Summary
هنا ، يتم استخدام الزرد (Danio rerio) كنموذج لدراسة ردود الفعل التحسسية والاستجابات المناعية المتعلقة بمتلازمة ألفا غال (AGS) من خلال تقييم ردود الفعل التحسسية لعاب القراد واستهلاك لحوم الثدييات.
Abstract
القراد هي ناقلات مفصلية تسبب المرض عن طريق انتقال مسببات الأمراض ويمكن أن تكون لدغاتها مرتبطة بردود الفعل التحسسية التي تؤثر على صحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. في بعض الأفراد ، تم تحفيز مستويات عالية من الأجسام المضادة للغلوبولين المناعي E ضد الجليكان Galα1-3Galβ1- (3) 4GlcNAc-R (α-Gal) عن طريق لدغات القراد. ترتبط تفاعلات الحساسية التي تتوسطها البروتينات السكرية والجليكوليبيدات التي تحتوي على الجليكان α-Gal ، الموجود في لعاب القراد ، بمتلازمة ألفا غال (AGS) أو حساسية لحوم الثدييات. أصبح الزرد (Danio rerio) نموذجا للفقاريات يستخدم على نطاق واسع لدراسة الأمراض المختلفة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الزرد كنموذج لدراسة ردود الفعل التحسسية استجابة لاستهلاك لحوم α غال والثدييات لأنهم ، مثل البشر ، لا يصنعون هذا الجليكان. لهذا الغرض ، تم تقييم الأنماط السلوكية وردود الفعل التحسسية النزفية من نوع الحساسية استجابة لعاب القراد Ixodes ricinus واستهلاك لحوم الثدييات. يسمح هذا النهج التجريبي بالحصول على بيانات صحيحة تدعم النموذج الحيواني لسمك الزرد لدراسة الحساسية المنقولة بالقراد بما في ذلك AGS.
Introduction
القراد هي ناقلات مسببات الأمراض التي تسبب الأمراض وهي أيضا سبب الحساسية ، مما يؤثر على صحة البشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم 1,2. أثناء تغذية القراد ، تسهل الجزيئات الحيوية في لعاب القراد ، وخاصة البروتينات والدهون ، تغذية هذه الطفيليات الخارجية ، وتجنب دفاعات المضيف3. تؤدي بعض جزيئات اللعاب الحيوية مع تعديلات الجليكان Galα1-3Galβ1- (3) 4GlcNAc-R (α-Gal) إلى إنتاج مستويات عالية من الأجسام المضادة المضادة ل α-Gal IgE بعد لدغة القراد ، فقط في بعض الأفراد ، وهو ما يعرف باسم متلازمة α غال (AGS) 4. هذا مرض مرتبط بالحساسية بوساطة IgE والتي قد تؤدي إلى الحساسية المفرطة لدغات القراد ، واستهلاك لحوم الثدييات غير الرئيسيات ، وبعض الأدوية مثل سيتوكسيماب5. غالبا ما تكون ردود الفعل تجاه α-Gal شديدة وأحيانا قد تكون قاتلة6،7،8،9،10،11،12،13،14،15.
تم العثور على α-Gal في جميع الثدييات باستثناء العالم القديم والقردة والبشر الذين ليس لديهم القدرة على تصنيعα-Gal 13. ومع ذلك ، فإن مسببات الأمراض مثل البكتيريا والبروتوزوا تعبر عن هذا الجليكان على سطحها ، والذي يمكن أن يحفز إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة المضادة ل α-Gal IgM / IgG وقد تكون آلية وقائية ضد مسببات الأمراضهذه 16,17. ومع ذلك ، فإن إنتاج الأجسام المضادة المضادة ل α-Gal يزيد من خطر الإصابة بالحساسية المضادة ل α-Gal بوساطةIgE 7,13. يمكن أن ترتبط الأجسام المضادة الطبيعية المضادة ل α-Gal المنتجة في البشر ، وخاصة الأنواع الفرعية IgM / IgG ، بهذا التعديل الموجود في البكتيريا من ميكروبيوتا الأمعاء16. يمكن أن يكون AGS تشخيصا سريريا صعبا ، حيث تعتمد طريقة التشخيص الرئيسية في الوقت الحالي على التاريخ السريري لردود الفعل التحسسية المتأخرة ، خاصة المرتبطة بالحساسية الغذائية (أي الحكة أو خلايا النحل الموضعية أو الوذمة الوعائية المتكررة للتأق والشرى وأعراض الجهاز الهضمي) وقياس مستويات الأجسام المضادة IgE المضادة ل α-Gal9. تشير النتائج الحالية إلى أن لدغات القراد تشكل أحد المخاطر الرئيسية في ظهور AGS 18,19 ، وزيادة بمقدار 20 ضعفا أو أكثر في مستويات IgE إلى α-Gal بعد لدغة القراد 19 ، وتاريخ لدغات القراد في المرضى الذين يعانون من AGS20،21،22 ، ووجود الأجسام المضادة التفاعلية لمستضدات القراد في مرضى AGS 19 ، وأن Anti-α-Gal IgE ترتبط ارتباطا وثيقا بمستويات IgE المضادة للقراد19,23 ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم الجزيئات الحيوية المشاركة بالفعل.
