Summary
이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.
Abstract
식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.
Introduction
식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K153 및 CD734와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉진 미세 환경을 조성하는 상피하 구획 내의 조직 리모델링을 표시합니다.
ESCC의 발병기전은 유전적 변화와 환경적 위험 요인에 대한 노출을 포함합니다. 주요 유전적 병변에는 종양 억제 유전자 TP53 및 CDKN2A(p16INK4A)의 비활성화와 CCND1(사이클린 D1) 및 EGFR 종양 유전자의 활성화가 포함되며, 이는 세포 주기 체크포인트 기능 장애, 비정상적인 증식 및 환경 발암 물질에 대한 노출과 관련된 유전독성 스트레스 하에서의 생존을 초래합니다. 실제로 유전 적 변화는 행동 및 환경 적 위험 요소, 가장 일반적으로 담배 및 알코올 사용과 밀접하게 상호 작용합니다. 담배 연기에는 알코올의 주요 대사 산물이기도 한 아세트알데히드와 같은 인체 발암 물질이 포함되어 있습니다. 아세트알데히드는 DNA 부가물과 가닥 간 DNA 가교를 유도하여 DNA 손상과 DNA 돌연변이 및 염색체 불안정성의 축적을 유발합니다. 과도한 유사분열 자극과 종양유전자 활성화로 인한 비정상적인 증식이 주어지면 식도 상피 세포의 악성 형질전환은 항산화제, 자가포식 및 상피-중간엽 전이(EMT)의 활성화를 포함하여 유전독성 스트레스에 대처하는 메커니즘에 의해 촉진됩니다. 흥미롭게도, 이러한 세포 보호 기능은 높은 CD44 (CD44H) 발현을 특징으로하고 종양 개시, 침윤, 전이 및 치료 저항성의 능력을 갖는 ESCC 암 줄기 세포 (CSC)에서 종종 활성화된다 5,6,7.
ESCC는 세포 배양 및 설치류 모델 8,9에서 모델링되었습니다. 지난 삼십 년 동안 ESCC의 강력한 유전자 조작 마우스 모델이 개발되었습니다. 이들은 CCND1 및 EGFR 형질전환 마우스 10,11 및 p53 및 p120 Ctn 녹아웃 마우스 12,13을 포함한다. 그러나 단일 유전적 변화는 일반적으로 빠른 발병 ESCC를 초래하지 않습니다. 이 문제는 ESCC14에서 인간 유전적 병변을 잘 요약하는 식도 발암 물질을 사용하여 극복되었습니다. 예를 들어, 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)는 CCND1 형질전환 마우스에서 ESCC 발달을 가속화한다15. 최근 몇 년 동안, 추정되는 식도 상피 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 각각의 운명이 세포 계통 추적 가능한 마우스 모델에서 조사되었습니다 3,4. 또한, 이들 세포계통 추적가능 마우스는 기존의 조직학 및 오믹스 기반 분자 특성 분석을 통해 ESCC의 기원 세포와 이러한 세포가 어떻게 CD44H CSC를 생성하는지 탐색하는 데 활용되어 왔다7.
이러한 마우스 모델과 관련된 새로운 영역 중 하나는 원래 조직의 구조가 생체 외에서 요약되는 3차원(3D) 오가노이드 시스템에서 살아있는 ESCC 및 전구체 세포를 분석하기 위한 세포 배양 기술의 새로운 적용입니다(7,8,9). 이러한 3D 오가노이드는 원발성 및 전이성 종양(예: 림프절, 폐 및 간 병변)을 포함한 쥐 조직에서 분리된 단일 세포 현탁액에서 빠르게 성장합니다. 세포는 기저막 추출물(BME)에 묻혀 잘 정의된 무혈청 세포 배양 배지를 공급합니다. 3D 오가노이드는 7-10일 이내에 성장하며, 생성된 구형 구조는 CSC 마커, EMT, 자가포식, 증식, 분화 및 세포사멸 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 특성 및 기능을 분석하기 위한 계대 배양, 냉동 보존 및 분석에 적합합니다.
이러한 방법은 두경부 점막(구강, 혀, 인두 및 후두) 및 심지어 전위와 같은 모든 층화된 편평 상피 조직에서 확립된 3D 오가노이드 배양에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 두경부 점막은 식도와 인접해 있으며 두 조직은 유사한 조직 조직, 기능 및 질병에 대한 감수성을 공유합니다. 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)과 ESCC는 모두 유전적 병변과 담배 및 알코올 노출과 같은 생활 습관 관련 환경 위험 요소를 공유합니다. 이러한 유사성을 강조하면서, 담배 연기 모방체 4NQO로 처리된 마우스는 HNSCC와 ESCC 모두를 쉽게 발달시킨다. 아래에 설명된 프로토콜이 HNSCC 모델링에 쉽게 적용될 수 있다는 점을 감안할 때 이러한 병변에서 3D 오가노이드 배양을 설정하기 위한 특정 지침이 포함되어 있습니다.
