ए ने पीसी 3-एन प्रोस्टेट सेल प्रसार को बढ़ावा देने में सहक्रियात्मक प्रभाव दिखाया, जबकि एमआईआर -890 और एमआईआर -892 सी दोनों ने डब्ल्यूएसटी -1 परख9 का उपयोग करके निरोधात्मक विकास प्रभाव दिखाया। इसलिए, प्रोस्टेट कैंसर के संदर्भ में एमआईआर -888 क्लस्टर नेटवर्क से आनुवंशिक रूप से पूछताछ करने के लिए इस उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर प्रोटोकॉल को नियोजित किया गया था।

सीआरआईएसपीआर कैस 9 जीन संपादन (चित्रा 1) के लिए वर्णित वर्कफ़्लो ने 24-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करके एक प्रयोग में 32 अद्वितीय सीआरआईएसपीआर गाइड आरएनए अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं के परीक्षण की अनुमति दी। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप मानव प्रोस्टेट कैंसर नॉकआउट सेल लाइनों के एक पैनल की सफल पहचान हुई, जिसमें पूरे एमआईआर -888 क्लस्टर, विशिष्ट एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्य संयोजन और व्यक्तिगत एमआईआरएनए सदस्यों के लिए विलोपन ले जाया गया। स्थिर उत्प्रेरणीय कैस 9 सेल लाइनों की पीढ़ी पहली बार स्थापित की गई थी। संक्षेप में, पीसी 3-एमएल और एलएनसीएपी मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाएं एक डॉक्स-इंड्यूसिबल स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस कैस 9 लेंटीवायरस वेक्टर (लेंटी-आईसीएस 9) से संक्रमित थीं। एडिटर इंड्यूसिबल लेंटिवायरल एचईएफ 1 एब्लास्टकैस 9 न्यूक्लियस कण; एमओआई 0.3) वायरस विषाक्तता के लिए अंतर्निहित सेल लाइन संवेदनशीलता के आधार पर 6 घंटे (एलएनसीएपी) या रात भर (पीसी 3-एमएल) के लिए।

संक्रमित सेल लाइनों ने बाद में ब्लास्टिसिडिन चयन (7.5 μg / एमएल) और एकल-कोशिका कॉलोनी विस्तार किया। पश्चिमी धब्बा अध्ययन का उपयोग एकल-कॉलोनी पीसी 3-एमएल और एलएनसीएपी लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों का चयन करने के लिए किया गया था जो डॉक्स-प्रेरण समय पाठ्यक्रम (चित्रा 2 ए) के आधार पर सबसे मजबूत कैस 9 अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। इस लेंटिवायरल कैस 9 उत्प्रेरणीय प्रणाली को कसकर नियंत्रित किया गया था, और, 120 घंटे के लिए डॉक्स वापसी पर, अधिकांश कैस 9 प्रोटीन कोशिकाओं (चित्रा 2 ए) से साफ हो गया था। एक डॉक्स एकाग्रता वक्र ने निर्धारित किया कि 250 एनजी / एमएल डॉक्स इन लेंटी-आईसीएस 9 प्रोस्टेट सेल लाइनों (चित्रा 2 बी) में मजबूत कैस 9 प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इष्टतम खुराक थी। एक ऑनलाइन सीआरआरएनए डिज़ाइन टूल23 का उपयोग करते हुए, अद्वितीय सीआरआरएनए (चार संभावित 5 'और 3' गाइड आरएनए संयोजनों की अनुमति देने के लिए प्रत्येक नियोजित एमआईआरएनए नॉकआउट लोकस को फ्लैंक करते हुए दो 5 'और दो 3' सीआरआरएनए) को डिजाइन किया गया था जो पूरे ~ 35 केबी एमआईआर -888 क्लस्टर क्षेत्र को लक्षित करता था; एमआईआर -743 परिवार या एमआईआर -891 परिवार के भीतर छोटे क्लस्टर संयोजन; साथ ही व्यक्तिगत एमआईआरएनए विलोपन (एमआईआर -888, -891 ए) (चित्रा 3 ए)। सीआरआईएसपीआर प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, मानव प्रोस्टेट कैंसर लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइनों को कैस 9 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 48 घंटे के लिए 250 एनजी / एमएल डॉक्स के साथ पूरक माध्यम में उगाया गया था।

कोशिकाओं को तब सिंथेटिक सार्वभौमिक ट्रैकआरएनए कॉम्प्लेक्स (1: 1 दाढ़ अनुपात) के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में 5 'और 3' जीनोमिक साइट-विशिष्ट सीआरआरएनए (तालिका 2) के एक अनूठे सेट के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था। प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं से कैस 9 प्रोटीन को साफ करने के लिए डॉक्स को सेल संस्कृति माध्यम 48 घंटे पोस्ट अभिकर्मक से हटा दिया गया था। कुओं को 48 घंटे बाद (96 घंटे बाद अभिकर्मक) काटा गया था और प्रत्येक कटाई सेल गोली का एक तिहाई कच्चे सेल लाइसेट्स (तालिका 3) का उपयोग करके पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए तैयार किया गया था। पीसीआर प्रतिक्रियाओं के जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण ने संकेत दिया कि नॉकआउट जीनोटाइप का प्रतिनिधित्व करने वाले अनुमानित डीएनए टुकड़े का आकार प्रत्येक सीआरआईएसपीआर अभिकर्मक (चित्रा 3 बी) के लिए प्रवर्धित किया गया था। इन पृथक नॉकआउट पीसीआर टुकड़ों के डीएनए अनुक्रमण ने पुष्टि की कि ट्रांसफेक्टेड 5 'और 3' गाइड आरएनए ने सीएएस 9 दरार / बंधाव ~ पीएएम साइटों के अपस्ट्रीम 3 एनटी को निर्देशित किया और लक्षित एमआईआरएनए लोकस के जीनोमिक नुकसान को मान्य किया ( चित्रा 4 सी में दिखाया गया प्रतिनिधि उदाहरण)। चूंकि एमआईआर -888 क्लस्टर गुणसूत्र एक्स (किसी भी प्रोटीन-कोडिंग जीन से दूर) के एक इंटरजेनिक क्षेत्र में रहता है, इसलिए यह अनुमान नहीं लगाया गया था कि नॉकआउट सेल लाइनें, जो अक्सर एनएचईजे के कारण कैस 9 दरार साइट पर आईएनडीईएल के पास होती हैं, डाउनस्ट्रीम आर्टिफिशियल प्रभाव पैदा करेंगी।

