Summary
Burada, zebra balığı (Danio rerio), tükürük ve memeli eti tüketimine karşı alerjik reaksiyonları değerlendirerek alfa-Gal sendromu (AGS) ile ilgili alerjik reaksiyonları ve bağışıklık tepkilerini incelemek için bir model olarak kullanılır.
Abstract
Keneler, patojen bulaşarak hastalığa neden olan ve ısırıkları dünya çapında insan sağlığını etkileyen alerjik reaksiyonlarla ilişkili olabilecek eklembacaklı vektörlerdir. Bazı bireylerde, glikan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R'ye (α-Gal) karşı yüksek seviyelerde immünoglobulin E antikorları kene ısırıkları ile indüklenmiştir. Kene tükürüğünde bulunan glikan α-Gal'i içeren glikoproteinler ve glikolipidlerin aracılık ettiği anafilaktik reaksiyonlar, alfa-Gal sendromu (AGS) veya memeli eti alerjisi ile ilişkilidir. Zebra balığı (Danio rerio), farklı patolojilerin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir omurgalı modeli haline gelmiştir. Bu çalışmada, zebra balığı, α-Gal ve memeli eti tüketimine yanıt olarak alerjik reaksiyonların incelenmesi için bir model olarak kullanılmıştır, çünkü insanlar gibi bu glikanı sentezlemezler. Bu amaçla, Ixodes ricinus kene tükürüğü ve memeli eti tüketimine yanıt olarak davranış kalıpları ve hemorajik anafilaktik tip alerjik reaksiyonlar değerlendirildi. Bu deneysel yaklaşım, AGS de dahil olmak üzere kene kaynaklı alerjilerin incelenmesi için zebra balığı hayvan modelini destekleyen geçerli verilerin gizlenmesini sağlar.
Introduction
Keneler, hastalıklara neden olan patojenlerin vektörleridir ve aynı zamanda dünya çapında insanların ve hayvanların sağlığını etkileyen alerjik reaksiyonların nedenidir 1,2. Kene beslemesi sırasında, kene tükürüğündeki biyomoleküller, özellikle proteinler ve lipitler, konakçı savunmalarından kaçınarak bu ektoparazitlerin beslenmesini kolaylaştırır3. Glikan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifikasyonlarına sahip bazı tükürük biyomolekülleri, kene ısırmasından sonra, sadece bazı bireylerde α-Gal Sendromu (AGS)4 olarak bilinen yüksek anti-α-Gal IgE antikor seviyelerinin üretilmesine yol açar. Bu, kene ısırıkları, primat olmayan memeli eti tüketimi ve cetuximab5 gibi bazı ilaçlar için anafilaksi ile sonuçlanabilecek IgE aracılı alerji ile ilişkili bir hastalıktır. α-Gal'e karşı reaksiyonlar genellikle şiddetlidir ve bazen ölümcül olabilir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal, Eski Dünya maymunları, maymunlar ve α-Gal13'ü sentezleme yeteneğine sahip olmayan insanlar dışındaki tüm memelilerde bulunur. Bununla birlikte, bakteri ve protozoa gibi patojenler, bu glikanı yüzeylerinde eksprese eder, bu da yüksek miktarda anti-α-Gal IgM / IgG antikorlarının üretimini indükleyebilir ve bu patojenlere karşı koruyucu bir mekanizma olabilir16,17. Bununla birlikte, anti-α-Gal antikorlarının üretimi, IgE aracılı anti-α-Gal alerjileri gelişme riskini arttırır 7,13. İnsanlarda, özellikle IgM / IgG alt tiplerinde üretilen doğal anti-α-Gal antikorları, bağırsak mikrobiyotası16'dan bakterilerde bulunan bu modifikasyonla ilişkilendirilebilir. AGS zorlu bir klinik tanı olabilir, çünkü şu anda ana tanı yöntemi, özellikle gıda alerjileri (yani, kaşıntı, lokalize kurdeşen veya anafilaksi, ürtiker ve gastrointestinal semptomlara tekrarlayan anjiyoödem) ile ilişkili gecikmiş alerjik reaksiyonların klinik öyküsüne ve IgE anti-α-Gal antikor seviyelerinin ölçümüne dayanmaktadır9. Mevcut bulgular, kene ısırıklarının AGS 18,19'un ortaya çıkmasında başlıca risklerden birini oluşturduğunu, kene ısırığı 19'u takiben IgE düzeylerinde α-Gal'e 20 kat veya daha fazla bir artış, AGS20,21,22'li hastalarda kene ısırığı öyküsü, AGS hastalarında kene antijenlerine reaktif antikorların varlığı 19, ve anti-α-Gal IgE'nin kene karşıtı IgE seviyeleri19,23 ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu, ancak hangi biyomoleküllerin gerçekte dahil olduğunu değerlendirmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu belirtti.