여기에서 우리는 4NQO로 치료된 마우스에서 발생하는 정상, 전종양 및 ESCC 병변을 나타내는 쥐 식도 3D 오가노이드(MEO)를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. C57BL/6과 같은 일반적인 실험실 균주, 세포 계통 추적 가능 및 기타 유전자 조작 유도체를 포함하여 다양한 마우스 균주를 활용할 수 있습니다. 우리는 정상 또는 병에 걸린 쥐 식도 상피의 분리, 단일 세포 현탁액의 준비, 성장하는 3D 오가노이드의 배양 및 모니터링, 계대 배양, 냉동 보존, 형태학 및 기타 응용 분야를 포함한 후속 분석을 위한 처리를 포함한 주요 단계를 강조합니다.
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Protocol
쥐 실험은 규정 및 동물 프로토콜 #AABB1502에 따라 계획되고 수행되었으며 Columbia University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 마우스는 마우스의 인도적 치료를 보장하고 마우스에 대한 적절한 수의학적 치료와 실험실 직원을 위한 실험실 안전 교육을 제공하는 적절한 동물 관리 시설에 수용되었습니다.
1. 생쥐를 4NQO로 처리하여 식도 IEN 및 ESCC 병변을 유도 (시간 고려 : 최대 28 주)
참고: 신생물성 식도 병변을 나타내는 MEO를 생성하기 위해 마우스는 이전에 Tang et al.14에 의해 설명된 바와 같이 4NQO 매개 화학 발암에 노출됩니다. 정상/비종양성 MEO는 처리되지 않은 마우스에서 생성됩니다.
- 마우스
- 케이지 당 4-5 마리의 마우스를 수용하고 실험을 시작하기 전에 최소 1 주일 동안 동물 시설에 적응시킵니다. 노화 관련 장애로 인해 전체 28 주 실험이 조기 종료 될 가능성을 줄이려면 8 주령에서 16 주령의 마우스로 시작하십시오.
참고: 무게가 약 20-30g인 C57BL/6 마우스가 이 프로토콜에 사용되었습니다. 더 짧은 실험의 경우 나이가 많은 마우스를 사용할 수 있습니다. 수컷 또는 암컷 마우스는 허용됩니다. 대조군 (치료 없음, 섹션 1.3.1 참조) 마우스는 연령과 성별이 일치해야합니다.
- 케이지 당 4-5 마리의 마우스를 수용하고 실험을 시작하기 전에 최소 1 주일 동안 동물 시설에 적응시킵니다. 노화 관련 장애로 인해 전체 28 주 실험이 조기 종료 될 가능성을 줄이려면 8 주령에서 16 주령의 마우스로 시작하십시오.
- 4NQO를 함유하는 음용수의 제조
- 에틸렌 프로필렌 글리콜에 1mg/mL 4NQO 원액을 준비합니다(재료 표). 밀봉 필름으로 덮인 500mL 유리 비커에 4NQO 100mg의 99.9% 에틸렌 프로필렌 글리콜을 녹입니다. 실온(RT)에서 800rpm의 마그네틱 교반기를 사용하여 30분 동안 완전히 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 900mL의 오토클레이브 탈이온수를 100mL의 1mg/mL 4NQO 원액에 넣고 밀봉 필름으로 덮인 2L 플라스틱 눈금 실린더에서 반전으로 혼합합니다. 10% 에틸렌 프로필렌 글리콜에 100μg/mL 4NQO 1L 용량은 500mL 음료수 병이 장착된 2개의 마우스 케이지를 제공합니다.
주의: 4NQO는 암을 유발할 수 있는 합성 화학 발암 물질입니다. 니트릴 장갑과 긴팔 실험복을 착용하고 발가락이 막힌 신발을 신습니다. 적절한 눈 보호, 얼굴 보호 및 머리 가리개를 고려하십시오. 폐기물 처리를 위해 4NQO는 환경 보건 및 안전에 의한 유해 폐기물 관리에 대한 기관 지침에 따라 라벨이 부착된 용기에 넣어야 합니다.
- 4NQO로 치료 및 모니터링
- 음료수 병을 부착하고, 16주 동안 생쥐에게 음용수 임의 로 4NQO를 투여한다. 10%(w/v) 프로필렌 글리콜을 비히클(무처리) 대조군으로 사용하십시오.
참고: IEN을 유도하기 위해 더 짧은 기간의 4NQO 치료를 사용할 수 있습니다. - 일주일에 한 번 물을 보충하십시오.