यद्यपि सीआरआईएसपीआर अभिकर्मक प्रतिक्रियाएं सफल रहीं (चित्रा 3 बी), ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं ने ट्रांसफेक्टेड (नॉकआउट) और अनट्रांसफेक्टेड (जंगली-प्रकार) कोशिकाओं की मिश्रित-सेल आबादी का प्रतिनिधित्व किया। इस आबादी ने लक्षित एमआईआरएनए लोकस के लिए समरूप और विषमयुग्मजी विलोपन ले जाने वाली कोशिकाओं के मिश्रण का भी प्रतिनिधित्व किया। एलएनसीएपी और पीसी 3 प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनें असामान्य कैरियोटाइप रखने वाले पुरुषों से ली गई हैं जिनमें दो एक्स गुणसूत्र31,32 शामिल हैं। इसलिए, प्रत्येक सेल अभिकर्मक प्रतिक्रिया का एक हिस्सा एकल-सेल कॉलोनी लाइनों को प्राप्त करने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में क्रमिक रूप से पतला था। इन कॉलोनियों को पीसीआर द्वारा समरूप सेल लाइनों के लिए चयन करने के लिए जांच की गई थी जिसमें लक्षित एमआईआरएनए लोकस की सभी प्रतियों की कमी थी।

इस प्रक्रिया का समय पर पालन करना महत्वपूर्ण था क्योंकि पिछले आंकड़ों ने ट्यूमर सेल के विकास और रोग आक्रामकता को बढ़ावा देने में एमआईआर -888 क्लस्टर के लिए एक भूमिका का संकेत दिया है। एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के लिए सीआरआईएसपीआर विलोपन ले जाने वाली कैंसर कोशिकाओं को जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में धीमी गति से बढ़ने की भविष्यवाणी की गई थी। एक वैध चिंता यह थी कि, समय के साथ, गाइड आरएनए-ट्रांसफेक्टेड कुएं, जिसमें एमआईआरएनए नॉकआउट और जंगली प्रकार की कोशिकाओं की मिश्रित आबादी होती है, जिसके परिणामस्वरूप जंगली प्रकार की कोशिकाएं संस्कृति में समझौता उत्परिवर्ती कोशिकाओं को तेजी से पछाड़ देंगी। यह होने के लिए नोट किया गया था और विशेष रूप से अत्यधिक आक्रामक पीसी 3-एमएल सेल लाइनों का उपयोग करके प्रयोगों में उच्चारण किया गया था। इस प्रकार, मिश्रित जनसंख्या नमूनों में नॉकआउट कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए सीआरआईएसपीआर अभिकर्मक प्रयोगों को करने के बाद क्रायोस्टोरेज के लिए एकल-सेल कॉलोनी लाइनों या सेल तैयारी उत्पन्न करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने वाले चरणों को 48-72 घंटे के भीतर किया गया था।

एमआईआर -888 क्लस्टर के लिए सीआरआईएसपीआर वर्कफ़्लो का सबसे श्रमसाध्य हिस्सा समरूप, एकल-सेल कॉलोनी एमआईआरएनए विलोपन की पीढ़ी थी। इस प्रक्रिया में एक चुनौती यह थी कि सुसंस्कृत एलएनसीएपी और पीसी 3-एमएल कोशिकाएं आमतौर पर एकल-कोशिका घनत्व पर चढ़ाए जाने पर अच्छी तरह से पनपती नहीं थीं। इसके अलावा, सेल वृद्धि एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों (और सेल लाइन की आक्रामकता के साथ सहसंबद्ध) के संयोजन हानि पर फेनोटाइपिक रूप से समझौता किया गया प्रतीत होता है। इसलिए, कुछ एमआईआरएनए लोकस संयोजनों को लक्षित करने वाली कुछ अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं के लिए, जीनोटाइपिंग के लिए पर्याप्त एकल-सेल कॉलोनी लाइनों को उत्पन्न करने के लिए अतिरिक्त सेल कमजोर पड़ने (96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करके) की आवश्यकता थी। वैद्युतकणसंचलन जेल इमेजिंग द्वारा एकल-कोशिका उपनिवेशों के जीनोटाइप की जांच करते समय, नॉकआउट पीसीआर टुकड़ों की तुलना में वाइल्डटाइप की बैंड तीव्रता की तुलना करना और यह निर्धारित करना सहायक था कि सेल लाइन विषमयुग्मजी (समान बैंड तीव्रता) थी या एक बहु-सेल कॉलोनी (असमान बैंड तीव्रता) का प्रतिनिधित्व करती थी, जो एकल-कोशिका कमजोर पड़ने के अतिरिक्त दौर से लाभान्वित होगी। यदि सेल कॉलोनियों को असामान्य आकार के पीसीआर टुकड़ों के अधिकारी और जंगली प्रकार या नॉकआउट जीनोटाइप के साथ असंगत होने का उल्लेख किया गया था, तो इन लाइनों को अध्ययन से हटा दिया गया था।