Ek olarak, bir başka olası senaryo, kene ısırıklarına karşı güçlü alerjik reaksiyonlar ve yüksek düzeyde anti-α-Gal IgE antikorları sunan, ancak memeli eti tüketimine toleranslı olan hastalardır12. Bu nedenle, memeli eti alerjisi, kene ısırığı ile ilgili alerjinin belirli bir türü olabilir. AGS ile ilişkili başlıca kene türleri arasında Amblyomma americanum (ABD), Amblyomma sculptum (Brezilya), Amblyomma testudinarium ve Haemaphysalis longicornis (Japonya), Ixodes holocyclus (Avustralya) ve Ixodes ricinus (Avrupa'daki Lyme borreliosis'in ana vektörü)11,24 bulunur.
Kene ısırıkları ile ilgili IgE üretimini değerlendirmek için kullanılan tek model, α-1,3-galaktosiltransferaz nakavt edilmiş (α-Gal KO) fareler25,26 için gen ile genetik olarak değiştirilmiş fare modelidir, çünkü diğer memeliler gibi, fareler de proteinler ve lipitler üzerinde α-Gal eksprese eder ve α-Gal'e IgE üretmez. Bununla birlikte, zebra balığı (Danio rerio), memelilere uygulanan biyomedikal araştırmalar için yararlı bir modeldir, çünkü memelilerle birçok anatomik benzerliği paylaşır ve insanlar gibi α-Gal'i sentezleyemez. α-Gal, zebra balıklarında doğal olarak üretilmediğinden, uygun fiyatlı bir modeldir, manipüle edilmesi kolaydır ve α-Gal ile ilişkili alerjik reaksiyonların incelenmesi için yüksek bir örneklem büyüklüğüne izin verir.
Bu çalışmada, zebra balığı, lokal alerjik reaksiyonları, davranış kalıplarını ve tükürük26,27 kene ve müteakip memeli eti tüketimine karşı perkütan sensitizasyona yanıt ile ilişkili moleküler mekanizmaları karakterize etmek ve tanımlamak için model bir organizma olarak kullanılmıştır. Bu amaçla, balıklar intradermal enjeksiyon ile kene tükürüğüne maruz bırakılır ve daha sonra α-Gal27 içeren hayvan kullanımına uygun memeli eti türevi ürünler içeren köpek yemi ile beslenir, daha sonra olası ilişkili alerjik reaksiyonlar değerlendirilir. Bu yöntem, alerjik süreçlerle ilgili diğer biyomoleküllerin, özellikle AGS ile ilgili olanların incelenmesine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Castilla La Mancha Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından "İnaktive edilmiş M. bovis aşısına karşı bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi ve zebra balığı model numarası PR-2017-05-12'de M. marinum ile meydan okuma" çalışması kapsamında onaylanmıştır.
Keneler, kolonideki kenelerin temsili örneklerinin ortak kene patojenleri için PCR tarafından test edildiği laboratuvar kolonisinden elde edildiPatojenlerin yokluğunu doğrulamak için Çek Cumhuriyeti Bilimler Akademisi Biyoloji Merkezi (IP BC CAS), Çek Cumhuriyeti.Tüm hayvan deneyleri, Çek Cumhuriyeti Hayvan Koruma Kanunu No. 246/1992 Sb (etik onay No. 34/2018) uyarınca gerçekleştirildi.
1. Zebra balığı tedavisi
NOT: Çalışma, memeli eti tüketimine yanıt olarak kene tükürüğü ile tedavi edilen zebra balıklarında alerjik reaksiyonları ve bağışıklık tepkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır.