- 매주 각 마우스를 실험실 저울의 플라스틱 용기에 넣어 무게를 잰다.
- 16주간의 4NQO 치료 기간이 끝나면, 최대 12주 동안 4NQO 후 관찰 기간 동안 마우스에게 정기적으로 식수를 제공하기 시작한다(도 1).
- 고통의 징후(예: 이동성 장애, 구부러진 습관 및 위축된 행동), 삼킴곤란 및 탈수의 징후에 대해 매일 마우스를 모니터링합니다. 또한 체중이나 음식 및 액체 섭취량의 변화에 대해 매주 마우스를 평가합니다. 체중이 초기 체중에서 10% 이상 떨어지면 생쥐에게 액체 건강 보조 식품을 먹이십시오.
참고: 액체 식이 보조제에 불응하는 체중 감소는 ESCC를 나타낼 수 있으며 체중의 20% 이상을 감량한 마우스는 안락사시켜야 합니다. 중요한 것은 MEO가 조기에 안락사된 마우스에서 생성될 수 있다는 것입니다. 유전자 변형이 없는 C57BL/6 마우스는 일반적으로 4NQO 후 관찰 기간이 끝날 때까지 이환율의 징후를 나타내거나 눈에 보이는 ESCC 병변이 없습니다.
- 음료수 병을 부착하고, 16주 동안 생쥐에게 음용수 임의 로 4NQO를 투여한다. 10%(w/v) 프로필렌 글리콜을 비히클(무처리) 대조군으로 사용하십시오.
- 동물 준비
- 분당 챔버 부피의 30%-70%를 대체하는 유속으로CO2로 채워진CO2 챔버에서 마우스를 안락사시킨다. 자궁 경부 탈구로 사망을 확인하십시오.
- 앙와위 자세에서 마우스의 팔다리와 코를 21G 바늘을 사용하여 해부 플랫폼에 고정합니다.
- 마우스의 복부 표면을 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 해부(시간 고려: 0.5 h)
- 복부 중간 털과 피부를 꼬집어 피부를 열어 아래 내장에서 방출되도록 합니다. 수술용 가위를 사용하여 하복부에서 턱까지 두개골, 복부 정중선을 절개합니다.
- 정중선 절개에서 시작하여 수술용 가위를 사용하여 마우스 양쪽의 팔다리까지 방사형 절단을 합니다. 피부 덮개를 벗겨 내십시오.
- 자궁 경부 기관을 노출시키려면 해부 가위를 사용하여 정중선에서 침샘을 나눕니다. 기관은 땀샘 깊숙이 자리 잡고 있습니다.
- 흉부 기관을 노출시키려면 흉골을 제거하십시오.
- 집게로 복막을 부드럽게 꼬집고 들어 올리고 가위를 사용하여 복막을 흉곽을 따라 두개골과 옆으로 나눕니다.
- 횡격막의 꼬리 표면에서 간을 부드럽게 수축시키고 가위를 사용하여 흉골 노치, 특히 xiphoid process의 등쪽 표면에서 횡격막에 작은 절개를합니다. 이것은 내장 흉막에서 폐와 심장을 방출합니다.
- 흉곽과 흉곽을 분리하십시오. 횡격막의 절개 부위에 가위를 삽입하고 경추 거들까지 두개골로 절개합니다. 이 절개하는 동안 아래 장기의 손상을 피하기 위해 흉골의 등쪽 표면에 밀착하십시오. 해부면이 기관 앞쪽에 있는지 확인하십시오.
- 가위를 사용하여 흉골 양쪽의 갈비뼈를 자르고 흉골을 제거하십시오. 흉부 내용물이 노출되어 있는지 확인하십시오.
- 복부 식도를 노출시킵니다. 집게로 antrum을 잡고 위를 앞쪽으로 부드럽게 들어 올립니다. 가위로 위와 식도에서 비장, 췌장, 장간막을 해부합니다.
- 흉부 식도를 노출시킵니다(그림 2).
- 갑상선 연골에 즉시 꼬리 기관을 부드럽게 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 기관의 등쪽 식도를 해부합니다.
- 홍채 가위로 갑상선 연골의 기관을 나눕니다.
- 꼬리 방향으로 조심스럽게 절개하여 식도의 나머지 부분에서 기관을 떼어냅니다.
- 기관과 함께 폐, 심장 및 흉선을 한꺼번에 제거하십시오. 대동맥과 대정맥을 해부하고 분할할 때 식도가 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 가위로 유문에서 위를 나눕니다.
- 집게로 antrum을 잡고 두개골로 해부하여 식도를 척추에서 분리하십시오.
- 갑상선 연골 수준에서 식도를 나누고 식도와 위를 한꺼번에 채취합니다(그림 3).