जंगली प्रकार और नॉकआउट जीनोटाइप के लिए संगत पृथक पीसीआर टुकड़ों के डीएनए अनुक्रमण को प्रत्येक स्थापित एकल-कोशिका कॉलोनी के लिए फिर से मान्य किया गया था और स्वतंत्र तरीकों (यानी, क्यूआरटी-पीसीआर, डब्ल्यूजीएस) का उपयोग करके पुष्टि की गई थी। इन प्रयोगों में समरूप शून्य सेल लाइनों को उत्पन्न करने की विशिष्ट दक्षता के संदर्भ में, यह लक्षित एमआईआरएनए लोकस और उपयोग किए गए सेल प्रकार के साथ भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, एलएनसीएपी का उपयोग करके एकल-कॉलोनी मीर -891 ए नॉकआउट लाइनों को प्राप्त करने में दक्षता 30% थी, लेकिन पीसी 3-एमएल कोशिकाओं में ~ 7% तक गिर गई। यह अंतर अंतर्निहित सेल प्रकार के अंतर के कारण हो सकता है (उदाहरण के लिए, पीसी 3-एमएल कोशिकाओं में एलएनसीएपी कोशिकाओं की तुलना में उच्च विभाजन दर / सीआरआईएसपीआर दक्षता अंतर एमआईआरएनए हानि के कार्यात्मक प्रभाव को भी प्रतिबिंबित कर सकता है (उदाहरण के लिए, एमआईआर -891 ए सेल विकास और आक्रामकता 9,10 को बढ़ावा देता है) और इस प्रकार, नॉकआउट फेनोटाइप को पीसी 3-एमएल जैसे अधिक आक्रामक सेल लाइनों में बढ़ाया जा सकता है। एमआईआर -888 क्लस्टर के बड़े एमआईआरएनए लोकस विलोपन के लिए एकल-कॉलोनी लाइनों को प्राप्त करने से कम क्षमता का प्रदर्शन हुआ। हम यह निर्धारित करने में असमर्थ थे कि क्या यह डीएनए के बड़े क्षेत्रों को खटखटाने के कारण था या प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं में एमआईआर -888 सदस्यों की आवश्यक और अतिव्यापी कार्यात्मक भूमिकाओं को रेखांकित करता था।

इस वर्कफ़्लो से उत्पन्न एकल-सेल कॉलोनी-विस्तारित नॉकआउट एमआईआर -888 क्लस्टर सेल लाइनों का विस्तृत विवरण और फेनोटाइपिक विश्लेषण चल रहा है और कहीं और प्रकाशित किया जाएगा। इन सीआरआईएसपीआर जीन संपादन अध्ययनों में उत्पन्न एमआईआरएनए विलोपन के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, एलएनसीएपी प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के लिए निष्कर्ष एक व्यक्तिगत मीर -891 ए विलोपन ले जाते हैं। एकल सेल कालोनियों पीसीआर और अनुक्रम सत्यापित (चित्रा 4 ए-सी) द्वारा जीनोटाइप किए गए थे। असामान्य आकार के पीसीआर टुकड़ों का प्रदर्शन करने वाली सेल लाइनों का विश्लेषण नहीं किया गया था (उदाहरण के लिए, क्लोन एल 14 एच 7 चित्रा 4 डी में दिखाया गया है)। एक बार मीर -891 ए लोकस के लिए नॉकआउट और जंगली प्रकार के एकल-सेल कॉलोनियों को प्राप्त किया गया था, कार्यात्मक अध्ययन किए गए थे। पिछले काम से पता चला है कि एमआईआर -891 ए (एमआईआरएनए मिमिक लेंटिवायरल वेक्टर) की अधिकता प्रोस्टेट सेल विकास9 को प्रेरित करती है और इसलिए, यह भविष्यवाणी की गई थी कि एमआईआर -891 ए हानि पारस्परिक प्रभाव दिखाएगी। मीर -891 ए नॉकआउट और जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में डब्ल्यूएसटी -1 प्रसार परख ने इस परिकल्पना की पुष्टि की, और एमआईआर -891 ए नुकसान के परिणामस्वरूप धीमी वृद्धि हुई (चित्रा 4 डी, ई)।