بالإضافة إلى ذلك ، هناك سيناريو محتمل آخر هو المرضى الذين يعانون من ردود فعل تحسسية قوية لدغات القراد ومستويات عالية من الأجسام المضادة المضادة ل α-Gal IgE ولكنهم يتحملون استهلاك لحوم الثدييات12. لذلك ، يمكن أن تكون حساسية لحوم الثدييات نوعا معينا من الحساسية المرتبطة لدغة القراد. تشمل أنواع القراد الرئيسية المرتبطة ب AGS Amblyomma americanum (الولايات المتحدة الأمريكية) ، Amblyomma sculptum (البرازيل) ، Amblyomma testudinarium و Haemaphysalis longicornis (اليابان) ، Ixodes holocyclus (أستراليا) ، و Ixodes ricinus (الناقل الرئيسي لمرض لايم في أوروبا)11,24.
النموذج الوحيد الذي تم استخدامه لتقييم إنتاج IgE المرتبط بلدغات القراد هو نموذج الفأر المعدل وراثيا مع جين الفئران α−1،3-galactosyltransferase (α-Gal KO)25,26 لأنه مثل الثدييات الأخرى ، تعبر الفئران أيضا عن α-Gal على البروتينات والدهون ولا تنتج IgE إلى α-Gal. ومع ذلك ، فإن الزرد (Danio rerio) هو نموذج مفيد للبحوث الطبية الحيوية المطبقة على الثدييات لأنه يشترك في العديد من أوجه التشابه التشريحية مع الثدييات ، ومثل البشر ، فهو غير قادر أيضا على تصنيع α-Gal. نظرا لأن α-Gal لا يتم إنتاجه بشكل طبيعي في الزرد ، فهو نموذج ميسور التكلفة وسهل التلاعب به ويسمح بحجم عينة كبير لدراسة تفاعلات الحساسية المرتبطة ب α-Gal.
في هذه الدراسة ، يستخدم الزرد ككائن نموذجي لتوصيف ووصف ردود الفعل التحسسية المحلية ، والأنماط السلوكية ، والآليات الجزيئية المرتبطة بالاستجابة للتحسس عن طريق الجلد لقراد اللعاب26،27 واستهلاك لحوم الثدييات اللاحقة. لهذا الغرض ، تتعرض الأسماك لعاب القراد عن طريق الحقن داخل الأدمة ثم يتم تغذيتها بعلف الكلاب ، الذي يحتوي على منتجات مشتقة من لحوم الثدييات مناسبة للاستخدام الحيواني والتي تحتوي علىα-Gal 27 ، ثم يتم تقييم ردود الفعل التحسسية المحتملة ذات الصلة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة الجزيئات الحيوية الأخرى المتعلقة بعمليات الحساسية ، وخاصة تلك المتعلقة ب AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية بالتجارب على الحيوانات بجامعة كاستيلا لا مانشا في إطار دراسة "تقييم الاستجابة المناعية للقاح M. bovis المعطل والتحدي مع M. marinum في رقم طراز الزرد PR-2017-05-12."
تم الحصول على القراد من مستعمرة المختبر ، حيث تم اختبار عينات تمثيلية من القراد في المستعمرة بواسطة PCR لمسببات الأمراض الشائعة للقرادلتأكيد عدم وجود مسببات الأمراض ، والحفاظ عليها في معهد علم الطفيليات ، مركز البيولوجيا التابع للأكاديمية التشيكية للعلوم (IP BC CAS) ، جمهورية التشيك ، تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لقانون حماية الحيوان في جمهورية التشيك رقم 246/1992 Sb (موافقة الأخلاقيات رقم 34/2018).
