Summary
Här används zebrafisk (Danio rerio) som modell för att studera allergiska reaktioner och immunsvar relaterade till alfa-Gal syndrom (AGS) genom att utvärdera allergiska reaktioner mot fästingsaliv och köttkonsumtion hos däggdjur.
Abstract
Fästingar är leddjursvektorer som orsakar sjukdom genom patogenöverföring och vars bett kan relateras till allergiska reaktioner som påverkar människors hälsa över hela världen. Hos vissa individer har höga nivåer av immunglobulin E-antikroppar mot glykanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) inducerats av fästingbett. Anafylaktiska reaktioner medierade av glykoproteiner och glykolipider innehållande glykanen α-Gal, närvarande i fästingsaliv, är relaterade till alfa-Gal syndrom (AGS) eller köttallergi hos däggdjur. Zebrafisk (Danio rerio) har blivit en allmänt använd ryggradsdjurmodell för studier av olika patologier. I denna studie användes zebrafisk som modell för studier av allergiska reaktioner som svar på α-Gal och däggdjursköttkonsumtion eftersom de, liksom människor, inte syntetiserar denna glykan. För detta ändamål utvärderades beteendemönster och hemorragiska anafylaktiska allergiska reaktioner som svar på Ixodes ricinus fästsaliv och köttkonsumtion hos däggdjur. Detta experimentella tillvägagångssätt möjliggör insamling av giltiga data som stöder zebrafiskdjurmodellen för studier av fästingburna allergier inklusive AGS.
Introduction
Fästingar är vektorer av patogener som orsakar sjukdomar och är också orsaken till allergiska reaktioner, som påverkar människors och djurs hälsa över hela världen 1,2. Under fästingmatning underlättar biomolekyler i fästsaliv, särskilt proteiner och lipider, utfodringen av dessa ektoparasiter och undviker värdförsvar3. Vissa salivbiomolekyler med glykan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifieringar leder till produktion av höga anti-α-Gal IgE-antikroppsnivåer efter fästingbett, endast hos vissa individer, vilket är känt som α-Gal syndrom (AGS)4. Detta är en sjukdom associerad med IgE-medierad allergi som kan leda till anafylaxi mot fästingbett, icke-primat däggdjursköttkonsumtion och vissa läkemedel som cetuximab5. Reaktioner på α-Gal är ofta allvarliga och kan ibland vara dödliga 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal finns i alla däggdjur utom Gamla världens apor, apor och människor som inte har förmågan att syntetisera α-Gal13. Patogener som bakterier och protozoer uttrycker emellertid denna glykan på deras yta, vilket kan inducera produktion av stora mängder anti-α-Gal IgM / IgG-antikroppar och kan vara en skyddsmekanism mot dessa patogener16,17. Produktionen av anti-α-Gal-antikroppar ökar dock risken för att utveckla IgE-medierade anti-α-Gal-allergier 7,13. Naturliga anti-α-Gal-antikroppar producerade hos människor, huvudsakligen av IgM / IgG-subtyperna, kan associeras med denna modifiering som finns i bakterier från tarmmikrobiota16. AGS kan vara en utmanande klinisk diagnos, eftersom den huvudsakliga diagnostiska metoden för närvarande är baserad på en klinisk historia av fördröjda allergiska reaktioner, särskilt förknippade med matallergier (dvs. klåda, lokaliserade nässelfeber eller återkommande angioödem mot anafylaxi, urtikaria och gastrointestinala symtom) och mätning av IgE-anti-α-Gal-antikroppsnivåer9. Aktuella fynd tyder på att fästingbett utgör en av de viktigaste riskerna vid uppkomsten av AGS 18,19, en 20-faldig eller större ökning av IgE-nivåerna till α-Gal efter en fästingbett 19, en historia av fästingbett hos patienter med AGS20,21,22, förekomsten av antikroppar reaktiva mot fästingantigener hos AGS-patienter 19, och att anti-α-Gal IgE är starkt relaterade till anti-tick IgE-nivåer19,23 men ytterligare studier behövs för att bedöma vilka biomolekyler som faktiskt är involverade.
