Summary
O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.
Abstract
Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.
Introduction
O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.
A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas4. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil5. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical6. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz 2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11, bem como vasos sanguíneos, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro9.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação animal e fixação renal
- Realize a fixação de perfusão seguindo os passos abaixo.
- Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (3%, 2,0 L/min) e administração intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartarato de butorfanol (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).
- Perfundir o animal com 20 mL de PBS (pH 7,4) e 30 mL de PFA a 4% em tampão fosfato (PB) através do ventrículo esquerdo do coração12.
- Realizar a fixação da imersão logo após a fixação da perfusão e amostragem renal9.
- Imergir o rim em PFA a 4% a 4 °C por mais 16 h e, em seguida, lavá-lo com PBS por 2 h (três vezes)9 (Figura 1).
CUIDADO: Formaldeído e paraformaldeído são irritantes tóxicos. Manuseie os reagentes em um exaustor com equipamento de proteção individual apropriado.
- Imergir o rim em PFA a 4% a 4 °C por mais 16 h e, em seguida, lavá-lo com PBS por 2 h (três vezes)9 (Figura 1).
2. Descoloração e deslipidação
- Preparar CUBIC-L para descoloração e deslipidação consistindo de 10% em peso de Triton X-100 e 10% em peso de N-butildietanolamina (ver Tabela de Materiais), seguindo relatórios publicados anteriormente 4,8,9.
- Realizar a descoloração e deslipidação por CUBIC-L seguindo os passos abaixo.
- Imergir o rim fixo em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-L (mistura 1:1 de água e CUBIC-L) em um tubo de fundo redondo de 14 mL (ver Tabela de Materiais) com agitação suave à temperatura ambiente por 6 h (Figura 2A). Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave a 37 °C por 5 dias.
- Atualize o CUBIC-L todos os dias durante este processo. Após o processo de descoloração e deslipidação, lavar o rim com PBS em temperatura ambiente por 2 h (três vezes)9 (Figura 1). Use uma colher dispensadora para o manuseio da amostra (Figura 2B).
3. Coloração imunofluorescente de montagem completa
- Prepare os amortecedores de coloração.
- Preparar o tampão de coloração para anticorpos primários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,5% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio9.
- Prepare o tampão de coloração para anticorpos secundários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,1% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio9.
- Realizar coloração com anticorpos primários.
- Imunocorar o rim deslipidado com anticorpos primários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias.
NOTA: A quantidade do tampão de coloração necessário para um rim é de 500-600 μL (Figura 2C). - Lavar o rim com Triton X-100 a 0,5% (v/v) em PBS (PBST) à temperatura ambiente por 1 dia9 (Figura 1).
- Imunocorar o rim deslipidado com anticorpos primários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias.
- Realizar coloração com anticorpos secundários.
- Imunocorar o rim com anticorpos secundários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias. Lavar o rim com PBST à temperatura ambiente por 1 dia9 (Figura 1).
- Após a fixação9, imergir o rim em formaldeído a 1% em PB (mistura 1:36 de formaldeído a 37% e PB) por 3 h, e lavá-lo com PBS à temperatura ambiente por 6 h (Figura 1).
4. Correspondência do índice de refração (IR)
- Prepare CUBIC-R+.
- Preparar CUBIC-R misturando 45 % em peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina e 30 % em peso de nicotinamida (ver Tabela de Materiais).
- Preparar CUBIC-R+ para correspondência de índice de refração (IR) adicionando 0,5 v% de N-butildietanolamina ao CUBIC-R seguindo os relatórios publicados anteriormente 4,8,9.
- Execute a correspondência do RI.
- Mergulhe o rim em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-R+ (mistura 1:1 de água e CUBIC-R+) em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 1 dia. Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-R+ em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 2 dias9 (Figura 1).
NOTA: Embora o rim flutue em 50% de CUBIC-R+ no início da correspondência do IR, ele afunda e se torna transparente no CUBIC-R+ no final do processo (Figura 2D).
- Mergulhe o rim em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-R+ (mistura 1:1 de água e CUBIC-R+) em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 1 dia. Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-R+ em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 2 dias9 (Figura 1).