1. علاج الزرد
ملاحظة: تم تصميم التجربة لتقييم ردود الفعل التحسسية والاستجابة المناعية في الزرد المعالج بلعاب القراد استجابة لاستهلاك لحوم الثدييات.
- عالج الأسماك (كما هو موضح في القسم 4) بلعاب القراد ، Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) التجاري (انظر جدول المواد) ، المستخدم كعنصر تحكم إيجابي ، مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كعنصر تحكم سلبي. يتم توزيع أسماك الزرد البالغة عشوائيا إلى ثلاث مجموعات متوازنة بين الجنسين (الشكل 1).
ملاحظة: يمكن تقييم أي مركب آخر مرغوب فيه مرتبط ب AGS باستخدام هذا النموذج.
2. Ixodes ricinus القراد استخراج اللعاب
- استخدم القراد الأنثوي شبه المحتقن الخالي من مسببات الأمراض الذي يتغذى لمدة 6-7 أيام على خنازير غينيا.
- عالج القراد ب 5 ميكرولتر من محلول 2٪ (بالوزن / الحجم) من بيلوكاربين هيدروكلوريد في PBS (انظر جدول المواد) عند درجة الحموضة 7.4 في الهيموكول باستخدام حقنة 50 ميكرولتر بإبرة 0.33 مم كما تم وصفه سابقا28 للحث على إنتاج لعاب القراد.
ملاحظة: يتم التعامل مع القراد باستخدام ملقط. كن حذرا لعدم استخدام الكثير من القوة عند الإمساك بها. - اجمع اللعاب باستخدام طرف سعة 10 ميكرولتر مثبت على ماصة دقيقة.
- أدخل الطرف داخل hypostome القراد بعناية.
- احتفظ باللعاب في أنبوب سعة 1.5 مل على الثلج ، وقم بتجميعه وتخزينه في -80 درجة مئوية كما هو موضح سابقا27.
- تحديد تركيز بروتين اللعاب ، لتحديد كمية البروتين المراد حقنها في الأسماك كما في الدراسات السابقة27 باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (انظر جدول المواد) باتباع توصيات الشركة المصنعة.
3. صيانة الزرد
- الحفاظ على الزرد في نظام المياه المتدفقة عند 27 درجة مئوية مع دورة الضوء / الظلام من 14 ساعة / 10 ساعات (الشكل 2).
- قم بإطعام الأسماك مرتين يوميا في الساعة 9:30 صباحا و 1:30 مساء بأعلاف الأسماك الجافة (50-70 ميكروغرام / سمكة) حتى اليوم 2.
- إطعام الأسماك مرتين يوميا في الساعة 9:30 صباحا و 1:30 مساء بأعلاف الكلاب الجافة (50-70 ميكروغرام / سمكة) من اليوم 2 بعد حقن العلاج حتى نهاية التجربة
4. حقن الزرد
- اختر 10 أسماك لكل مجموعة مع نسبة مماثلة من الإناث / الذكور ووزن مماثل.
ملاحظة: تحتوي المجموعة 1 على أسماك محقونة ب PBS ، وتحتوي المجموعة 2 على أسماك محقونة بلعاب القراد ، وتحتوي المجموعة 3 على أسماك محقونة ب α غال. - تخدير الأسماك لفترة وجيزة عن طريق الغمر في 0.02٪ تريكايين ميثان سلفونات (MS-222) (الفيلم 1).
ملاحظة: تظهر الأسماك المخدرة بشكل صحيح التنفس الطبيعي وعدم السباحة ، بينما يمكن وضعها في قاع خزان المياه أو الطفو. يجب تخدير كل سمكة بشكل فردي لتجنب الأضرار الفسيولوجية المحتملة. - التقط الأسماك المخدرة باستخدام شبكة صيد.
- ضع السمكة على نصف جانبها باستخدام ملقط أو أيدي بعناية ، على إسفنجة مبللة ، مع الزعنفة الذيلية على الجانب الأيمن لحقن المركبات في نفس الاتجاه من أجل السيطرة على الآفات.
- حقن مجموعات من الأسماك داخل الأدمة ، كما في الدراسات السابقة26 ، في العضلات عند 5 مم إلى الزعنفة الذيلية وبزاوية 45 درجة بالنسبة لجسم السمكة (الفيلم 2). استخدم العلاج المناسب في الأيام 0 و 3 و 8 كما هو موضح سابقا 27 مع حقنة 100 ميكرولتر مزودة بإبرة 1 سم ، 29 جم مع 1 ميكرولتر (مع 9 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين) من لعاب I. ricinus في 10 ميكرولتر من PBS (لعاب القراد) ، 5 ميكروغرام من α جالون في 10 ميكرولتر PBS (α-Gal)27 ، و 10 ميكرولتر من PBS (الشكل 3).