Dessutom är ett annat möjligt scenario patienter som uppvisar starka allergiska reaktioner mot fästingbett och höga nivåer av anti-α-Gal IgE-antikroppar men är toleranta mot köttkonsumtionhos däggdjur 12. Därför kan köttallergi hos däggdjur vara en särskild typ av fästingbettrelaterad allergi. De viktigaste fästingarterna som förknippas med AGS är Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium och Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) och Ixodes ricinus (huvudvektorn för borrelia i Europa)11,24.
Den enda modellen som har använts för att utvärdera IgE-produktion relaterad till fästingbett är musmodellen genetiskt modifierad med genen för α-1,3-galaktosyltransferas utslagna (α-Gal KO) möss25,26 eftersom möss liksom andra däggdjur också uttrycker α-Gal på proteiner och lipider och inte producerar IgE till α-Gal. Zebrafisk (Danio rerio) är dock en användbar modell för biomedicinsk forskning som tillämpas på däggdjur eftersom den delar många anatomiska likheter med däggdjur och, som människor, inte heller kan syntetisera α-Gal. Eftersom α-Gal inte produceras naturligt i zebrafisk är det en prisvärd modell, lätt att manipulera och möjliggör en hög provstorlek för studier av α-Gal-relaterade allergiska reaktioner.
I denna studie används zebrafisk som modellorganism för att karakterisera och beskriva lokala allergiska reaktioner, beteendemönster och de molekylära mekanismer som är förknippade med svar på perkutan sensibilisering av fästingsaliv26,27 och efterföljande köttkonsumtion hos däggdjur. För detta ändamål exponeras fisk för fästingsaliv genom intradermal injektion och matas sedan med hundfoder, som innehåller köttprodukter från däggdjur som är lämpliga för djuranvändning och som innehåller α-Gal27, därefter utvärderas eventuella relaterade allergiska reaktioner. Denna metod kan tillämpas på studier av andra biomolekyler relaterade till allergiska processer, särskilt de som är relaterade till AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av etikkommittén för djurförsök vid universitetet i Castilla La Mancha under studien "Evaluation of the immune response to inactivated M. bovis vaccine and challenge with M. marinum in the zebrafish model number PR-2017-05-12."
Fästingar erhölls från laboratoriekolonin, där representativa prover av fästingar i kolonin testades med PCR för vanliga fästingpatogenerför att bekräfta frånvaron av patogener och upprätthölls vid Institute of Parasitology, Biology Center of the Czech Academy of Sciences (IP BC CAS), Tjeckien.Alla djurförsök utfördes i enlighet med Tjeckiens djurskyddslag nr 246/1992 Sb (etiskt godkännande nr 34/2018).
1. Behandling av zebrafisk
OBS: Studien är utformad för att utvärdera allergiska reaktioner och immunsvaret hos zebrafisk som behandlats med fästingsaliv som svar på köttkonsumtion hos däggdjur.
- Behandla fisken (enligt beskrivningen i avsnitt 4) med fästingsaliv, kommersiell Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (se materialförteckning), som används som positiv kontroll, med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som negativ kontroll. Vuxna zebrafiskar fördelas slumpmässigt i tre könsbalanserade grupper (figur 1).
OBS: Alla andra önskade föreningar relaterade till AGS kan utvärderas med hjälp av denna modell.
2. Ixodes ricinus fästing salivextraktion
- Använd halvengorged patogenfria kvinnliga fästingar som matas i 6-7 dagar på marsvin.
- Behandla fästingen med 5 μl av en 2% (vikt/volym) lösning av pilokarpinhydroklorid i PBS (se materialtabell) vid pH 7,4 i hemocoel med en 50 μl spruta med en 0,33 mm nål som tidigare beskrivits28 för att inducera produktion av fästingsaliv.
OBS: Fästingar hanteras med pincett; Var försiktig så att du inte applicerar för mycket styrka när du tar tag i dem. - Samla saliv med en 10 μL spets monterad på en mikropipett.