- Balıklara (bölüm 4'te açıklandığı gibi) kene tükürüğü, ticari Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (bakınız Malzeme Tablosu), pozitif bir kontrol olarak kullanılırken, fosfat tamponlu salin (PBS) negatif bir kontrol olarak muamele edin. Yetişkin zebra balığı rastgele cinsiyet dengeli üç gruba ayrılır (Şekil 1).
NOT: AGS ile ilgili istenen diğer bileşikler bu model kullanılarak değerlendirilebilir.
2. Ixodes ricinus kene tükürüğü ekstraksiyonu
- Gine domuzlarında 6-7 gün boyunca beslenen yarı engorge patojen içermeyen dişi keneler kullanın.
- Keneyi PBS'de% 2'lik bir pilokarpin hidroklorür çözeltisinin 5 μL'si ile (wt / vol) pH 7.4'te ( Malzeme Tablosuna bakınız) hemokole, kene tükürük üretimini indüklemek için daha önce tarif edildiği gibi0.33 mm'lik bir iğne ile 50 μL'lik bir şırınga kullanarak hemokole uygulayın.
NOT: Keneler forseps kullanılarak işlenir; Onları kavrarken çok fazla güç uygulamamaya dikkat edin. - Bir mikropipet üzerine monte edilmiş 10 μL'lik bir uç kullanarak tükürük toplayın.
- Ucu kene hipostomunun içine dikkatlice yerleştirin.
- Tükürüğü buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpte tutun, havuzda biriktirin ve daha önce tarif edildiği gibi -80 ° C'de saklayın27.
- Tükürük protein konsantrasyonunu belirlemek, önceki çalışmalarda olduğu gibi balığa enjekte edilecek protein miktarını belirlemek için27 üreticinin tavsiyelerini takiben bir BCA Protein Tahlil Kiti (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak.
3. Zebra balıklarının bakımı
- Zebra balığını, 14 saat/10 saatlik aydınlık/karanlık döngü ile 27 °C'de akan bir su sisteminde tutun (Şekil 2).
- Balıkları günde iki kez sabah 9:30 ve 13:30'da kuru balık yemi (50-70 μg / balık) ile 2. güne kadar besleyin.
- Balıkları günde iki kez sabah 9:30 ve 13:30'da tedavi enjeksiyonundan sonraki 2. günden deneyin sonuna kadar kuru köpek yemi (50-70 μg / balık) ile besleyin
4. Zebra balığı enjeksiyonu
- Grup başına benzer dişi/erkek oranına ve benzer ağırlığa sahip 10 balık seçin.
NOT: Grup 1, PBS enjekte edilen balıkları, grup 2'de kene tükürüğü enjekte edilen balıkları ve grup 3'te α-Gal enjekte edilen balıkları içerir. - Balıkları% 0.02 trikain metansülfonat (MS-222) içine daldırarak kısaca uyuşturun (Film 1).
NOT: Düzgün anestezi uygulanan balıklar normal solunum gösterir ve yüzmezken, su tankının dibine yerleştirilebilir veya yüzebilir. Olası fizyolojik hasarı önlemek için her balık ayrı ayrı uyuşturulmalıdır. - Bir balık ağı kullanarak anestezi altındaki balıkları yakalayın.
- Balıkları, lezyonları kontrol etmek için bileşikleri aynı yönde enjekte etmek için sağ taraftaki kaudal yüzgeci ile forseps veya elleri dikkatlice kullanarak yarım tarafına yerleştirin.
- Balık gruplarını, önceki çalışmalarda olduğu gibi intradermal olarak enjekte edin26, kaslara kaudal yüzgecine 5 mm'de ve balığın vücuduna göre 45 ° 'lik bir açıyla enjekte edin (Film 2). 1 cm, 1 μL PBS (α α-Gal)27'de 1 μL (9 μg / μL protein ile) I. ricinus tükürüğü ile donatılmış 1 cm, 29 G iğne ile donatılmış 100 μL şırınga ile 27 dahaönce tarif edildiği gibi 0, 3 ve 8. günlerde uygun tedaviyi kullanın, ve 10 μL PBS (Şekil 3).
NOT: Hayvana herhangi bir fiziksel zarar gelmesini önlemek için elleçleme hızlı ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
Kene tükürüğündeki diğer biyomoleküller bu protokolü takiben değerlendirilebilir. - Tedavi edilen balıkları, iyileşme için anestezi olmadan bir tatlı su tankına geri yerleştirin.