ملاحظة: يجب أن يتم التعامل بسرعة وبعناية لتجنب أي ضرر مادي للحيوان.
يمكن تقييم الجزيئات الحيوية الأخرى في لعاب القراد باتباع هذا البروتوكول. - ضع الأسماك المعالجة مرة أخرى في خزان المياه العذبة دون تخدير للتعافي.
ملاحظة: يمكن وضع جميع الأسماك من نفس المجموعة في نفس خزان المياه للتعافي.
5. تغذية الزرد
- يهرس طعام الكلاب بمدافع الهاون والمدقة.
- قم بإطعام 50-70 ميكروغرام / سمك مرتين يوميا في الساعة 9:30 صباحا و 1:30 مساء مع تغذية الأسماك الجافة حتى اليوم 2.
- قم بإطعام 50-70 ميكروغرام / سمكة مرتين يوميا في الساعة 9:30 صباحا و 1:30 مساء بتغذية الكلاب المهروسة من اليوم الثاني بعد حقن العلاج حتى نهاية التجربة في اليوم 8.
ملاحظة: إذا تم تقييم علامات المناعة أو عيار الأجسام المضادة للأجسام المضادة α-Gal أو IgE استجابة للعلاجات أو التغذية في جميع أنحاء التطعيمات المختلفة ، فستكون التغذية ضرورية حتى نهاية التجربة.
6. تقييم الحساسية والآفات والسلوك في الزرد
- فحص النوع النزفي من ردود الفعل التحسسية (احمرار الجلد وتغير اللون والنزيف) باستخدام المكبر أو المجهر المجسم للتأكد من دقته والإشارة إلى موقع ظهوره على الأسماك بعد التصنيف المدرج في الجدول 1 (الشكل 4 أ).
ملاحظة: ظهرت ردود الفعل التحسسية المعروضة في الشكل 4 بعد حقن لعاب القراد واستهلاك الأعلاف التي تحتوي على اللحوم الحمراء. لذلك ، فإن ردود الفعل الموصوفة هي نوع التفاعلات المرتبطة ب AGS ، حيث تظهر تفاعلات مماثلة في السياق السريري.- لاحظ ما إذا كان أي رد فعل يظهر بعد العلاج وأثناء إعطاء الطعام مرتين في اليوم أثناء وجود الأسماك في خزان المياه.
- فحص سلوك الأسماك من خلال تقييم التغيرات27 في أنماط السباحة (الحركة ، السرعة ، الوقوف بلا حراك في قاع خزان المياه ، والسباحة المتعرجة) باتباع التصنيف المدرج في الجدول 1.
- تقييم الوفيات المتراكمة ، والإبلاغ عن عدد الأسماك النافقة بما في ذلك وقت / يوم الوفاة (الشكل 4 ب).
ملاحظة: يتم تقييم جميع المعلمات مباشرة بعد العلاج أو بعد تغيير التغذية ومتابعتها يوميا حتى نهاية التجربة في اليوم 8 لتصنيف المتغيرات النوعية (الجدول 1). كتوصية ، يجب إجراء هذا التقييم من قبل محترف لديه معرفة بأسماك الزرد للنظر في التغييرات السلوكية بناء على خلفيتهم وخبرتهم في العمل مع هذا النموذج الحيواني. - احسب عدد أسماك الزرد يوميا مع ردود الفعل التحسسية المبلغ عنها والسلوك غير الطبيعي وتغيرات التغذية في كل مجموعة وقارن بين المجموعات عن طريق اختبار ANOVA أحادي الاتجاه.
7. جمع العينات
- القتل الرحيم للأسماك عن طريق الغمر في 0.04٪ MS-222 في اليوم 8.
ملاحظة: اجمع أيضا عينات من الأسماك التي تموت من الحساسية أثناء التجربة. - إصلاح الأسماك على طبق البارافين مع دبابيس.
- جمع المصل من الأوعية الدموية الخيشومية 29 من الأسماك مباشرة بعد القتل الرحيم ، عندما لا تزال الخياشيم مروية بالدم ، باستخدام حقنة 0.5 مل مزودة بإبرة 1 سم ،29 جرام. قم بتخزينه في أنبوب سعة 1.5 مل عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام (الفيلم 3).