- För försiktigt in spetsen inuti fästinghypostomen.
- Förvara saliven i ett 1,5 ml rör på is, slå ihop det och förvara det vid -80 ° C som tidigare beskrivits27.
- Bestäm salivproteinkoncentrationen för att fastställa mängden protein som ska injiceras i fisken som i tidigare studier27 med hjälp av ett BCA Protein Assay Kit (se materialtabell) enligt tillverkarens rekommendationer.
3. Underhåll av zebrafisk
- Håll zebrafisken i ett genomströmningsvattensystem vid 27 °C med en ljus/mörk cykel på 14 timmar/10 timmar (figur 2).
- Mata fisken två gånger dagligen kl. 9.30 och 13.30 med torrt fiskfoder (50-70 μg/fisk) fram till dag 2.
- Mata fisken två gånger dagligen kl. 9.30 och 13.30 med torrt hundfoder (50-70 μg/fisk) från dag 2 efter behandlingsinjektionen till slutet av försöket
4. Zebrafisk injektion
- Välj 10 fiskar per grupp med ett liknande förhållande mellan honor / män och liknande vikt.
OBS: Grupp 1 innehåller fisk injicerad med PBS, grupp 2 innehåller fisk injicerad med fästingsaliv och grupp 3 innehåller fisk injicerad med α-Gal. - Bedöva fisken kort genom nedsänkning i 0,02% trikainmetansulfonat (MS-222) (Film 1).
OBS: Korrekt bedövade fiskar visar normal andning och ingen simning, medan de kan placeras längst ner i vattentanken eller flytande. Varje fisk måste bedövas individuellt för att undvika eventuella fysiologiska skador. - Fånga den bedövade fisken med ett fiskenät.
- Placera fisken på halvsidan med pincett eller händer försiktigt, på en våt svamp, med stjärtfenan på höger sida för att injicera föreningarna i samma riktning för att kontrollera skadorna.
- Injicera grupper av fisk intradermalt, som i tidigare studier26, i muskeln vid 5 mm mot stjärtfenan och i 45° vinkel i förhållande till fiskens kropp (film 2). Använd lämplig behandling dag 0, 3 och 8 enligt beskrivningen ovan 27 med en 100 μL spruta försedd med en 1 cm, 29 G nål med 1 μL (med 9 μg/μL protein) I. ricinus saliv i 10 μL PBS (tick saliv), 5 μg α-Gal i 10 μL PBS (α-Gal)27, och 10 μl PBS (figur 3).
OBS: Hanteringen måste ske snabbt och noggrant för att undvika fysisk skada på djuret.
Andra biomolekyler i fästingsaliv kan utvärderas enligt detta protokoll. - Lägg tillbaka den behandlade fisken i en sötvattentank utan bedövning för återhämtning.
OBS: Alla fiskar i samma grupp kan placeras i samma vattentank för återhämtning.
5. Zebrafisk utfodring
- Mosa hundmat med en murbruk och stöt.
- Mata 50-70 μg/fisk två gånger dagligen kl. 9.30 och 13.30 med torrt fiskfoder fram till dag 2.
- Mata 50-70 μg/fisk två gånger dagligen kl. 9.30 och 13.30 med mosat hundfoder från dag 2 efter behandlingsinjektionen till slutet av experimentet på dag 8.
OBS: Om immunitetsmarkörer eller antikroppstitrar mot α-Gal- eller IgE-antikroppar som svar på behandlingarna eller fodret under de olika inokuleringarna ska utvärderas, skulle utfodring vara nödvändig fram till experimentets slut.
6. Utvärdering av allergiska reaktioner, lesioner och beteende hos zebrafisk
- Undersök den hemorragiska typen av allergiska reaktioner (hudrodnad, missfärgning och blödning) med hjälp av förstoringsglas eller stereomikroskop för noggrannhet och ange platsen för deras utseende på fisken efter kategoriseringen i tabell 1 (figur 4A).