NOT: Aynı gruptaki tüm balıklar geri kazanım için aynı su tankına yerleştirilebilir.
5. Zebra balığı besleme
- Köpek mamasını bir harç ve havaneyle ezin.
- 2. güne kadar günde iki kez 09:30 ve 13:30'da kuru balık yemi ile 50-70 μg / balık besleyin.
- Günde iki kez sabah 9:30 ve 13:30'da 50-70 μg / balık, tedavi enjeksiyonundan sonraki 2. günden 8. günde deneyin sonuna kadar püresi köpek yemi ile besleyin.
NOT: Tedavilere yanıt olarak α-Gal veya IgE antikoruna karşı bağışıklık belirteçleri veya antikor titreleri veya farklı aşılamalar boyunca yem değerlendirilecekse, deneyin sonuna kadar besleme gerekli olacaktır.
6. Zebra balıklarında alerjik reaksiyonların, lezyonların ve davranışların değerlendirilmesi
- Hemorajik tip alerjik reaksiyonları (cilt kızarıklığı, renk değişikliği ve kanama) doğruluk için bir büyüteç veya stereomikroskop kullanarak inceleyin ve Tablo 1'de yer alan kategorizasyonu takiben balıklardaki görünümlerinin yerini belirtin (Şekil 4A).
NOT: Şekil 4'te sunulan alerjik reaksiyonlar, kene tükürüğü enjeksiyonundan ve kırmızı et içeren yemlerin tüketiminden sonra ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, tarif edilen reaksiyonlar, klinik bağlamda benzer reaksiyonlar ortaya çıktığı için AGS ile ilişkili reaksiyonların türüdür.- Tedavilerden sonra ve balıklar su tankındayken günde iki kez yiyecek uygularken herhangi bir reaksiyon olup olmadığını gözlemleyin.
- Tablo 1'de yer alan kategorizasyonu takiben yüzme düzenindeki27 değişikliği (hareketlilik, hız, su tankının dibinde hareketsiz durma ve zikzak yüzme) değerlendirerek balık davranışını inceleyin.
- Birikmiş ölüm oranını değerlendirin, ölüm zamanı / günü de dahil olmak üzere ölü balık sayısını bildirin (Şekil 4B).
NOT: Tüm parametreler tedaviden hemen sonra veya yem değişikliğinden sonra değerlendirilir ve nitel değişkenleri kategorize ederek 8. günde deneyin sonuna kadar günlük olarak takip edilir (Tablo 1). Bir öneri olarak, bu değerlendirme, zebra balığı hakkında bilgi sahibi bir profesyonel tarafından, bu hayvan modeliyle çalışma geçmişlerine ve deneyimlerine dayanarak davranış değişikliklerini göz önünde bulundurmak için yapılmalıdır. - Her grupta bildirilen alerjik reaksiyonlar, anormal davranışlar ve beslenme değişiklikleri ile günlük zebra balığı sayısını hesaplayın ve gruplar arasında tek yönlü bir ANOVA testi ile karşılaştırın.
7. Örnek toplama
- Balıkları 8. günde% 0.04 MS-222'ye batırarak ötenazi yapın.
NOT: Ayrıca deneme sırasında alerjik reaksiyonlardan ölen balıklardan örnekler toplayın. - Balıkları pimli bir parafin tabağa sabitleyin.
- Ötanaziden hemen sonra, solungaçlar hala kanla sulandığında, 1 cm, 29 G iğne ile donatılmış 0.5 mL'lik bir şırınga kullanarak, balığın solungaç kan damarlarından29 serum toplayın. Kullanıma kadar -20 ° C'de 1,5 mL'lik bir tüpte saklayın (Film 3).
- Balıkları bir neşter bıçağı ile sagittal olarak kesin ve ortaya çıkarsa iç lezyonları (hemorajik lezyonlar veya granülomlar)27,30 değerlendirin.
NOT: Lezyonlar mutlaka ortaya çıkmaz, ancak ortaya çıkarlarsa kaydedilmelidir. - Her bir balıktan bağırsak (Film 4) ve böbreği (Film 5), daha önce tarif edildiği gibi ayrı boş 1.5 mL tüplerde toplayın31 ve bunları -80 ° C'de saklayın (Şekil 4C).