- قطع الأسماك سهميا بشفرة مشرط وتقييم الآفات الداخلية (الآفات النزفية أو الأورام الحبيبية)27,30 إذا ظهرت.
ملاحظة: لا تظهر الآفات بالضرورة ولكن يجب تسجيلها إذا ظهرت. - اجمع الأمعاء (الفيلم 4) والكلى (الفيلم 5) من كل سمكة في أنابيب فارغة منفصلة سعة 1.5 مل ، كما هو موضح سابقا31 ، وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية (الشكل 4C).
- استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات أمعاء الزرد والكلى باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
- تحليل التعبير عن الجينات المتعلقة بالاستجابة المناعية كما هو موضح سابقا30,32 (انظر الجدول 2 لتسلسل التمهيدي) في الزرد ، وإجراء تفاعل تسلسلي كمي للنسخ العكسي والبوليميراز (RT-qPCR) باستخدام مزيج النسخ العكسي ل RT-qPCR (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تطبيع قيم mRNA cT مقابل D. rerio GAPDH ، وقارن بين المجموعات (الأسماك المعالجة باللعاب ، α-Gal ، والمجموعات المعالجة ب PBS) باستخدام اختبار t للطالب مع تباين غير متساو.
- تحديد عيار الأجسام المضادة IgM التي تتعرف على α-Gal في الزرد في عينات المصل بواسطة ELISA كما هو موضح سابقا27،30. سجل عيار الأجسام المضادة كقيم OD 450 نانومتر ، باستخدام قارئ لوحة ، وقارن بين المجموعات (الأسماك المعالجة باللعاب ، α-Gal ، والمجموعات المعالجة ب PBS) باستخدام اختبار t للطلاب مع تباين غير متساو.
ملاحظة: يعد تحديد عيار الأجسام المضادة IgM وتحليل جينات التعبير اختياريا ويتم إجراؤه فقط إذا كانت المعلومات المناعية مطلوبة. RT-qPCR mix عبارة عن مجموعة توليف cDNA من الخيط الأول لتحليل التعبير الجيني باستخدام qPCR في الوقت الفعلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعتمد البروتوكول المقدم هنا على عدة جوانب من التجارب المنشورة سابقا27,30 والنتائج التي أجريت في مختبرنا حيث تم إنشاء نموذج الزرد والتحقق من صحته لدراسة AGS والاستجابة المناعية ل α-Gal لأن كلا من البشر وسمك الزرد لا يصنعون هذا الجزيء13. يسمح هذا النموذج بتوصيف وتقييم مجموعة متنوعة من ردود الفعل التحسسية نتيجة استجابة المضيف لعاب القراد (الشكل 4) وآثارها في AGS. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت تغيرات في السلوك مثل السباحة البطيئة (الفيلم 6) ، والاستلقاء على قاع الخزان (الفيلم 7) ، وعدم الأكل ، أو الاهتزاز ، أو الحركة المتعرجة (الفيلم 8) في الأسماك استجابة لعلاج لعاب القراد الذي لم يتم ملاحظته في أسماك التحكم ؛ هذه النتائج مهمة بشكل خاص بعد تناول طعام الكلاب في اليوم 2. عند هذه النقطة ، تم بالفعل توعية الأسماك بلعاب ألفا غال والقراد ، وبدأت إدارة اللحوم الحمراء من خلال العلف. أخيرا ، لوحظ حدوث كبير من ردود الفعل التحسسية في الأسماك المعالجة بلعاب القراد (الشكل 4 أ ، ب والجدول 3) ، فقط الزرد الذي تعرض لعاب القراد طور ردود فعل تحسسية ، مما يدل على إزالة الحساسية السريعة والتحمل. من ناحية أخرى ، في الدراسات السابقة ، لم يطور الزرد الذي يتغذى على طعام الأسماك أي آفة أو رد فعل مرئي27. كان التغيير السلوكي أكثر وضوحا في الأسماك المعالجة بلعاب القراد مقارنة ب α-Gal فقط (الشكل 5). تم إجراء تحليل إضافي للتعبير عن صانعي الاستجابة المناعية الأكثر تمثيلا (IFN و TLR 2 و IL1 β و AKR2) بواسطة RT-PCR (الجدول 3) ، من أجل دراسة الاستجابات المناعية المختلفة للعلاجات. أظهرت النتائج اختلافات بين مجموعات الزرد في الكلى ، حيث يبدو أن معظم علامات الاستجابة المناعية يتم تنظيمها في الأسماك المعالجة باللعاب و α-Gal مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 6) ، ولكن لم يتم العثور على اختلافات ذات دلالة إحصائية في التعبير الجيني في الأمعاء. أظهرت الدراسات السابقة حول ردود الفعل التحسسية لمكونات لعاب القراد المختلفة في الزرد نتائج مماثلة27. بالإضافة إلى ذلك ، كنتائج تمثيلية ، طور الزرد المعالج بلعاب القراد و α-Gal باستخدام هذا البروتوكول أجساما مضادة IgM ضد α-Gal أظهرت مستويات أعلى من الأسماك المعالجة ب PBS (الشكل 7) ، كما وجد في الدراسات السابقة27,30.