OBS: De allergiska reaktionerna som presenteras i figur 4 uppträdde efter injektion av fästsaliv och konsumtion av foder som innehåller rött kött. Därför är de beskrivna reaktionerna den typ av reaktioner som är associerade med AGS, eftersom liknande reaktioner uppträder i det kliniska sammanhanget.- Observera om någon reaktion uppträder efter behandlingar och vid administrering av mat två gånger om dagen medan fisken är i vattentanken.
- Undersök fiskens beteende genom att utvärdera förändringarna27 i simmönster (rörlighet, hastighet, stående orörlig längst ner i vattentanken och sicksacksimning) enligt kategoriseringen i tabell 1.
- Utvärdera ackumulerad dödlighet och rapportera antalet döda fiskar inklusive tid / dag för dödsfall (figur 4B).
OBS: Alla parametrar utvärderas direkt efter behandling eller efter foderbyte och följs dagligen fram till slutet av experimentet på dag 8 som kategoriserar kvalitativa variabler (tabell 1). Som en rekommendation bör denna utvärdering utföras av en professionell med kunskap om zebrafiskar för att överväga beteendeförändringar baserat på deras bakgrund och erfarenhet av att arbeta med denna djurmodell. - Beräkna antalet zebrafiskar per dag med rapporterade allergiska reaktioner, onormalt beteende och utfodringsförändringar i varje grupp och jämför mellan grupper med ett enkelriktat ANOVA-test.
7. Insamling av prover
- Avliva fisken genom nedsänkning i 0,04% MS-222 på dag 8.
OBS: Samla också proverna från fisken som dör av allergiska reaktioner under försöket. - Fäst fisken på en paraffinplatta med stift.
- Samla serum från gälblodkärlen 29 av fisken omedelbart efter eutanasi, när gälarna fortfarande bevattnas med blod, med en 0,5 ml spruta försedd med en 1 cm,29 G nål. Förvara den i ett 1,5 ml rör vid -20 °C tills den används (film 3).
- Skär fisken sagittalt med ett skalpellblad och utvärdera de inre skadorna (hemorragiska lesioner eller granulom)27,30 om de uppträder.
OBS: Lesioner visas inte nödvändigtvis men måste registreras om de gör det. - Samla tarmen (film 4) och njuren (film 5) från varje fisk i separata tomma 1,5 ml rör, som tidigare beskrivits31, och förvara dem vid -80 C (figur 4C).
- Extrahera totalt RNA från zebrafiskens tarm- och njurprover med hjälp av ett RNA-reningssats (se materialtabell).
- Analysera uttrycket av gener relaterade till immunsvar som tidigare beskrivits30,32 (se tabell 2 för primersekvenser) i zebrafisk, utföra en kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) med användning av en omvänd transkriptionsblandning för RT-qPCR (se materialtabell), enligt tillverkarens instruktioner. Normalisera mRNA cT-värdena mot D. rerio GAPADH och jämför mellan grupper (fisk behandlad med saliv, α-Gal och PBS-behandlade grupper) med hjälp av ett Student t-test med ojämn varians.
- Bestäm IgM-antikroppstitrar som känner igen α-Gal i zebrafisk i serumprover med ELISA som beskrivits tidigare 27,30. Registrera antikroppstitrarna som OD-450 nm-värden med hjälp av en plattläsare och jämför mellan grupper (fisk behandlad med saliv, α-Gal och PBS-behandlade grupper) med hjälp av ett Student t-test med ojämn varians.