Figure 1
चित्रा 1: सीआरआईएसपीआर जीन संपादन वर्कफ़्लो एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन उत्पन्न करने के लिए। (ए) गाइड आरएनए में एनील्ड सिंथेटिक सीआरआरएनए और ट्रेक्रआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (मिश्रित 1: 1 दाढ़ अनुपात) होते हैं। सीआरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को लक्षित जीनोमिक डीएनए साइट के पूरक एक अद्वितीय 5'-टर्मिनल 20 एनटी गाइड अनुक्रम (पीला) शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इसके बाद एक अपरिवर्तनीय 22 एनटी स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस रिपीट सीक्वेंस (हरा) होता है जो ट्रैकरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ बेस-पेयर होता है। लाल तीर कैस 9 एंजाइम डबल-फंसे डीएनए दरार साइटों को इंगित करते हैं जो आमतौर पर पीएएम के 3 एनटी अपस्ट्रीम में स्थित होते हैं। (बी) यह प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं को दर्शाता है। एक डॉक्स-उत्प्रेरणीय कैस 9 लेंटीवायरस वेक्टर (लेंटी-आईसीएएस 9, एमओआई 0.3) से संक्रमित कोशिकाओं को कैस 9 प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 48 घंटे के लिए डॉक्स के साथ माध्यम में उगाया जाता है। दो सिंथेटिक गाइड आरएनए (सीआरआरएनए का मिश्रित 1: 1 दाढ़ अनुपात:: ट्रैकआरएनए) कैस 9-प्रेरित कोशिकाओं में स्थानांतरित हो जाते हैं। गाइड आरएनए हटाने के लिए लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्र को फ्लैंक करते हुए जीनोमिक डीएनए साइटों (5 'और 3') के लिए कैस 9 एस्कॉर्ट करते हैं। पीसीआर जीनोटाइपिंग और डाउनस्ट्रीम फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए एकल-सेल कॉलोनियों को उत्पन्न करने के लिए 96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करके कमजोर पड़ने के लिए कोशिकाओं को 48 घंटे बाद अभिकर्मक तैयार किया जाता है। संक्षिप्त नाम: सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; एमआईआरएनए = माइक्रोआरएनए; सीआरआरएनए = सीआरआईएसपीआर आरएनए; ट्रैकरआरएनए = ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए; एनटी = न्यूक्लियोटाइड; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े एंडोन्यूक्लाइज; पीएएम = प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति; डॉक्स = डॉक्सीसाइक्लिन; एमओआई = संक्रमण की बहुलता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कैंसर सेल लाइनें एक डॉक्सीसाइक्लिन-उत्प्रेरणीय कैस 9 लेंटिवायरल कैसेट ले ती हैं जो तंग कैस 9 प्रोटीन विनियमन का प्रदर्शन करती हैं( ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि मानव प्रोस्टेट कैंसर पीसी 3-एमएल सेल लाइनें लेंटी-आईकैस 9 वेक्टर (एडिटआर इंड्यूसिबल लेंटीवायरल एचईएफ 1 एब्लास्टकैस 9 न्यूक्लियस पार्टिकल्स, एमओआई 0.3) से संक्रमित हैं और मध्यम में 48 घंटे के लिए उगाई जाती हैं। कैस 9 अभिव्यक्ति को जीएपीडीएच अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (बी) पीसी 3-एमएल कोशिकाओं को 48 घंटे और 120 घंटे (+ डॉक्स) के लिए 250 एनजी / एमएल डॉक्स के साथ मध्यम में उगाया गया मजबूत कैस 9 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाई दी। 120 घंटे (120 घंटे पोस्ट) के लिए मीडिया (-डॉक्स) से डॉक्स हटाने के परिणामस्वरूप कैस 9 प्रोटीन निकासी हुई, जैसा कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मापा गया था। एलएनसीएपी लेंटी-आईसीएएस 9 सेल लाइन (नहीं दिखाया गया) उत्पन्न करते समय इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे। संक्षिप्त नाम: सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े एंडोन्यूक्लाइज; डॉक्स = डॉक्सीसाइक्लिन; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक ही प्रयोग में कई एमआईआर -888 क्लस्टर विलोपन संयोजन उत्पन्न करने के लिए उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर प्रायोगिक डिजाइन. (ए) मानव गुणसूत्र एक्सक्यू 27.3 पर स्थित एमआईआर -888 क्लस्टर का आरेख, स्तनधारी-संरक्षित एमआईआर -743 परिवार के सदस्यों मीर -892 सी, -890, -888, -892 ए, और -892 बी (नीले बक्से) और प्राइमेट-विशिष्ट एमआईआर -892 बी (नीले बक्से) और प्राइमेट-विशिष्ट एमआईआर -892 बी (नीला बक्से) और प्राइमेट-विशिष्ट एमआईआर -892 बी (नीला बक्से) को दर्शाता है एमआईआर -888 क्लस्टर नॉकआउट संयोजन उत्पन्न करने के लिए अद्वितीय सिंथेटिक सीआरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (हरे तीर) का उपयोग किया गया था। फॉरवर्ड और रिवर्स पीसीआर प्राइमर (छोटे लाल आयत) को जीनोटाइप कोशिकाओं और नॉकआउट के लिए स्क्रीन के लिए डिज़ाइन किया गया था। (बी) यह प्रतिनिधि परिणाम ट्रांसफेक्टेड पीसी 3-एमएल कोशिकाओं (लेंटी-आईसीएएस 9) में 25 सीआरआईएसपीआर प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है जो एक ही प्रयोग में एमआईआर -888 क्लस्टर नॉकआउट संयोजनों की एक श्रृंखला को लक्षित करता है। 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक ट्रांसफेक्टेड कुएं में लक्षित एमआईआरएनए जीनोमिक लोकस (Δ) के 5 'और 3' पक्षों को फ्लैंक करने वाले दो अद्वितीय जीआरएनए होते हैं (जैसा कि तालिका 2 में सूचीबद्ध है)। प्रत्येक सीआरआईएसपीआर प्रतिक्रिया और पीसीआर जीनोटाइप के लिए क्रूड सेल लाइसेट्स तैयार किए गए थे। जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अनुमानित नॉकआउट आकारों पर पलायन करने वाले पृथक पीसीआर टुकड़े डीएनए-अनुक्रमित थे और लक्षित कैस 9 दरार और एमआईआरएनए लोकस हटाने के लिए मान्य थे। अनुमानित डब्ल्यूटी पीसीआर टुकड़ा बीपी आकार कोष्ठक में इंगित किए जाते हैं, और वांछित सीआरआईएसपीआर केओ पीसीआर टुकड़ा आकार जेल के तल पर दिखाया जाता है। संक्षिप्त नाम: सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े एंडोन्यूक्लाइज; जीआरएनए = गाइड आरएनए; डॉक्स = डॉक्सीसाइक्लिन; बीपी = बेस जोड़ी; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीआरआईएसपीआर जीन संपादन का उपयोग करके मीर -891 ए के लिए हटाए गए प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को दबाए गए प्रसार का प्रदर्शन करते हुए( ए) पीसीआर प्राइमरों (बैंगनी) का डिजाइन और दो 5 'और दो 3' गाइड आरएनए (नारंगी) मीर -891 ए जीन (हरा) को लक्षित करने वाले जीनोमिक अनुक्रमों को लक्षित करते हैं। (बी) संकेतित 5 'और 3' गाइड आरएनए के साथ ट्रांसफेक्टेड एलएनसीएपी कोशिकाओं के पीसीआर जीनोटाइपिंग ने पुष्टि की कि सभी चार गाइड आरएनए संयोजनों के लिए Δमीर -891 ए विलोपन प्राप्त किए गए थे। सेल लाइसेट्स मिश्रित-सेल आबादी से 48 घंटे बाद अभिकर्मक से बने थे। (सी) पीसीआर टुकड़ों को अनुक्रमित और मान्य किया गया था। एक प्रतिनिधि उदाहरण 5 ए (891 ए) और 3 बी (891 ए) गाइड आरएनए के साथ इलाज किए गए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के डीएनए अनुक्रम को दर्शाता है, जिसके परिणामस्वरूप अनुमानित कैस 9 दरार साइट (पीएएम साइट के 3 एनटी अपस्ट्रीम) और सीआरआईएसपीआर Δमीर -891 ए विलोपन होता है। (डी) एकल-सेल कॉलोनियों को प्राप्त किया गया और पीसीआर-जीनोटाइप किया गया। क्लोन एल 14 जी 9 को केओ के रूप में अनुक्रम-मान्य किया गया था और क्लोन एल 14 जी 9 मीर -891 ए जीन के लिए डब्ल्यूटी के रूप में। (ई) एमआईआर -891 ए को पहले प्रोस्टेट कैंसर सेल विकास को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था और इसलिए, एमआईआर -891 ए हानि को पारस्परिक फेनोटाइप होने की भविष्यवाणी की गई थी। मीर -891 ए (एल 14 जी 9 [केओ], ब्लू) के लिए हटाए गए प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के डब्ल्यूएसटी -1 परख ने डब्ल्यूटी कोशिकाओं (एल 14 जी 9 [डब्ल्यूटी], लाल) की तुलना में दबा हुआ प्रसार दिखाया। संक्षिप्त नाम: सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; कैस 9 = सीआरआईएसपीआर से जुड़े एंडोन्यूक्लाइज; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट; डब्ल्यूएसटी -1 = पानी में घुलनशील टेट्राज़ोलियम नमक -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीसीआर प्रतिक्रिया बर्फ पर स्थापित की जाती है।
घटक 25 μL प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता
5x डीएनए पोलीमरेज़ बफर 5 μL 1x
फॉरवर्ड पीसीआर प्राइमर (10 μM) 0.5 μL 0.2 μM
रिवर्स पीसीआर प्राइमर (10 μM) 0.5 μL 0.2 μM
10 एमएम डीएनटीपी 0.5 μL 200 μM
डीएनए पोलीमरेज़ (2 यू / 0.25 μL 0.125 यू / 25 μL
क्रूड सेल लाइसेट 1 - 4 μL परिवर्तनशील
न्यूक्लियस मुक्त पानी अप करने के लिए 25 μL
पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए थर्मोसाइक्लर की स्थिति:
क़दम तापमान समय
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड
35 चक्र 62 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
पकड 4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1: क्रूड लाइसेट जीनोटाइपिंग के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति। संक्षिप्त नाम: डीएनटीपी = डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स।