الشكل 1: التصميم التجريبي لتجربة الزرد. يتم حقن الأسماك داخل الأدمة ب α-Gal ولعاب القراد و PBS كعنصر تحكم سلبي. يتم جمع العينات بعد موت سمكة أو في نهاية التجربة. يمكن استخدام العينات لتحليل مستويات Anti-α-Gal IgM والتعبير عن علامات جينية مختارة للاستجابة المناعية بواسطة qRT-PCR27. يتم تسجيل التغيرات السلوكية أو ردود الفعل التحسسية طوال التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مرفق تجريبي لأسماك الزرد. يتم الحفاظ على الزرد في نظام مياه التدفق عند 27 درجة مئوية مع دورة الضوء / الظلام من 14 ساعة / 10 ساعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: حقن علاج الزرد. يتم إجراء حقن علاج الزرد باستخدام حقنة 100 ميكرولتر مزودة بإبرة 1 سم و 29 جم داخل الأدمة على مسافة 5 مم من الزعنفة الذيلية. يتم تخدير الأسماك ومعالجتها واحدة تلو الأخرى على إسفنجة مغموسة في الماء الدافئ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: دليل على تفاعلات نزفية من النوع التحسسي في الزرد المحقون بلعاب القراد والذي مات في اليوم 2 قبل تغيير التغذية. (أ) الأسماك المصابة بردود فعل تحسسية في الحوض بعد العلاج. (ب) الأسماك الميتة من تفاعلات الحساسية النزفية (نوع رد الفعل التحسسي: تغير اللون واحمرار الجلد. ج: جمع العينات. تشير الأسهم الحمراء إلى الأمعاء والدوائر الحمراء تشير إلى الكلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النمط السلوكي الملاحظ في الأسماك. تألفت أنماط السلوك غير الطبيعية من السباحة البطيئة ، والوقوف ثابتا في قاع خزان المياه ، والسباحة المتعرجة. تشير الأسهم الزرقاء إلى وقت العلاج ، ويشير السهم الأحمر إلى وقت التغيير من علف الأسماك إلى علف الكلاب. تمت مقارنة الأسماك التي تتغذى على طعام الكلاب بين الأسماك المعالجة باللعاب والأسماك الضابطة المعالجة ب PBS بواسطة اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (p = 0.05; N = 5 أسماك / مجموعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التعبير عن علامات الاستجابة المناعية المختارة في كلية الزرد. تحليل التعبير الجيني بواسطة qRT-PCR في كلية الزرد في نهاية التجربة. تمت تسوية قيم mRNA cT مقابل D. rerio GAPDH ، معروضة كمتوسط ± SD ، ومقارنتها بين الأسماك المعالجة باللعاب ، α-Gal ، ومجموعة التحكم المعالجة ب PBS بواسطة اختبار t للطالب مع تباين غير متساو (* p < 0.05 ؛ ن = 3-7). وقد اعتمد هذا الرقم من27 واستنسخ بعد الحصول على إذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: عيارات الأجسام المضادة IgM. يتم تحديد عيار الأجسام المضادة IgM لسمك الزرد ضد α-Gal بواسطة ELISA ، ممثلة كمتوسط ± SD OD عند 450 نانومتر ومقارنتها بين الأسماك المعالجة باللعاب ، α -Gal ، ومجموعة التحكم المعالجة ب PBS بواسطة اختبار t للطالب مع تباين غير متساو (* p < 0.005; ن = 3-7). وقد اعتمد هذا الرقم من27 واستنسخ بعد الحصول على إذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تقييم الآفات وأنماط السلوك. تصنيف المتغيرات النوعية. المعلمات التي يتم تقييمها نوعيا هي الإصابات (على الزعانف والمقاييس) ، والسباحة ، والتغذية ، وما إذا كان موت الأسماك ناتجا عن الاختبار أو عن طريق المناولة. كاعتبار شخصي ، يتم تصنيف كل متغير من خفيف جدا إلى شديد الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: بادئات قليل النوكليوتيد ودرجات حرارة التلدين ل qRT-PCR. اعتمد هذا الجدول من30 واستنسخ بإذن. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: النتائج التمثيلية. يتم تحليل سجلات حساسية الزرد والوفيات والتعبير عن علامات الاستجابة المناعية المختارة بواسطة qRT-PCR في الكلى والأمعاء من الزرد. تمت تسوية قيم mRNA cT مقابل D. rerio GAPDH ومقارنتها بين الأسماك المعالجة باللعاب ، α -Gal ، ومجموعة التحكم المعالجة ب PBS بواسطة اختبار t للطلاب مع تباين غير متساو (* p < 0.05; ن = 3-7). تم اعتماد هذا الجدول من27،30 واستنسخه بإذن. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الفيلم 1: سمكة مخدرة. لا تظهر الأسماك المخدرة حركة أو تسبح ولكنها تستمر في التنفس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 2: حقن العلاج في الأسماك. يتم تخدير الأسماك على إسفنجة مبللة وحقنها بزاوية 45 درجة على أجسامها مع العلاج المشار إليه. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 3: جمع المصل من الأوعية الدموية الخيشومية. يتم تثبيت الأسماك على صفيحة البارافين مع دبابيس ويتم جمع المصل من الخياشيم باستخدام حقنة 0.5 مل مزودة بإبرة 1 سم ، 29 جرام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 4: جمع الأمعاء من سمكة القتل الرحيم. يتم قطع الأسماك بشكل سهمي باستخدام شفرة مشرط ويتم جمع الأمعاء بالملاقط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 5: جمع الكلى من سمكة القتل الرحيم. تتم إزالة المثانة السباحة ، ويتم جمع الكلى. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 6: جوانب السلوك التمثيلي التي لوحظت في الزرد المعالج. أظهرت سمكة واحدة السباحة البطيئة. جميع الأسماك من نفس المجموعة موجودة في نفس الحوض ، الفيديو هو مثال لتوضيح هذا السلوك ، وقد يكون لدى العديد من الأسماك هذا السلوك في أوقات مختلفة من اليوم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 7: جوانب السلوك التمثيلي التي لوحظت في الزرد المعالج. بقيت سمكة واحدة في قاع الحوض. جميع الأسماك من نفس المجموعة موجودة في نفس الحوض ، مقاطع الفيديو هي مثال لتوضيح هذا السلوك ، وقد يكون لدى العديد من الأسماك هذا السلوك في أوقات مختلفة من اليوم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 8: جوانب السلوك التمثيلي التي لوحظت في الزرد المعالج. أظهرت سمكة واحدة تهتز السباحة. جميع الأسماك من نفس المجموعة موجودة في نفس الحوض ، مقاطع الفيديو هي مثال لتوضيح هذا السلوك ، وقد يكون لدى العديد من الأسماك هذا السلوك في أوقات مختلفة من اليوم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الزرد هو نموذج فعال من حيث التكلفة وسهل التعامل معه وكان أيضا أداة مجدية للغاية لدراسة الآليات الجزيئية للاستجابة المناعية ، والأمراض المسببة للأمراض ، واختبار الأدوية الجديدة ، والتطعيم والحماية من العدوى33،34،35. الدراسة حول سلوك الزرد مفيدة لأن الدراسات السابقة وجدت أن بعض أنواع الأسماك تظل بلا حراك في قاع الحوض عندما تتعرض للإجهاد ، مما يؤثر على استهلاكها الغذائي ، وتناول كميات أقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يرتبط التعرج عند تحركهم أيضا بتوتر الأسماك والقلق36,37. ستوفر المعلومات الناتجة عن الدراسات من خلال تقييم هذه المعلمات في الزرد فهما أساسيا للتفاعلات الجزيئية بين القراد والمضيف والآليات المشاركة في الاستجابة المناعية للمضيف ل α-Gal والتي قد تؤدي إلى تطوير AGS ، بما في ذلك الحساسية لاستهلاك لحوم الثدييات.