OBS: Bestämning av IgM-antikroppstitrar och expressionsgenanalys är valfri och utförs endast om immunologisk information krävs. RT-qPCR-mix är ett förstasträngat cDNA-synteskit för genuttrycksanalys med qPCR i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som presenteras här är baserat på flera aspekter av tidigare publicerade experiment 27,30 och resultat utförda i vårt laboratorium där zebrafiskmodellen är etablerad och validerad för studier av AGS och immunsvaret mot α-Gal eftersom både människor och zebrafisk inte syntetiserar denna molekyl13. Denna modell möjliggör karakterisering och utvärdering av en mängd olika allergiska reaktioner som ett resultat av värdsvaret på fästingsaliv (figur 4) och deras implikation i AGS. Dessutom observeras förändringar i beteende som långsam simning (film 6), liggande på botten av tanken (film 7) och inte äta, vibrera eller sicksacka rörelse (film 8) i fisken som svar på fästsalivbehandling som inte observeras i kontrollfisken; Dessa fynd är särskilt signifikanta efter administrering av hundmat på dag 2. Vid denna tidpunkt var fisken redan sensibiliserad med alfa-gal och fästingsaliv, och administreringen av rött kött genom foderet började. Slutligen observeras en signifikant förekomst av allergiska reaktioner hos fisk som behandlats med fästingsaliv (figur 4A, B och tabell 3), endast zebrafisk som hade utsatts för fästingsaliv utvecklade allergiska reaktioner, vilket visar snabb desensibilisering och tolerans. Å andra sidan, i tidigare studier, zebrafisk matad med fiskmat utvecklade ingen synlig skada eller reaktion27. Beteendeförändringen var mer uttalad hos fisken som behandlades med fästingsaliv än med bara α-Gal (figur 5). Ytterligare analys av uttrycket av de mest representativa immunsvarsmakarna (IFN, TLR 2, IL1 β och AKR2) utfördes med RT-PCR (tabell 3) för att studera olika immunsvar mot behandlingarna. Resultaten visade skillnader mellan zebrafiskgrupperna i njuren, där de flesta immunsvarsmarkörerna tycktes vara nedreglerade hos fisk som behandlades med saliv och α-Gal jämfört med kontrollgruppen (figur 6), men inga signifikanta skillnader hittades i genuttryck i tarmen. Tidigare studier om allergiska reaktioner mot olika fästingsalivkomponenter i zebrafisk visade liknande resultat27. Dessutom, som representativa resultat, utvecklade zebrafisk behandlad med fästingsaliv och α-Gal med detta protokoll IgM-antikroppar mot α-Gal som visade högre nivåer än hos fisk behandlad med PBS (figur 7), vilket hittades i tidigare studier27,30.
Figur 1: Experimentell design för zebrafiskförsök. Fisk injiceras intradermalt med α-Gal, fästingsaliv och PBS som en negativ kontroll. Prover samlas in efter att en fisk dör eller i slutet av experimentet. Prover kan användas för analys av anti-α-Gal IgM-nivåer och uttryck av utvalda immunsvarsgenmarkörer med qRT-PCR27. Beteendeförändringar eller allergiska reaktioner registreras under hela experimentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Zebrafisk experimentanläggning. Zebrafisken hålls i ett genomströmningsvattensystem vid 27 °C med en ljus/mörk cykel på 14 timmar/10 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Injektion av zebrafiskbehandling. Zebrafiskbehandlingsinjektion med en 100 μL spruta försedd med en 1 cm, 29 G nål utförs intrakutant på ett avstånd av 5 mm från stjärtfenan. Fisken bedövas och behandlas en efter en över en svamp doppad i varmt vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tecken på hemorragiska reaktioner av anafylaktisk typ hos zebrafiskar injicerade med fästingsaliv och som dog på dag 2 före utfodringsförändring. (A) Fisk med allergiska reaktioner i tanken efter behandling. (B) Fisk död av hemorragiska anafylaktiska reaktioner (allergisk reaktionstyp: missfärgning och hudrodnad. (C) Insamling av prover. Röda pilar indikerar tarmarna och röda cirklar indikerar njurarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Beteendemönster observerat hos fisk. Onormala beteendemönster bestod av långsam simning, stående stillastående längst ner i vattentanken och sicksacksimning. Blå pilar anger behandlingstiden och den röda pilen indikerar tiden att byta från fiskfoder till hundfoder. Fisk som utfodrats med hundmat jämfördes mellan salivbehandlad och PBS-behandlad kontrollfisk med ett enkelriktat ANOVA-test (p = 0,05; N = 5 fiskar/grupp). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Uttryck av utvalda immunsvarsmarkörer i zebrafisknjurar. Genuttrycksanalys med qRT-PCR i njuren hos zebrafiskar i slutet av experimentet. MRNA cT-värdena normaliseras mot D. rerio GAPDH, presenteras som medelvärde ± SD och jämförs mellan fisk behandlad med saliv, α-Gal, och den PBS-behandlade kontrollgruppen med ett Student t-test med ojämn varians (*p < 0,05; N = 3-7). Denna siffra har antagits från27 och reproducerats med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: IgM-antikroppstitrar. IgM-antikroppstitrarna hos zebrafiskar mot α-Gal bestäms av ELISA, representerad som medelvärdet ± SD O.D. vid 450 nm och jämförs mellan fisk behandlad med saliv, α -Gal, och den PBS-behandlade kontrollgruppen med ett Student t-test med ojämn varians (*p < 0,005; N = 3-7). Denna siffra har antagits från27 och reproducerats med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Lesioner och beteendemönster utvärderade. Kategorisering av kvalitativa variabler. De parametrar som utvärderas kvalitativt är skador (på fenor och skalor), simning, utfodring och om fiskens död orsakas av testet eller genom hantering. Som ett subjektivt övervägande kategoriseras varje variabel från mycket mild till svår Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Oligonukleotidprimrar och glödgningstemperaturer för qRT-PCR. Denna tabell har antagits från30 och återgivits med tillstånd. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Representativa resultat. Register över zebrafiskallergier och dödsfall och uttryck av utvalda immunsvarsmarkörer analyseras med qRT-PCR i njure och tarm hos zebrafiskar. MRNA cT-värdena normaliseras mot D. rerio GAPDH och jämförs mellan fisk behandlad med saliv, α -Gal, och den PBS-behandlade kontrollgruppen med ett Student t-test med ojämn varians (*p < 0,05; N = 3-7). Denna tabell har antagits från27,30 och återgivits med tillstånd. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Film 1: Sövd fisk. Den bedövade fisken visar inte rörelse eller simmar utan fortsätter andas. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Injektion av behandlingen i fisken. Fisken placeras sövd på en våt svamp och injiceras i 45° vinkel mot kroppen med den angivna behandlingen. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Serumuppsamling från gälblodkärlen. Fisken fixeras på en paraffinplatta med stift och serum samlas upp från gälarna med en 0,5 ml spruta försedd med en 1 cm, 29 G nål. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 4: Tarminsamling från en avlivad fisk. Fisken skärs sagittalt med ett skalpellblad och tarmarna samlas med pincett. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 5: Njursamling från en avlivad fisk. Simblåsan avlägsnas och njurarna samlas in. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 6: Representativa beteendeaspekter observerade hos behandlade zebrafiskar. En fisk visade långsam simning. Alla fiskar från samma grupp är i samma tank, Videon är ett exempel för att illustrera detta beteende, och flera fiskar kan ha detta beteende vid olika tidpunkter på dagen. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 7: Representativa beteendeaspekter observerade hos behandlade zebrafiskar. En fisk stannade längst ner i tanken. Alla fiskar från samma grupp är i samma tank, Videorna är ett exempel för att illustrera detta beteende, och flera fiskar kan ha detta beteende vid olika tidpunkter på dagen. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 8: Representativa beteendeaspekter observerade hos behandlade zebrafiskar. En fisk visade vibrerande simning. Alla fiskar från samma grupp är i samma tank, Videorna är ett exempel för att illustrera detta beteende, och flera fiskar kan ha detta beteende vid olika tidpunkter på dagen. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk är en kostnadseffektiv och lätthanterlig modell som också har varit ett mycket genomförbart verktyg för studier av molekylära mekanismer för immunsvaret, patogena sjukdomar, nya läkemedelstester och vaccination och skydd mot infektioner33,34,35. Studien om zebrafiskens beteende är användbar eftersom tidigare studier har visat att vissa fiskarter förblir rörliga i botten av tanken när de är stressade, vilket påverkar deras matkonsumtion och äter mindre; Dessutom kan sicksackning när de rör sig också associeras med fiskstress och ångest36,37. Informationen som genereras från studier genom att utvärdera dessa parametrar i zebrafisk kommer att ge en grundläggande förståelse för tick-host molekylära interaktioner och mekanismer som är involverade i värdens immunsvar mot α-Gal som kan leda till utveckling av AGS, inklusive allergi mot köttkonsumtion hos däggdjur.