सीआरआईएसपीआर-लक्षित विलोपन साइट गाइड आरएनए संयोजन जंगली प्रकार (बीपी) नॉकआउट (बीपी) पीसीआर प्राइमर जोड़े
∆पूर्ण क्लस्टर 5 ए (891 ए) + 3 ए (892 सी)
5 बी (891 ए) + 3 ए (892 सी)
5 ए (891 ए) + 3 बी (892 सी)
5 बी (891 ए) + 3 बी (892 सी)		 35,664 389
496
378
485		 891 ए एफडब्ल्यूडी
892 सी आरईवी
∆892सी/890/888 5ए'(888)+3ए(892सी)
5 बी '(888) + 3 ए (892 सी)
5 ए'(888)+3बी(892सी)
5 बी '(888) + 3 बी (892 सी)		 2,739 478
487
467
476		 888 एफडब्ल्यूडी
892 सी आरईवी
∆892सी/890 3 ए'(888)+3ए(892सी)
3 बी '(888)+3ए(892सी)
3 ए'(888)+3बी(892सी)
3 बी '(888) + 3 बी (892 सी)		 2,739 710
754
699
743		 888 एफडब्ल्यूडी
892 सी आरईवी
∆892 बी / 5ए'(888)+5ए(892बी)
5 बी '(888)+5ए(892बी)
5ए'(888)+5बी(892बी)
5 बी '(888)+5बी(892बी)		 2,938 554
547
573
566		 892 बी एफडब्ल्यूडी
888 रेव
∆892 बी/ 892 ए / 5 ए (892 बी ) + 3 ए '(888)
5 ए (892 बी ) + 3 बी '(888)
5 बी (892 बी ) + 3 ए '(888)		 2,938 322
278
341		 892 बी एफडब्ल्यूडी
888 रेव
∆743 परिवार 5 ए (892 बी) + 3 ए (892 सी)
5 बी (892 बी) + 3 ए (892 सी)
5 ए (892 बी) + 3 बी (892 सी)
5 बी (892 बी) + 3 बी (892 सी)		 5,015 370
389
359
378		 892 बी एफडब्ल्यूडी
892 सी आरईवी
∆891 परिवार 5 ए (891 ए) + 3 ए (891 बी)
5 बी (891 ए) + 3 ए (891 बी)		 27,294 330
270		 891 ए एफडब्ल्यूडी
891 बी आरईवी
∆891ए 5 ए (891 ए) + 3 ए (891 ए)
5 ए (891 ए) + 3 बी (891 ए)
5 बी (891 ए) + 3 ए (891 ए)
5 बी (891 ए) + 3 बी (891 ए)		 554 333
273
454
394		 891 ए एफडब्ल्यूडी
891 ए रेव