لتجنب ردود الفعل الإيجابية الخاطئة على الجزيء المحقون ، من المهم إجراء حقن داخل الأدمة ليس بعمق شديد ، بالتوازي مع جسم الزرد ، وتقييم ما إذا كانت الأسماك تالفة في وقت الحقن. لا ينبغي تضمين الأسماك المصابة الناتجة عن المناولة أو اختراق الإبرة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بشدة أن يقوم محترف لديه معرفة بسمك الزرد بتقييم التغيرات في السلوك مثل السباحة والتغذية من أجل النظر في التغييرات السلوكية بناء على خلفيتهم وخبرتهم في العمل مع هذا النموذج38. اعتبار آخر مهم هو التخدير. الجرعة الكافية مهمة للحالة المثلى للعينات التي تم جمعها. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء العلاج بالحقن ، يتم تجنب استجابة الإجهاد الأكثر وضوحا ، والتي يمكن أن تعوض عن الصعوبات المحتملة المتعلقة بتشخيص الإجهاد29.
أظهرت النتائج أن نموذج الزرد يمكن أن يعزز أيضا إمكانيات تقييم مخاطر تطوير AGS بعد لدغة القراد وردود الفعل التحسسية الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق أهداف التشخيص والعلاج والوقاية من هذه الحساسية على البشر ، لأن هذه الطريقة والمعلمات التي يتم تقييمها تسمح بتوصيف أكثر دقة لردود الفعل التحسسية في الزرد.
يمكن أن تسمح هذه الطريقة بتقييم الجزيئات الحيوية اللعابية الأخرى ، المسؤولة عن تفاعلات الحساسية والموجودة في لعاب القراد. تم تحديد محتوى α-Gal في لعاب القرادسابقا 27 ، ولكن من غير المعروف ما هي المركبات الأخرى التي قد تشارك في تطوير AGS. لوحظت تفاعلات الحساسية في المجموعات التي عولجت بلعاب القراد و α-Gal ولكن ليس في مجموعات PBS (الجدول 3) ، ومع ذلك فإن السلوك يتأثر أكثر في المجموعة المعالجة بلعاب القراد منه في مجموعة α-Gal (الشكل 5). من هذه البيانات ، ستكون فرضيتنا هي أن الجزيئات الحيوية الأخرى بالاشتراك مع alpha-Gal تشارك في AGS ، لذلك يجب أن تدرس التجارب الإضافية الجزيئات الأخرى الموجودة في اللعاب التي لها تأثير على هذه النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، كان عيار الأجسام المضادة لألفا غال أعلى بكثير في الزرد المعالج بلعاب القراد وألفا غال ، والذي ، كما في الدراسات السابقة26،29 ، أظهر استجابة مناعية لألفا غال الموجود في لعاب القراد (الشكل 7).
أخيرا ، ظهرت علامات الاستجابة المناعية منخفضة التنظيم في مجموعات الزرد المعالجة بلعاب القراد وألفا غال عند مقارنتها بالمجموعة المعالجة ب PBS (الجدول 3 والشكل 6). تتوافق هذه النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها في دراسات أخرى حيث تم اختبار الجزيئات الحيوية الأخرى المرتبطة ب AGS27 ، ولكنها تعارض الدراسات السابقة25 حيث أظهرت الفئران α-Gal KO استجابة لدغات القراد واستهلاك اللحوم الحمراء استجابة IgE وتعبيرا غير منظم عن مستقبلات تشبه الرسوم الالتهابية (TLR) ومسارات إشارات IL-1 ، مما أدى إلى تنشيط Akr2. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم مسارات تنشيط هذه الاستجابات لعاب القراد والجزيئات الحيوية الأخرى في الزرد التي يمكن تحقيقها من خلال تطبيق هذه المنهجية.
بعد ذلك ، قد تسمح هذه المنهجية بفحص الجزيئات الحيوية التي تؤدي بمفردها أو مجتمعة إلى ردود فعل تحسسية والتي يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية للمضيف مما يؤدي إلى أمراض الحساسية مثل AGS وغيرها من الحساسية المنقولة بالقراد27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء مجموعة SaBio على تعاونهم في التصميم التجريبي والمساعدة الفنية مع مرفق تجارب الأسماك وخوان غالسيران سايز (IN-CSIC-UMH ، إسبانيا) لتوفير الزرد. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والابتكار / الوكالة الحكومية للبحوث MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ، إسبانيا والاتحاد الأوروبي (منحة BIOGAL PID2020-116761GB-I00). يتم تمويل Marinela Contreras من قبل وزارة العلوم ، Innovación y Universidades ، إسبانيا ، منحة IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