- 심장에서 식도를 나누어 위와 식도를 분리합니다(그림 4, 상단 패널, 빨간색 선).
- 식도 바깥 표면의 근막을 해부하십시오. 조직학을 위해 샘플을 예약하려면 (선택 사항) 식도의 절반을 제거하고 가위로 세로로 나눕니다. 남아있는 온전한 식도를 얼음 위의 차가운 PBS에 넣습니다.
- 더 큰 곡률을 따라 위를 열고 PBS로 충분히 씻으십시오. 앞위를 분리하고 차가운 PBS로 씻으십시오. 얼음 위의 차가운 PBS에 앞위를 놓습니다.
- 혀를 채취하려면 코에서 21G 바늘을 제거하고 핀셋으로 혀를 빼냅니다. 가능한 한 오랫동안 혀를 자르십시오. 얼음 위의 차가운 PBS에 혀를 놓습니다.
2. 쥐 식도 오가노이드(MEO) 배양 확립
참고: 이 프로토콜은 트립신 처리 전에 혀 조직을 다지는 단계를 추가하여 쥐 혀 오가노이드 배양을 확립하는 데에도 사용할 수 있습니다. 2.2.3단계의 참고 사항을 참조하십시오.
- 시약의 제조
참고: 시약 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 달리 명시되지 않는 한 제조업체의 지침에 따라 원액을 준비하고 보관하십시오.- 이 프로토콜에 사용된 기저막 매트릭스(BME)의 일회용 분취량을 사용 당일까지 -20°C에서 보관하고, 이후에 얼음 또는 2-8°C에서 해동하고, 사용하지 않을 때는 항상 얼음 위에 보관해야 합니다.
- 250mg의 대두 트립신 억제제(STI)를 1,000mL의 PBS(250mg/mL 스톡 농도)에 녹이고 필터 살균(0.22μm)합니다. 50mL 분취량을 원뿔형 튜브에 분주하고 4°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
- 마우스 오가노이드 배지(MOM) 준비: 1mM N-아세틸-L-시스테인(NAC), 2% R-Spondin 및 Noggin 조절 배지(RN CM), 1x N-2 보충제, 1x B-27 보충제, 10mM HEPES, 1x 항생제-항진균제, 1x GlutaMAX 보충제 및 100ng/mL 마우스 표피 성장 인자(mEGF). MOM 500mL를 한 번에 준비하고, 50mL 분취량으로 나누고, 사용할 준비가 될 때까지 2-8°C에서 보관한다. 사용 직전에 0.5μg/mL 암포테리신 B와 10μM Y-27632를 첨가하십시오.
- MOM, 0.25% 트립신 및 대두 트립신 억제제(STI)를 사용 전에 물 또는 비드 조에서 37°C로 예열한다.
- 해부된 마우스 조직에서 각질형성세포 분리(시간 고려: 2시간)
- 식도 조직을 PBS 중 500μL의 디스파제(총 2.5-5단위)로 옮기고 37°C 및 800rpm에서 10분 동안 열혼합기에서 배양합니다.
- 조직을 배양 접시로 옮기고 집게를 사용하여 상피에서 근육층을 조심스럽게 제거합니다(그림 4).
참고: 이 단계는 디스파스로 배양하기 전에 숙련된 연구원이 수행할 수도 있습니다. - 상피를 0.25% 트립신 500μL가 들어 있는 미세원심분리 튜브로 옮기고 37°C 및 800rpm에서 10분 동안 열혼합기에서 인큐베이션합니다.
참고: 출발 물질이 혀 조직인 경우 트립신을 추가하기 전에 멸균 메스로 조직을 약 1-2mm2 크기의 작은 조각으로 다집니다. - 조직을 펠릿화하기 위해 2,000 x g 에서 5-10초 동안 잠시 원심분리합니다. 100μm 셀 스트레이너가 있는 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다. 원형 운동을 사용하여 넓은 보어 팁이 있는 스트레이너를 통해 조직/세포 현탁액을 옮깁니다.
- 스트레이너를 통해 STI 3mL를 넣고 원을 그리며 세척합니다.
- 1mL 투베르쿨린 주사기 플런저의 베이스로 스트레이너를 문질러 세포를 밀어냅니다.
- PBS 3mL로 여과기를 3-5회 세척하고 세척 사이에 주사기 바닥으로 여과기를 문지릅니다.
- 튜브를 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 튜브에 1mL의 용액을 남깁니다.
- 펠렛을 나머지 1mL에 재현탁하고 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 펠릿을 100 μL의 MOM에 재현탁시키고; 필요에 따라 볼륨을 조정합니다. 트리판 블루 배제를 통해 자동 세포 계수를 수행합니다.