तालिका 2: सीआरआईएसपीआर गाइड आरएनए एमआईआर -888 क्लस्टर नॉकआउट संयोजन उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। संक्षिप्त नाम: सीआरआईएसपीआर = क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक दोहराव; बीपी = बेस जोड़ी; एफडब्ल्यूडी = आगे; आरईवी = रिवर्स।

प्रवेशिका अनुक्रम टीएम (डिग्री सेल्सियस)
888 एफडब्ल्यूडी एजीजीसीएटीसीसीटीसीएटीएटीएजीटीएजी 52.2
888 रेव सीटीजीसीएजीएसीएजी 55.9
891 ए एफडब्ल्यूडी टीजीजीजीटीएजीटीएसीटीटीएसीटीएए 53.9
891 ए रेव टीटीसीएसीटीजीसीटीजीसीटीजीटीसी 54.8
891 बी आरईवी टीसीएटीसीटीजीसीटीजीसीटीएटीएटीजीटीसीसीटी 55.6
892 बी एफडब्ल्यूडी जीसीटीसीसीटीजीसीएएटीसीएटीसीटीएजीटीए 53.5
892 बी आरईवी सीटीसीटीएटीजीटीटीटीसीसीएजीटीजीटीजीसी 53.5
892 सी एफडब्ल्यूडी टीजीटीजीएजीसीएसीसीटीएजीटीटीएजीटीटीएजीटी 53.9
892 सी आरईवी सीएसीटीसीटीसीटीटीजीटीसीटीसीएटीजी 53.5

तालिका 3: जीनोटाइपिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्राइमर। संक्षिप्त नाम: एफडब्ल्यूडी = आगे; आरईवी = रिवर्स; टीएम = पिघलने का तापमान।

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Discussion

यह सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रक्रिया अन्वेषक को अद्वितीय एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन संयोजनों को ले जाने वाली सेल लाइनों के पूरे पैनल को जल्दी से उत्पन्न करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में सिंथेटिक ट्रैकआरएनए (1: 1 दाढ़ अनुपात) के साथ 5 'और 3' जीनोमिक साइट-विशिष्ट सीआरआरएनए से बना सिंथेटिक गाइड आरएनए का अभिकर्मक समय लेने वाले प्लास्मिड वेक्टर सबक्लोनिंग से बचा जाता है और 24-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करके अधिक लचीला और उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक डिजाइन की अनुमति देता है। एक डॉक्स-इंड्यूसिबल कैस 9 लेंटिवायरल कैसेट ले जाने वाली सेल लाइनों की पीढ़ी गाइड आरएनए के सेल अभिकर्मक के दौरान कसकर डॉक्स-विनियमित और मजबूत कैस 9 अभिव्यक्ति को सक्षम बनाती है और बाद के चरणों में संस्कृति माध्यम से डॉक्स वापसी पर इस जीवाणु प्रोटीन की तेजी से निकासी करती है। यह प्रक्रिया पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए क्रूड सेल लाइसेट्स पर भी निर्भर करती है, जिसके लिए विश्लेषण के लिए न्यूनतम सेल सामग्री की आवश्यकता होती है और महंगे और श्रम-गहन सिलिका कॉलम डीएनए शुद्धिकरण विधियों के उपयोग से बचा जाता है या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड सांद्रता को मापने की आवश्यकता होती है, आगे अन्वेषक के तरीकों को सुव्यवस्थित करता है।

दरअसल, यहां साझा किए गए प्रतिनिधि परिणामों ने एक ही प्रयोग में 32 अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों के साथ मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों को ट्रांसफेक्ट करने के लिए इस पद्धति का सफल अनुकूलन दिखाया और पूरे ~ 35 केबी एमआईआर -888 क्लस्टर क्षेत्र के लिए विलोपन ले जाने वाली कई एकल-सेल कॉलोनी नॉकआउट लाइनें उत्पन्न कीं; एमआईआर -743 और एमआईआर -891 ए परिवारों से संबंधित एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के लिए छोटे विलोपन संयोजन; साथ ही एमआईआर -888 क्लस्टर के भीतर व्यक्तिगत एमआईआरएनए सदस्यों के लिए विलोपन। इस वर्कफ़्लो ने मानव प्रोस्टेट रोग के संदर्भ में एमआईआर -888 क्लस्टर नेटवर्क को आणविक रूप से विच्छेदन करना शुरू करने के लिए एक मूल्यवान सेल लाइन संसाधन उत्पन्न किया और यह निर्धारित किया कि एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्य प्रोस्टेट ट्यूमर के विकास, कैंसर आक्रामकता और दवा प्रतिरोध (कहीं और प्रकाशित होने के लिए) को विनियमित करने के लिए एक दूसरे के साथ कार्यात्मक रूप से ओवरलैप या बातचीत कैसे करते हैं। ये अध्ययन महत्वपूर्ण होंगे क्योंकि यह शोध प्रोस्टेट कैंसर के उन्नत और मेटास्टैटिक रूपों वाले रोगियों के इलाज के लिए नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों की ओर बढ़ता है।