- Bir RNA saflaştırma kiti kullanarak zebra balığı bağırsağından ve böbrek örneklerinden toplam RNA'yı çıkarın (bkz.
- Zebra balığında daha önce tarif edildiği gibi bağışıklık tepkisi ile ilgili genlerin ekspresyonunu analiz edin30,32 (primer dizileri için Tablo 2'ye bakınız), üreticinin talimatlarına göre RT-qPCR için ters transkripsiyon karışımı kullanarak kantitatif bir ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) gerçekleştirin (bkz. mRNA cT değerlerini D. rerio GAPDH'ye karşı normalleştirin ve eşit olmayan varyansa sahip bir Student t-testi kullanarak gruplar arasında (tükürük ile tedavi edilen balıklar, α-Gal ve PBS ile tedavi edilen gruplar) karşılaştırın.
- Daha önce tarif edildiği gibi ELISA ile serum örneklerinde zebra balıklarında α-Gal'i tanıyan IgM antikor titrelerini ELISA ile belirleyin27,30. Bir plaka okuyucu kullanarak antikor titrelerini O.D.450 nm değerleri olarak kaydedin ve eşit olmayan varyanslı bir Student t-testi kullanarak gruplar arasında (tükürük ile muamele edilmiş balıklar, α-Gal ve PBS ile tedavi edilen gruplar) karşılaştırın.
NOT: IgM antikor titrelerinin belirlenmesi ve ekspresyon gen analizi isteğe bağlıdır ve sadece immünolojik bilgi gerektiğinde yapılır. RT-qPCR karışımı, gerçek zamanlı qPCR kullanarak gen ekspresyon analizi için birinci basamaklı bir cDNA sentez kitidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol, daha önce yayınlanmış deneylerin çeşitli yönlerine dayanmaktadır27,30 ve zebra balığı modelinin AGS çalışması ve α-Gal'e karşı bağışıklık tepkisi için kurulduğu ve doğrulandığı laboratuvarımızda gerçekleştirilen sonuçlar, çünkü hem insanlar hem de zebra balığı bu molekülü sentezlememektedir13. Bu model, kene tükürüğüne karşı konakçı yanıtının bir sonucu olarak çeşitli alerjik reaksiyonların karakterizasyonuna ve değerlendirilmesine izin verir (Şekil 4) ve bunların AGS'deki etkileri. Ek olarak, kontrol balıklarında gözlenmeyen kene tükürüğü tedavisine yanıt olarak yavaş yüzme (Film 6), tankın dibinde yatma (Film 7) ve yememe, titreşme veya zikzak hareketi (Film 8) gibi davranış değişiklikleri balıklarda gözlenir; Bu bulgular, 2. günde köpek maması uygulanmasının ardından özellikle önemlidir. Bu noktada, balıklar zaten alfa-gal ve kene tükürüğü ile hassaslaştırıldı ve yem yoluyla kırmızı et uygulanması başladı. Son olarak, kene tükürüğü ile tedavi edilen balıklarda (Şekil 4A, B ve Tablo 3) önemli bir alerjik reaksiyon insidansı gözlenmiştir, sadece kene tükürüğüne maruz kalan zebra balığı, hızlı duyarsızlaşma ve tolerans gösteren alerjik reaksiyonlar geliştirmiştir. Öte yandan, önceki çalışmalarda, balık yemi ile beslenen zebra balığı, gözle görülür bir lezyon veya reaksiyon geliştirmemiştir27. Davranış değişikliği, kene tükürüğü ile tedavi edilen balıklarda sadece α-Gal'den daha belirgindi (Şekil 5). En temsili immün yanıt üreticilerinin (IFN, TLR 2, IL1 β ve AKR2) ekspresyonunun ek analizi, tedavilere farklı bağışıklık yanıtlarını incelemek için RT-PCR (Tablo 3) ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, böbrekteki zebra balığı grupları arasında, en fazla bağışıklık yanıtı belirteçlerinin, kontrol grubuna kıyasla tükürük ve α-Gal ile tedavi edilen balıklarda aşağı regüle edildiği görülen farklılıklar göstermiştir (Şekil 6), ancak bağırsaktaki gen ekspresyonunda anlamlı bir fark bulunmamıştır. Zebra balığında farklı kene tükürük bileşenlerine karşı alerjik reaksiyonlarla ilgili önceki çalışmalar benzer sonuçlar göstermiştir27. Ek olarak, temsili sonuçlar olarak, bu protokolü kullanarak kene tükürüğü ve α-Gal ile tedavi edilen zebra balığı, PBS ile tedavi edilen balıklardan daha yüksek seviyeler gösteren α-Gal'e karşı IgM antikorları geliştirmiştir (Şekil 7), önceki çalışmalarda27,30 bulunmuştur.