- 초기 세포 현탁액의 파종(시간 고려: <1시간)
- 24-웰 세포 배양 플레이트를 37°C 배양기에서 예열한다.
- 5,000개의 생존 세포를 75%(v/v) BME/MOM에서 웰당 총 부피 50μL로 플레이트합니다. 도금된 웰 수를 최대화하고 아래 계산 예에 따라 하나의 추가 웰에 대해 BME에서 충분한 셀을 준비합니다.
참고: 동결 보존 배지(FBS의 10% DMSO)에 있는 초과 세포를 최대 농도 1 x 106 cells/mL로 냉동 보존합니다. 극저온 혼합물을 냉동 용기에 담아 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 장기 보관을 위해 기상 액체 질소로 옮깁니다. - 미세 원심분리기 튜브에서 먼저 MOM에서 적절한 세포 희석액을 준비한 다음 도금 직전에 넓은 보어 팁을 사용하여 BME를 추가합니다.
- 200μL 너비의 보어 팁을 사용하여 팁과 웰의 바닥 또는 측면 사이의 접촉을 피하면서 웰 중앙에 50μL 액적을 천천히 추가합니다(그림 5). 팁에서 액체를 배출하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하거나 돔이 평평해집니다.
- BME를 37°C, 5%CO2, 95% 상대 습도(RH) 인큐베이터에서 30분 동안 고형화시킨다.
- 0.5 μg/mL 암포테리신 B와 10 μM Y-27632가 보충된 웰당 500 μL의 MOM을 조심스럽게 추가합니다.
참고: 초기 1차 배양 전반에 걸쳐 모든 MOM에 암포테리신을 추가합니다. 모든 구절에 대해 통과 당일(0일)에만 Y-27632를 추가합니다. - 3-4 일에 MOM을 변경 한 다음 통과 준비가 될 때까지 2-3 일마다 변경하십시오.
- 7-10일째에, 오가노이드를 이미지화하고, 형성된 오가노이드의 수를 초기에 시딩된 세포의 수로 나누어 오가노이드 형성률(OFR)을 측정한다.
계산 예:
- 쥐 식도 오가노이드(MEO)의 계대배양 및 냉동 보존(시간 고려: <1.5시간)
- BME를 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. MOM, 0.05% 트립신 및 STI를 사용하기 전에 물 또는 비드 배스에서 37°C로 예열합니다. 24-웰 세포 배양 플레이트를 37°C 배양기에서 예열한다.
- 넓은 구멍의 마이크로피펫 팁을 사용하여 상층액과 함께 BME 돔에서 오가노이드를 수집합니다. 위아래로 피펫팅하여 BME를 방해합니다.
알림: 동일한 샘플이 포함된 웰을 단일 미세 원심분리기 튜브에 결합합니다. - 오가노이드를 펠릿화하기 위해 2,000 x g 에서 10-15초 동안 잠시 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
- 펠릿을 부드럽게 제거하고 펠릿을 0.05% 트립신 500μL에 재현탁합니다.
- 튜브를 37°C 및 800rpm에서 10분 동안 열혼합기에서 배양합니다.
- 600 μL의 STI로 트립신을 비활성화합니다.
- 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 폐기하십시오. 세포 펠릿을 MOM 100μL에 재현탁합니다. 트리판 블루 배제를 통해 자동 세포 계수를 수행합니다.
알림: 볼륨은 필요에 따라 조정할 수 있습니다. - 2,000-5,000개의 생존 세포를 75%(v/v) BME/MOM에서 웰당 총 부피 50μL로 플레이트합니다. 도금된 웰 수를 최대화하고 앞에서 언급한 예제 계산에 따라 BME에서 하나의 추가 웰에 대해 충분한 셀을 준비합니다.
참고: 동결 보존 배지(FBS의 10% DMSO)에 있는 초과 세포를 최대 농도 1 x 106 cells/mL로 냉동 보존합니다. 극저온 혼합물을 냉동 용기에 담아 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 장기 보관을 위해 기상 액체 질소로 옮깁니다. - 미세 원심분리기 튜브에서 먼저 MOM에서 적절한 세포 희석액을 준비한 다음 도금 직전에 넓은 보어 팁을 사용하여 BME를 추가합니다.
- 200 μL 폭의 보어 팁을 사용하여 팁과 웰의 바닥 또는 측면 사이의 접촉을 피하면서 웰 중앙에 50 μL 방울을 천천히 추가합니다. 팁에서 액체를 배출하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하거나 돔이 평평해집니다.
- 플레이트를 37°C, 5% CO 2,95% RH 인큐베이터 에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 10 μM Y-27632가 보충된 웰당 500 μL의 MOM을 조심스럽게 추가합니다.