इस उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें जांचकर्ताओं को अन्य रोग संदर्भों में अतिरिक्त एमआईआरएनए क्लस्टर नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति को अपनाते समय सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए। सबसे पहले, इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम गाइड आरएनए का सावधानीपूर्वक डिजाइन है जो सीआरआईएसपीआर-मेडिकेटेड हटाने के लिए एमआईआरएनए क्लस्टर को फ्लैंक करता है, साथ ही व्यक्तिगत एमआईआरएनए या एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्यों के संयोजन को हटाने के लिए अतिरिक्त गाइड आरएनए भी है। अन्वेषक को आसपास के जीन या नियामक तत्वों को बाधित न करने के लिए सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए, खासकर यदि एमआईआरएनए क्लस्टर जीन इंट्रॉन के भीतर रहता है या किसी अन्य जीन के लिए एंटीसेंस स्थित है। सीआरआईएसपीआर ऑफ-टारगेटिंग भविष्यवाणी संसाधन 24,25,26,27 उपलब्ध हैं जो संश्लेषित करने के लिए सबसे भेदभावपूर्ण सीआरआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स चुनते समय शोधकर्ता की सहायता कर सकते हैं। यह वर्कफ़्लो प्रत्येक लक्षित एमआईआरएनए लोकस को फ्लैंक करने वाले दो 5 'और दो 3' सीआरआरएनए के डिजाइन का वर्णन करता है जो सीआरआईएसपीआर अभिकर्मक चरण में चार अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों का परीक्षण करने की अनुमति देता है और वांछित नॉकआउट सेल लाइन उत्पन्न करने की संभावना को बढ़ाता है। हालांकि, अन्वेषक को किसी विशेष एमआईआरएनए जीन लोकस को बाधित करने के लिए सफलतापूर्वक काम करने के लिए इन गाइड आरएनए संयोजनों में से केवल एक की आवश्यकता होती है।

दूसरा, अन्वेषक को सीआरआईएसपीआर जीन संपादन के लिए कोशिकाओं को कैस 9 देने के लिए सबसे उपयुक्त तरीका तय करना चाहिए। इस प्रक्रिया में डॉक्स-इंड्यूसिबल कैस 9 लेंटिवायरल अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग किया गया था, लेकिन कैस 9 प्रोटीन उत्पादन (जैसे, कैस 9 पुनः संयोजक प्रोटीन, कैस 9 एमआरएनए वितरण, या पारंपरिक कैस 9 अभिव्यक्ति प्लास्मिड वेक्टर सिस्टम का उपयोग) के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण आसानी से इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रयोगात्मक विचार कैस 9 क्षणिक अभिव्यक्ति बनाम स्थिर लेंटिवायरल अभिव्यक्ति सेल लाइनों को उत्पन्न करने के उपयोग को निर्देशित कर सकते हैं, प्रमोटर कैस 9 (सर्वव्यापी, सेल प्रकार-विशिष्ट, प्रेरक) को चलाने के लिए उपयोग किया जाता है, और ब्याज की कोशिकाओं (यानी, एंटीबायोटिक प्रतिरोध) के लिए कैस 9 अभिव्यक्ति वेक्टर वितरण सुनिश्चित करने के लिए सकारात्मक /

तीसरा, गाइड आरएनए डिलीवरी के बाद 48-72 घंटे के भीतर मिश्रित-जनसंख्या ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को जल्दी से जीनोटाइप करना महत्वपूर्ण है, इस घटना में कि एमआईआरएनए क्लस्टर का नुकसान कोशिकाओं की व्यवहार्यता / उदाहरण के लिए, प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों में एमआईआर -891 ए जैसे ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले कारकों को हटाते समय, यह ध्यान दिया गया कि ये मीर -891 ए नॉकआउट कोशिकाएं अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में धीमी हो गईं और बाद में, जंगली प्रकार की कोशिकाएं जल्दी से सेल आबादी से आगे निकल गईं। अंत में, जीनोटाइपिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान एमआईआरएनए लोकस हटाने को सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सत्यापन विधियों को एकीकृत करना महत्वपूर्ण है, खासकर बड़े जीनोमिक विलोपन के लिए। इन उपायों में आंतरिक पीसीआर जीनोटाइपिंग नियंत्रणों का उपयोग करना शामिल है जो केवल तभी पता लगाया जाता है जब जंगली प्रकार का एलील मौजूद है और यह सुनिश्चित करने के लिए एकल-सेल कॉलोनियों पर क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण कर रहा है कि नॉकआउट सेल लाइनें लक्षित एमआईआरएनए को व्यक्त नहीं कर रही हैं। ये सभी विचार अन्वेषक के लिए सफल परिणाम सुनिश्चित करेंगे।

प्रयोगशाला में इस सीआरआईएसपीआर तकनीक को शामिल करते समय कुछ स्पष्ट सीमाओं का सामना करना पड़ा। उदाहरण के लिए, कई एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन संयोजनों को जल्दी से उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित गाइड आरएनए अभिकर्मक चरणों की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति के बावजूद, इस प्रक्रिया का दर-सीमित चरण जीनोटाइप स्क्रीनिंग और प्रत्येक सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता एमआईआरएनए विलोपन के लिए एकल-कॉलोनी सेल लाइनों का विस्तार था। इस प्रोटोकॉल में सकारात्मक चयन रणनीतियों का समावेश एक फायदा होगा; हालाँकि, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में उगाई गई एकल-सेल कॉलोनी से एक लाइन का विस्तार करने में अभी भी ~ 3-4 सप्ताह लगेंगे। दरअसल, एमआईआरएनए लोकस नॉकआउट प्लस जंगली प्रकार की कोशिकाओं के प्रति कम से कम तीन स्वतंत्र एकल-कॉलोनी सेल लाइनों का संग्रह यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि परख किए गए फेनोटाइप विरूपण साक्ष्य / ऑफ-टारगेटिंग प्रभावों के कारण नहीं हैं, लेकिन यह फिर से इस प्रक्रिया की समय लेने वाली प्रकृति में जोड़ता है। अन्वेषक को समरूप शून्य सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर जीन संपादन के कई राउंड करने की भी आवश्यकता हो सकती है। यह विशेष रूप से स्थापित अमर कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके अध्ययनों में स्पष्ट है जो अक्सर गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था और असामान्य कैरियोटाइप के जटिल जीनोमिक परिदृश्य के अधिकारी होते हैं।