5. Aquisição e reconstrução de imagens
- Imergir o rim compatível com IR em uma mistura de óleo de silício (IR = 1,555) e óleo mineral (IR = 1,467) (55:45) durante a aquisição da imagem (IR = 1,51)5 (Figura 3).
- Adquira imagens 3D de todo o rim com um microscópio fluorescente de9 folhas de luz personalizado (consulte Tabela de materiais). Colete todos os dados brutos da imagem em um formato TIFF de 16 bits. Visualize e capture as imagens renderizadas em 3D com o software de análise de imagem (Imaris, consulte Tabela de Materiais).
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Representative Results
Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)9. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)9,10 (Figura 4C). Além disso, a visualização dos nervos simpáticos em todo o baço13 foi realizada por meio desse protocolo (Figura 4D). Um exemplo de quantificação dos dados de imunofluorescência 3D é mostrado na Figura 5.
Além disso, a visualização dos ductos coletores [anticorpo anti-aquaporina 2 (AQP2)], do segmento S1 dos túbulos proximais [anticorpo anti-cotransportador de glicose 2 (SGLT2) e dos glomérulos (anticorpo antipodocina) em um rim inteiro9 foi bem-sucedida (Figura 6A). Utilizando essa imagem 3D dos glomérulos, a glomerulomegalia (anticorpo antipodocina) foi visualizada nos estágios iniciais da doença renal diabética, que foi suprimida pela administração de medicamentos11 (Figura 6B).
Figura 1: Limpeza tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa. A limpeza tecidual por CUBIC é um processo de duas etapas: deslipidação (CUBIC-L) e correspondência do índice de refração (IR) (CUBIC-R+). A coloração de montagem completa é realizada após o processo de deslipidação. Barra de escala = 10 mm. A imagem é reproduzida de Hasegawa et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens do processo de manuseio . (A) A amostra é imersa em 7 mL de 50% ou 100% de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mL. O tubo é mantido na horizontal com agitação suave durante o processo de deslipidação. (B) Uma colher de dosagem é usada para o manuseio de amostras. (C) A quantidade do tampão de coloração necessário para um rim é de 500-600 μL. O tubo é mantido vertical durante o processo de coloração. (D) Embora a amostra flutue em 50% de CUBIC-R+ no início da correspondência do IR, ela afunda e torna-se transparente no CUBIC-R+ no final do processo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microscopia fluorescente de folha de luz para imagens 3D de rim inteiro. A microscopia fluorescente de folha de luz (LSFM) permite imagens tridimensionais (3D) de amostras transparentes. Esta imagem é reproduzida de Hasegawa et al.9. O óleo de imersão é usado durante a aquisição de dados. Folhas de luz de ambos os lados iluminam a amostra. Os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical. O estágio se move na direção axial, e as imagens z-stack são obtidas. Barra de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagem tridimensional de rim inteiro de nervos e artérias simpáticas. (A) Os nervos simpáticos [anticorpo anti-tirosina hidroxilase (TH), verde] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso α (αSMA), magenta] são visualizados em um rim inteiro. (B) A imagem do plano x-y aumentado de (A) é mostrada [anticorpo anti-TH, verde; anticorpo anti-αSMA, magenta]. (C) A denervação persistente após lesão de isquemia-reperfusão renal (IRA) é visualizada. (D) Os nervos simpáticos em um baço também são visualizados em um baço inteiro pelo protocolo atual. Esta imagem é reproduzida de Hasegawa et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação da coloração imunofluorescente tridimensional. O processo de quantificação da razão entre o volume positivo para o volume renal total é mostrado. A conversão binária é realizada de acordo com cada limiar. Os volumes são obtidos calculando-se a integral da área de interesse (tamanho do voxel: x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). A imagem é reproduzida de Hasegawa et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem tridimensional de rim inteiro de ductos coletores, túbulos proximais e glomérulos. (A) Ductos coletores [anticorpo anti-aquaporina 2 (AQP2)], segmento S1 dos túbulos proximais [anticorpo anti-cotransportador de glicose 2 (SGLT2) e glomérulos (anticorpo anti-podocina) são visualizados respectivamente em um rim inteiro. A imagem é reproduzida de Hasegawa et al.9. (B) A glomerulomegalia é observada no estágio inicial da doença renal diabética (anticorpo antipodocina), que é suprimida pela administração de medicamentos. A imagem é reproduzida de Hasegawa et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Filme rotativo do rim. O filme rotativo do rim na Figura 4A é mostrado. Nervos simpáticos [anticorpo anti-tirosina hidroxilase (TH), verde] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso α (αSMA), magenta] são visualizados. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11.