Şekil 1: Zebra balığı denemesi için deneysel tasarım. Balıklara negatif bir kontrol olarak intradermal olarak α-Gal, kene tükürüğü ve PBS enjekte edilir. Örnekler, bir balık öldükten sonra veya deneyin sonunda toplanır. Örnekler, anti-α-Gal IgM seviyelerinin analizi ve qRT-PCR27 ile seçilen immün yanıt gen belirteçlerinin ekspresyonu için kullanılabilir. Davranış değişiklikleri veya alerjik reaksiyonlar deney boyunca kaydedilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Zebra balığı deney tesisi. Zebra balığı, 14 saat / 10 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile 27 ° C'de bir akış su sisteminde tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zebra balığı tedavisi enjeksiyonu. 1 cm, 29 G iğne ile donatılmış 100 μL şırınga ile zebra balığı tedavi enjeksiyonu, kaudal yüzgecinden 5 mm mesafede intradermal olarak gerçekleştirilir. Balıklar uyuşturulur ve ılık suya batırılmış bir sünger üzerinde tek tek tedavi edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kene tükürüğü enjekte edilen ve beslenme değişikliğinden önce 2. günde ölen zebra balıklarında anafilaktik tip hemorajik reaksiyonların kanıtı. (A) Tedaviden sonra tankta alerjik reaksiyonları olan balıklar. (B) Hemorajik anafilaktik reaksiyonlardan ölen balıklar (alerjik reaksiyon tipi: renk değişikliği ve cilt kızarıklığı. (C) Numune toplama. Kırmızı oklar bağırsağı, kırmızı daireler ise böbreği gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Balıklarda gözlenen davranış örüntüsü. Anormal davranış kalıpları yavaş yüzme, su tankının dibinde sabit durma ve zikzak yüzmeden oluşuyordu. Mavi oklar tedavi zamanını, kırmızı ok ise balık yeminden köpek yemine geçme zamanını gösterir. Köpek maması ile beslenen balıklar tükürük ile tedavi edilen ve PBS ile tedavi edilen kontrol balıkları arasında tek yönlü ANOVA testi ile karşılaştırıldı (p = 0.05; N = 5 balık/grup). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Zebra balığı böbreğinde seçilmiş immün yanıt belirteçlerinin ekspresyonu. Deney sonunda zebra balıklarının böbreğinde qRT-PCR ile gen ekspresyon analizi. mRNA cT değerleri D. rerio GAPDH'ye karşı normalleştirilir, ortalama ± SD olarak sunulur ve tükürük ile tedavi edilen balıklar, α-Gal ve PBS ile tedavi edilen kontrol grubu arasında eşit olmayan varyanslı bir Student t-testi ile karşılaştırılır (*p < 0.05; N = 3-7). Bu rakam27'den itibaren kabul edilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: IgM antikor titreleri. Zebra balıklarının α-Gal'e karşı IgM antikor titreleri, 450 nm'de ortalama ± SD O.D. olarak temsil edilen ELISA tarafından belirlenir ve tükürük ile muamele edilen balıklar, α -Gal ve PBS ile tedavi edilen kontrol grubu arasında eşit olmayan varyansa sahip bir Student t-testi ile karşılaştırılır (*p < 0.005; N = 3-7). Bu rakam27'den itibaren kabul edilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Lezyonlar ve davranış kalıpları değerlendirildi. Nitel değişkenlerin sınıflandırılması. Kalitatif olarak değerlendirilen parametreler yaralanmalar (yüzgeçler ve ölçeklerde), yüzme, beslenme ve balığın ölümünün testten mi yoksa kullanımdan mı kaynaklandığıdır. Öznel bir değerlendirme olarak, her değişken çok hafiften şiddetliye kadar kategorize edilir Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: qRT-PCR için oligonükleotid primerler ve tavlama sıcaklıkları. Bu tablo30 maddeden itibaren kabul edilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Temsili sonuçlar. Zebra balığı alerjileri ve ölümlerinin kayıtları ve seçilen bağışıklık yanıt belirteçlerinin ekspresyonu, zebra balıklarının böbrek ve bağırsağında qRT-PCR ile analiz edilir. mRNA cT değerleri D. rerio GAPDH'ye karşı normalleştirilir ve tükürük ile muamele edilen balıklar, α -Gal ve PBS ile tedavi edilen kontrol grubu arasında eşit olmayan varyanslı bir Student t-testi ile karşılaştırılır (*p < 0.05; N = 3-7). Bu tablo 27,30'dan itibaren kabul edilmiş ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 1: Anestezi uygulanmış balık. Uyuşturulan balık hareket göstermez veya yüzmez, nefes almaya devam eder. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 2: Balıklarda tedavinin enjeksiyonu. Balıklar ıslak bir sünger üzerine uyuşturulur ve belirtilen tedavi ile vücutlarına 45° açıyla enjekte edilir. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 3: Solungaç kan damarlarından serum toplanması. Balık, pimli bir parafin plakaya sabitlenir ve serum, 1 cm, 29 G iğne ile donatılmış 0,5 mL'lik bir şırınga kullanılarak solungaçlardan toplanır. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 4: Ötanazi yapılmış bir balıktan bağırsak toplanması. Balıklar bir neşter bıçağı kullanılarak sagittal olarak kesilir ve bağırsak cımbızla toplanır. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 5: Ötanazi yapılmış bir balıktan böbrek toplanması. Yüzme kesesi çıkarılır ve böbrek toplanır. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 6: Tedavi edilen zebra balıklarında gözlenen temsili davranış yönleri. Bir balık yavaş yüzmeyi gösterdi. Aynı gruptaki tüm balıklar aynı tanktadır, Video bu davranışı göstermek için bir örnektir ve birkaç balık günün farklı saatlerinde bu davranışa sahip olabilir. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 7: Tedavi edilen zebra balıklarında gözlenen temsili davranış yönleri. Bir balık tankın dibinde kaldı. Aynı gruptaki tüm balıklar aynı tanktadır, Videolar bu davranışı göstermek için bir örnektir ve birkaç balık günün farklı saatlerinde bu davranışa sahip olabilir. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 8: Tedavi edilen zebra balıklarında gözlenen temsili davranış yönleri. Bir balık titreşen yüzme gösterdi. Aynı gruptaki tüm balıklar aynı tanktadır, Videolar bu davranışı göstermek için bir örnektir ve birkaç balık günün farklı saatlerinde bu davranışa sahip olabilir. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı, bağışıklık tepkisinin moleküler mekanizmaları, patojen hastalıkları, yeni ilaç testleri ve enfeksiyonlara karşı aşılama ve korunma çalışmaları için çok uygun bir araç olan uygun maliyetli ve kullanımı kolay bir modeldir33,34,35. Zebra balıklarının davranışları üzerine yapılan çalışma yararlıdır, çünkü önceki çalışmalar bazı balık türlerinin stresli olduklarında tankın dibinde hareketsiz kaldığını, bu da yiyecek tüketimini etkilediğini, daha az yediğini; Ek olarak, hareket ettiklerinde zikzak çizmek balık stresi ve kaygısı ile de ilişkili olabilir36,37. Zebra balığında bu parametrelerin değerlendirilmesi ile yapılan çalışmalardan elde edilen bilgiler, memeli eti tüketimine alerji de dahil olmak üzere AGS'nin gelişmesine yol açabilecek α-Gal'e karşı konakçı bağışıklık tepkisinde yer alan kene-konakçı moleküler etkileşimlerinin ve mekanizmalarının temel bir anlayışını sağlayacaktır.