참고: 통과 당일(27632일)에만 Y-0을 추가하십시오. 미디어 변경 중에 추가할 필요가 없습니다. 암포테리신 B를 추가하는 것은 더 이상 필요하지 않습니다. - 3-4 일에 MOM을 변경 한 다음 통과 준비가 될 때까지 2-3 일마다 변경하십시오.
- 7-10일에 오가노이드를 이미지화하고 OFR을 측정합니다.
- 쥐 식도 오가노이드(MEO)의 해동 및 회복(시간 고려: <1시간)
- BME를 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 24-웰 세포 배양 플레이트를 37°C 배양기에서 예열한다.
- 15mL 원뿔형 튜브에 10mL의 콜드 또는 RT MOM 또는 PBS를 준비합니다.
- 37°C 수조 또는 비드 수조에서 약 30초에서 1분 동안 또는 작은 얼음 알갱이가 남을 때까지 극저온 액체를 해동합니다.
- 미리 습윤된 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 MOM 또는 PBS가 들어 있는 튜브에 적가하는 방식으로 천천히 옮깁니다.
- 튜브를 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 폐기하십시오. 세포 펠릿을 100 μL의 MOM에 재현탁시키고; 필요에 따라 볼륨을 조정합니다. 트리판 블루 배제를 통해 자동 세포 계수를 수행합니다.
- 5,000-10,000개의 생존 세포를 75%(v/v) BME/MOM에서 웰당 총 부피 50μL로 플레이트합니다. 도금된 웰 수를 최대화하고 앞에서 언급한 예제 계산에 따라 하나의 추가 웰에 대해 BME에서 충분한 셀을 준비합니다.
- 쥐 식도 오가노이드(MEO)의 계대배양 및 냉동보존을 위한 프로토콜의 나머지 단계를 계속합니다(단계 2.4.11 참조).
3. 파라핀 포매용 오가노이드 준비(시간 고려: <1시간[시약 준비 시 1.5시간 추가])
- 광경 마이크로피펫 팁을 사용하여 미세 원심분리기 튜브당 3개의 웰을 수집합니다. 상층액과 함께 BME 돔에서 오가노이드를 수집합니다. 위아래로 피펫팅하여 BME를 방해합니다.
- 오가노이드를 펠릿화하기 위해 2,000 x g 에서 10-15초 동안 잠시 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
- 펠릿을 부드럽게 제거하고 300μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 펠릿을 다시 현탁합니다.
- 오가노이드를 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다.
- 오가노이드를 펠릿화하기 위해 2,000 x g 에서 10-15초 동안 잠시 원심분리합니다. 가능한 한 많은 PFA를 제거하고 폐기하십시오.
- 펠릿을 부드럽게 제거하고 500μL의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
참고: 고정 오가노이드는 다음 단계로 진행하기 전에 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 50mL의 한천 젤(2% 한천과 2.5% 젤라틴)을 준비합니다.
참고: 배양 시간으로 인해 한천 겔 스톡을 미리 준비한 다음 오토클레이브 주기를 수행합니다.- 150mL 오토클레이브 가능한 유리 비커에 물 50mL에 Bacto-agar 1g과 젤라틴 1.25g을 재현탁합니다.
- 서스펜션을 소용돌이 치고 RT에서 30-60 분 동안 그대로 두십시오.
- 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
- 약간 식힌 후 15mL 원뿔형 튜브에 5mL 분취액을 분주합니다.
- RT에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 미세 원심분리기 튜브 랙을 뒤집고 밀봉 필름 시트로 표면을 덮어 매립 표면을 준비합니다. 해당 오가노이드 ID로 레이블을 지정합니다.
- 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
- 한편, 한천 겔이 들어있는 15mL 원뿔형 튜브를 100mL의 물이 들어있는 150mL 유리 비커에 넣고 1-2 분 동안 또는 물이 끓기 시작하고 한천 겔이 액체 상태가 될 때까지 최고 전력 설정에서 전자 레인지를 돌려 한천 겔을 액화시킵니다.
주의 : 전자레인지에 돌리기 전에 한천 젤이 들어 있는 원추형 튜브의 캡을 풉니다. - 오가노이드 펠릿이 들어 있는 미세원심분리기 튜브를 미세원심분리기 튜브에 물을 유입시키지 않고 따뜻한 물에 부분적으로 담그십시오.
- 튜브 측면에 50μL의 한천을 추가하여 오가노이드 펠릿을 조심스럽게 오버레이합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고(재현탁하지 말고 펠릿을 그대로 유지) 한천 겔 방울의 펠릿을 매립 표면의 밀봉 필름으로 옮깁니다.
- 3.12단계와 3.13단계를 추가로 50μL의 액체 한천 겔로 반복하여 남아 있는 오가노이드 펠릿을 수집하고 동일한 겔 방울에 조심스럽게 추가합니다.