उदाहरण के लिए, इस प्रतिनिधि अध्ययन ने एमआईआर -888 क्लस्टर के लिए विलोपन उत्पन्न करने के लिए एलएनसीएपी और पीसी 3-व्युत्पन्न मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों का उपयोग किया, एक्स गुणसूत्र पर मानचित्रण किया। यह पहचानना महत्वपूर्ण था कि इन पुरुष-व्युत्पन्न प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों में असामान्य कैरियोटाइप होते हैं और दो एक्स गुणसूत्र होते हैं (और पीसी 3 कोशिकाओं में अन्य ऑटोसोम पर आंशिक एक्स गुणसूत्र अनुवाद भी होते हैं)31,32। इन स्थितियों के बावजूद, सीआरआईएसपीआर जीन संपादन इन प्रोस्टेट सेल लाइनों का उपयोग करके समरूप नॉकआउट उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त मजबूत था। हालांकि, ऐसे मामले हो सकते हैं जब एक असामान्य कैरियोटाइप (जैसे, सम्मिलन, विलोपन, व्युत्क्रम, दोहराव) के साथ एक अन्वेषक की सेल लाइन "अदृश्य उत्परिवर्तन" को बंद कर सकती है जो लापता तत्वों के कारण लक्षित जीन लोकस की दूसरी (या अधिक) प्रतियों का पता लगाने को अस्पष्ट कर देगी जो डिज़ाइन किए गए पीसीआर प्राइमर / गाइड आरएनए का उपयोग करके सफल पता लगाने के लिए आवश्यक हैं। यह कार्यात्मक परख करने से पहले स्वतंत्र तरीकों (यानी, क्यूआरटी-पीसीआर, उत्तरी धब्बा, डब्ल्यूजीएस) का उपयोग करके समरूप शून्य सीआरआईएसपीआर सेल लाइनों को सत्यापित करने के महत्व को रेखांकित करता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल केवल एमआईआरएनए क्लस्टर संयोजनों को खटखटाने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो एक दूसरे से सटे हुए मानचित्र हैं। यदि कोई अन्वेषक एमआईआरएनए को खटखटाना चाहता है जो अन्य एमआईआरएनए जीनों के बीच अलग हो जाते हैं, तो सीआरआईएसपीआर अभिकर्मकों के कई दौर की आवश्यकता होगी, जिसके लिए सावधानीपूर्वक जीनोटाइपिंग और सत्यापन की आवश्यकता होगी।

इन चुनौतियों के बावजूद, इस वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किसी भी दिए गए एमआईआरएनए क्लस्टर के लिए एमआईआरएनए विलोपन संयोजनों का एक पूरा पैनल जल्दी से उत्पन्न करने की क्षमता एमआईआरएनए अनुसंधान टूलबॉक्स में मौजूदा तरीकों पर एक बड़ा फायदा है। नॉनकोडिंग आरएनए फ़ंक्शन को चिह्नित करने के लिए एमआईआरएनए मिमिक्स का उपयोग करके ओवरएक्सप्रेशन अध्ययन अनजाने में कलाकृतियों या सेल विषाक्तता को जन्म दे सकता है। इसी तरह, हानि-ऑफ-फंक्शन फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए एंटीसेंस एंटीमिर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इनहिबिटर का उपयोग मुश्किल हो सकता है क्योंकि एंटीमिर्स के परिणामस्वरूप आमतौर पर नॉकडाउन होता है और एमआईआरएनए गतिविधि का पूर्ण उन्मूलन नहीं होता है। एमआईआरएनए क्लस्टर नेटवर्क सिग्नलिंग को स्पष्ट करने के लिए एमआईआरएनए मिमिक्स या एमआईआरएनए एंटीमिर्स के संयोजन का उपयोग करने का प्रयास श्रमसाध्य और व्याख्या करना मुश्किल साबित हुआ है। इसलिए, सीआरआईएसपीआर जीन संपादन तकनीक का समावेश यह पूछताछ करने की दिशा में है कि एमआईआरएनए सदस्य किसी दिए गए नॉनकोडिंग जीनोमिक क्लस्टर के भीतर कैसे बातचीत करते हैं, शोधकर्ताओं को इस बात की स्पष्ट समझ हासिल करने में सक्षम बनाएगा कि नॉनकोडिंग आरएनए रोग सिग्नलिंग मार्गों को कैसे प्रभावित करते हैं और नैदानिक और दवा खोज क्षेत्रों में भारी प्रभाव डालने का वादा करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

पीसी 3-एमएल सेल लाइनों को मार्क स्टीयरन (ड्रेक्सल यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन) द्वारा प्रदान किया गया था। जस्टिन टोक्सी ने पीसीआर जीनोटाइपिंग में सहायता की। इस काम को ब्रीडन एडम्स फाउंडेशन ग्रांट, एक रयान ट्रांसलेशनल रिसर्च फंड और एई-के के लिए एक राष्ट्रमंडल स्वास्थ्य अनुसंधान बोर्ड अनुदान (सीएचआरबी -274-11-20) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

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References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

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जीव विज्ञान अंक 182 सीआरआईएसपीआर उत्प्रेरणीय कैस 9 माइक्रोआरएनए नॉकआउट एमआईआर -888 क्लस्टर
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