Enjekte edilen moleküle yanlış pozitif reaksiyonları önlemek için, zebra balığı gövdesine paralel olarak çok derin olmayan bir intradermal enjeksiyon yapmak ve balığın enjeksiyon sırasında zarar görüp görmediğini değerlendirmek önemlidir. Elleçleme veya iğne penetrasyonundan kaynaklanan yaralanması olan bir balık analize dahil edilmemelidir. Ek olarak, zebra balığı bilgisine sahip bir profesyonelin, bu modelle çalışma geçmişine ve deneyimine dayanarak davranış değişikliklerini göz önünde bulundurmak için yüzme ve beslenme gibi davranış değişikliklerini değerlendirmesi şiddetle tavsiye edilir38. Bir diğer önemli husus ise anestezidir; Toplanan örneklerin optimal durumu için yeterli doz önemlidir. Ek olarak, enjeksiyon tedavisi sırasında, stres teşhisi ile ilgili olası zorlukları telafi edebilecek daha belirgin bir stres tepkisinden kaçınılır29.
Sonuçlar, zebra balığı modelinin, kene ısırığı ve diğer alerjik reaksiyonlardan sonra AGS gelişme risklerini değerlendirme olanaklarını da geliştirebileceğini gösterdi. Ayrıca, bu alerjilerin teşhisi, tedavileri ve önlenmesi için hedefler insanlara uygulanabilir, çünkü bu yöntem ve değerlendirilen parametreler zebra balıklarında alerjik reaksiyonların daha doğru karakterizasyonuna izin verir.
Bu yöntem, alerjik reaksiyonlardan sorumlu olan ve kene tükürüğünde bulunan diğer tükürük biyojenik moleküllerinin değerlendirilmesine izin verebilir. Kene tükürüğündeki α-Gal içeriği daha önce27 olarak ölçülmüştür, ancak AGS'nin gelişiminde başka hangi bileşiklerin rol oynayabileceği bilinmemektedir. Kene tükürüğü ve α-Gal ile tedavi edilen gruplarda alerjik reaksiyonlar gözlendi, ancak PBS gruplarında gözlenmedi (Tablo 3), ancak kene tükürüğü ile tedavi edilen grupta davranış α-Gal grubuna göre daha fazla etkilendi (Şekil 5). Bu verilerden hipotezimiz, alfa-Gal ile kombinasyon halindeki diğer biyomoleküllerin AGS'ye dahil olduğudur, bu nedenle daha ileri deneyler, tükürükte bulunan diğer moleküllerin bu bulgular üzerinde bir etkiye sahip olduğunu incelemelidir. Ek olarak, kene tükürüğü ve alfa-gal ile tedavi edilen zebra balıklarında anti-alfa-gal antikor titreleri anlamlı derecede yüksekti, bu da önceki çalışmalardaolduğu gibi 26,29, kene tükürüğünde bulunan alfa-gal'e karşı bir bağışıklık tepkisi gösterdi (Şekil 7).
Son olarak, kene tükürüğü ve alfa gal ile tedavi edilen zebra balığı gruplarında PBS ile tedavi edilen gruba kıyasla immün yanıt belirteçleri aşağı regüle edilmiştir (Tablo 3 ve Şekil 6). Bu sonuçlar, diğer AGS ile ilişkili biyomoleküllerin test edildiği diğer çalışmalarda elde edilenlerle tutarlıdır27, ancak kene ısırıklarına ve kırmızı et tüketimine yanıt olarak α-Gal KO farelerinin bir IgE yanıtı ve enflamatuar Toll benzeri reseptör (TLR) ve IL-1 sinyal yollarının yukarı düzenlenmiş bir ekspresyonunu gösterdiği önceki çalışmalara25 karşıttır. Bu nedenle, zebra balıklarında kene tükürüğü ve diğer biyomoleküllere verilen bu yanıtların aktivasyon yollarını anlamak için bu metodolojinin uygulanmasıyla elde edilebilecek daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Daha sonra, bu metodoloji, tek başına veya kombinasyon halinde alerjik reaksiyonları tetikleyen ve AGS ve diğer kene kaynaklı alerjiler gibi alerjik hastalıklara yol açan konakçı bağışıklık tepkisini etkileyebilecek biyomoleküllerin taranmasına izin verebilir27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
SaBio grubu üyelerine, balık deney tesisi ile deneysel tasarımdaki işbirlikleri ve teknik yardımları için ve Juan Galcerán Sáez'e (IN-CSIC-UMH, İspanya) zebra balığı sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, İspanya ve AB-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00) tarafından desteklenmiştir. Marinela Contreras, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, İspanya tarafından IJC2020-042710-I hibesi ile finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