- 오가노이드 펠릿이 포함된 액적을 4°C에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 집게를 사용하여 오가노이드 펠릿이 들어 있는 물방울을 라벨이 붙은 병리학 카세트에 조심스럽게 옮깁니다.
- 카세트를 70°C에서 4% 에탄올에 최대 1개월 동안 보관합니다.
- 파라핀 블록을 준비하기 위해 일상적인 조직학적 처리를 통해 파라핀 포매를 진행합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 음용수로 투여된 16주간의 4NQO와 10주에서 12주간의 관찰 기간으로 구성된 특정 치료 요법에 따라 4NQO 처리된 마우스의 정상 식도 조직 또는 ESCC 종양 조직에서 쥐 식도 오가노이드(MEO)를 생성하는 과정을 설명합니다(그림 1). 그런 다음 마우스는 혀 또는 식도 조직의 해부를 위해 안락사됩니다(그림 2 및 그림 3). 우리는 손상되지 않은 식도에서 상피층을 분리하는 방법(그림 4)을 후속 단일 세포 분리에 활용하는 방법을 설명합니다. 식도 유래 상피 세포는 처음에 기저막 기질 및 잘 특성화된 무혈청 세포 배양 배지(그림 5)에 세포를 포함하는 50μL 액적에 웰당 5,000개의 세포로 도말하고 평균 7-10일 동안 오가노이드를 형성하도록 합니다. 쥐 식도, 혀 및 전위 오가노이드는 위상차/명시야 이미징 및 조직병리학에 의한 형태학적 분석으로 추가로 특성화할 수 있습니다(그림 6). 오가노이드의 자가 재생 능력은 계대 배양 시 OFR을 결정하여 평가할 수 있습니다(그림 7). OFR은 증식성 기저세포 세포의 함량에 크게 영향을 받으며, 이는 형태와 결합된 성장 동역학 분석에 의해 밝혀졌습니다(그림 8). 마지막으로, 4NQO를 처리하지 않은 마우스의 정상 구조를 포함한 이러한 오가노이드는 지속적으로 성장하며 오랫동안 유지될 수 있습니다(그림 9).
그림 1: 4NQO 치료 요법. 마우스를 16주 동안 음용수에서 4NQO로 처리한 후 10주 내지 12주 관찰 기간을 가졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 흉부 식도 노출. 기관 (파란색 선)은 식도 (흰색 선)에서 벗겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 편평 기둥 접합부(파란색 선)에서 위(노란색 선)에 연결된 식도(흰색 선). 약어: FS = 전위, DS = 원위 위, L = 간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 위와 식도를 분리하고 상피를 분리합니다. 위: 위가 식도에서 분리되어 있습니다. 빨간색 선은 해부 중에 식도를 분리해야 하는 위치를 나타냅니다. 중간: 상피(흰색 선)가 근육층에서 벗겨집니다. 아래: 그림 1에 설명된 치료 일정에 따라 종양이 있는 식도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 넓은 보어 팁을 사용하여 단일 셀을 포함하는 BME 액적 도금. 오가노이드는 4-7일 경에 형성되기 시작하며 평균 7-10일 후에 통과할 준비가 됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 형태학적 분석에 의한 오가노이드 특성화. (A) 정상 및 ESCC MEO의 대표 이미지. 왼쪽 상단: 일반 MEO의 명시야 이미지. 왼쪽 하단 : 정상 MEO의 H & E 염색. 오른쪽 상단: 4NQO 처리 마우스에서 촬영한 ESCC MEO의 명시야 이미지. 오른쪽 하단 : 핵 이형성 및 갑작스런 각질화를 나타내는 4NQO 처리 마우스의 ESCC MEO의 H & E 염색, 후자는 SCC 종양 내에서 잘 분화 된 구획을 나타내는 케라틴 펄을 연상시킨다. (B) 정상 마우스 혀 및 전위 오가노이드(각각 MTO 및 MFO)의 대표 이미지. 왼쪽 상단: 일반 MTO의 명시야 이미지. 왼쪽 하단 : 정상 MTO의 H & E 염색. 오른쪽 상단: 일반 MFO의 명시야 이미지. 오른쪽 하단 : 정상 MFO의 H & E 염색. 모든 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 오가노이드 재생 능력 결정. (A) 계대배양에 의한 오가노이드 재생 능력을 결정하기 위한 실험 설계. 성장하는 1차 오가노이드(P0)는 다양한 시점에서 해리되어 단일 세포 현탁액으로 만들어집니다. 