För att undvika falska positiva reaktioner på den injicerade molekylen är det viktigt att utföra en intradermal injektion inte mycket djupt, parallellt med zebrafiskkroppen och att utvärdera om fisken är skadad vid injektionstillfället. En fisk med skada till följd av hantering eller nålpenetration bör inte ingå i analysen. Dessutom rekommenderas det starkt att en professionell med kunskap om zebrafisk utvärderar förändringar i beteende som simning och utfodring för att överväga beteendeförändringar baserat på deras bakgrund och erfarenhet av att arbeta med denna modell38. En annan viktig faktor är anestesi; En adekvat dos är viktig för det optimala tillståndet hos de insamlade proverna. Dessutom undviks ett mer uttalat stressrespons under injektionsbehandlingen, vilket kan kompensera för eventuella svårigheter relaterade till stressdiagnos29.
Resultaten visade att zebrafiskmodellen också kunde öka möjligheterna att utvärdera riskerna med att utveckla AGS efter ett fästingbett och andra allergiska reaktioner. Vidare kan mål för diagnos, behandlingar och förebyggande av dessa allergier tillämpas på människor, eftersom denna metod och parametrarna som utvärderas möjliggör mer exakt karakterisering av allergiska reaktioner hos zebrafisk.
Denna metod kan göra det möjligt att utvärdera andra salivbiogena molekyler, som är ansvariga för allergiska reaktioner och närvarande i fästsaliv. α-Gal-halten i fästingsaliv har tidigare kvantifierats27, men det är inte känt vilka andra föreningar som kan vara involverade i utvecklingen av AGS. Allergiska reaktioner observerades i grupper som behandlades med fästingsaliv och α-Gal men inte i PBS-grupper (tabell 3), men beteendet påverkas mer i den fästingsalivbehandlade gruppen än i α-Gal-gruppen (figur 5). Från dessa data skulle vår hypotes vara att andra biomolekyler i kombination med alfa-Gal är involverade i AGS, så ytterligare experiment bör studera vilka andra molekyler som finns i saliv som påverkar dessa resultat. Dessutom var anti-alfa-gal-antikroppstitrar signifikant högre hos zebrafiskar behandlade med fästingsaliv och alfa-gal, vilket, liksom i tidigare studier26,29, visade ett immunsvar mot alfa-gal närvarande i fästingsaliv (figur 7).
Slutligen verkade immunsvarsmarkörer nedreglerade i zebrafiskgrupper behandlade med fästingsaliv och alfagal jämfört med PBS-behandlade grupper (tabell 3 och figur 6). Dessa resultat överensstämmer med de som erhållits i andra studier där andra AGS-relaterade biomolekyler testades27, men i motsats till tidigare studier25 där α-Gal KO-möss som svar på fästingbett och konsumtion av rött kött visade ett IgE-svar och ett uppreglerat uttryck av inflammatorisk Toll-liknande receptor (TLR) och IL-1-signalvägar, vilket resulterade i aktivering av Akr2. Därför behövs ytterligare studier för att förstå aktiveringsvägarna för dessa svar på fästingsaliv och andra biomolekyler i zebrafisk som kan uppnås genom tillämpning av denna metod.
Sedan kan denna metod möjliggöra screening för biomolekyler som ensamma eller i kombination utlöser allergiska reaktioner och som kan påverka värdens immunsvar som leder till allergiska sjukdomar som AGS och andra fästingburna allergier27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i SaBio-gruppen för deras samarbete i den experimentella designen och det tekniska biståndet med fiskförsöksanläggningen och Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spanien) för att tillhandahålla zebrafiskar. Detta arbete stöddes av Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spanien och EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras finansieras av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien, bidrag IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