A opacidade é derivada da não homogeneidade óptica em um tecido5. O princípio comum de vários métodos de limpeza de tecidos é a remoção de dispersores/absorvedores de luz e o preenchimento do espaço com reagentes compatíveis com RI. Comparado a métodos à base de solventes orgânicos, como imagens 3D de órgãos limpos por solvente (3DISCO/iDISCO)3,14, o CUBIC é baseado em reagentes hidrofílicos e, portanto, é superior em preservação fluorescente5. Essa característica do CUBIC permite que os pesquisadores observem sinais fluorescentes de cepas2 de camundongos repórteres, bem como sinais de coloração imunofluorescente de montagem completa, fornecendo mais opções para uma compreensão abrangente das estruturas de órgãos 3D.
O atual protocolo de clareamento tecidual baseado em CUBIC pode alcançar alta transparência para imagens 3D em comparação com pesquisas anteriores de limpeza renal em camundongos15. No entanto, deve-se notar que este protocolo de limpeza é adequado para rins de camundongos. Um processo de deslipidação mais forte é necessário para limpar os rins humanos. Por exemplo, Zhao et al. apresentaram recentemente uma abordagem para o mapeamento de órgãos humanos intactos, desenvolvendo o método eficiente de limpeza de tecidos denominado SHANEL (small micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Como a deslipidação mais forte danifica as amostras, os pesquisadores precisam escolher um método apropriado de limpeza de tecidos de acordo com sua finalidade.
A coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos; o presente protocolo foi estabelecido após tentativa e erro. À medida que a estabilidade da coloração é priorizada, o tempo de incubação pode ser maior do que o mínimo necessário. Como resultado, este protocolo demonstrou coloração de montagem completa de alta qualidade dos rins pelos anticorpos. No entanto, existe a possibilidade de que possa não funcionar bem, dependendo dos antígenos alvo que não tentamos. Um estudo recente mostrou que a coloração em duas etapas usando anticorpos primários e secundários, como o protocolo atual, não é ideal em alguns casos para a coloração de montagem completa de cérebros de camundongos17. Isso ocorre porque, quando a quantidade alvo é grande, seu anticorpo primário preenche a amostra, dificultando a penetração profunda do anticorpo secundário no tecido17. Assim, vale a pena tentar o anticorpo primário marcado com fluorescência, ou o complexo do anticorpo primário e do fragmento secundário de Fab17, se a penetração de anticorpos não for eficiente.
Quanto ao processo de imagem, os pesquisadores precisam escolher um tipo apropriado de microscopia e resolução de imagem de acordo com sua finalidade. Se os pesquisadores quiserem realizar imagens 3D de rim inteiro, como apresentado neste estudo, é melhor usar microscopia fluorescente de folha de luz, porque ela pode adquirir rapidamente imagens de pilha z amplas com um baixo nível de fotobranqueamento. Como o tamanho do arquivo de dados de imagem 3D é enorme, a resolução da imagem deve ser reduzida na medida em que a imagem de todo o órgão possa permanecer. Em contraste, os pesquisadores também podem usar microscopias confocais ou multifótons ao obter dados de imagem 3D com alta resolução em espaço estreito.
Em conclusão, o presente estudo desenvolveu coloração renal de montagem completa para imagens 3D com o método de limpeza de tecidos CUBIC. O protocolo permite a visualização de estruturas 3D em todo um rim, fornecendo uma perspectiva macroscópica para a pesquisa renal.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
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