이들 세포는 계대배양 7일째에 OFR을 확인하기 위해 계대배양된다(P1). (B) 4NQO 처리되지 않은 마우스에서 생성된 계대배양 MEO의 대표적인 OFR 데이터. OFR은 유사분열 후 말단 분화를 겪은 더 많은 세포를 포함하는 성숙한 오가노이드에서 감소된 증식성 기저 세포를 반영하여 시간의 함수로 감소합니다( 그림 8 참조). p < 7일, 11일 및 21일의 OFR 대 4일의 OFR 0.001(n = 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 다양한 시점에서 형태에 의해 밝혀진 오가노이드의 성장 동역학. 4NQO-처리되지 않은 마우스로부터의 정상 MEO의 대표적인 명시야 및 H&E 염색 이미지가 도시되어 있다. 오가노이드 내핵의 각질화는 10일째에 두드러집니다. 증식성 기저 세포는 14일째 및 21일째 시점에서도 가장 바깥쪽 세포층에 남아 있습니다. 면역조직화학/면역형광의 경우, 축적된 케라틴은 원래 편평 상피 조직의 경우와 마찬가지로 비특이적 염색을 유발할 수 있으므로 염색 조건, 대조군(예: 2차 항체만) 및 데이터 해석의 신중한 최적화가 필요합니다. 모든 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 4NQO를 처리하지 않은 마우스에서 생성된 대표적인 정상 MTO의 개체군 배가 곡선. 이러한 오가노이드는 이전에 생성, 냉동 보존 및 해동되어 여러 계대 및 장기 배양에 걸쳐 꾸준한 성장을 입증했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 거시적으로 보이는 병변이나 조직학적 IEN 및 ESCC 병변이 없는 4NQO 처리된 마우스에서 신생물 오가노이드가 얼마나 일찍 그리고 얼마나 자주 검출될 수 있는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 비록 4NQO가 다양한 마우스 균주에서 식도 병변을 유도하였지만14, MEO는 C57BL/6 마우스에서만 생성되었다. ESCC의 발달 및 진행은 Trp53 손실 및 사이클린 D1 과발현과 같은 유전자 조작 유전적 병변이 있는 마우스에서 가속화됩니다 7,14,15. 이러한 마우스에서 신생물 MEO는 4NQO 치료 중 또는 후에 야생형 C57BL/6 마우스보다 더 자주 그리고 더 일찍 나타날 수 있습니다. 필요한 경우 계획된 실험에서 마우스의 적절한 표본 크기를 추정하기 위해 파일럿 연구를 수행해야 합니다. 멀티웰 세포 배양 플레이트를 사용하면 기술 복제물(n = 3-6)을 쉽게 생성할 수 있습니다. 그러나 세포가 BME를 함유한 점성 배지에 분배될 때 well-to-well 변동성을 최소화하기 위해 신중한 피펫팅과 실습이 필요합니다.
설명된 프로토콜에서 MEO 설정에 대해 거의 100%의 성공률을 예상할 수 있습니다. 그러나, 성공적인 MEO 배양은 초기 단리된 식도 상피 세포의 생존력에 달려 있으며, 이는 주로 출발 물질의 품질과 관련이 있다. 안락사 시 생쥐를 즉시 해부할 수 없는 경우, 사체를 하룻밤 동안 4°C에서 보관하여 다음날 식도를 분리할 수 있습니다. 그러나 냉동 된 조직은 생존 가능한 세포를 생성하지 않으므로 시체를 얼려서는 안됩니다. 해리된 식도 상피 세포는 동결 배지(90% FBS 및 10% DMSO)에서 단일 세포 현탁액으로 냉동 보존하고 액체 질소에 저장하여 나중에 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 식도(상피 시트)는 덜 최적이지만 유사한 방식으로 냉동 보존될 수 있습니다. MEO는 식도 상피 세포의 고유한 하위 집합을 정제하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 기타 방법으로 정제된 세포로 시작할 수 있지만 정제 후 세포 생존율이 감소할 수 있습니다. 트리판 블루 배제 테스트와 같은 세포 생존율 분석은 살아있는 세포를 죽은 세포와 구별할 수 있지만 죽어가는 세포는 구별할 수 없으므로 오가노이드 배양 개시 전에 세포 생존율을 과소평가할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 확립 후, 4NQO 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스 모두의 MEO는 무기한(>20 계대) 계대할 수 있으며, 지정된 배지의 각 계대에서 >80%의 생존율이 예상됩니다. 요구 사항이 명확하지 않은 오가노이드 배지 성분이 있다는 점은 주목할 만합니다. Zheng et al. 최근 쥐 식도 오가노이드를 성장시키기 위해 Wnt3A, RSpondin-1 및 Noggin을 포함하는 보충제가 필요하다는 것을 입증했다16. 그러나 우리는 혀, 식도 및 전위의 오가노이드가 성장하고 그것 없이 여러 번(>10 계대) 계대될 수 있기 때문에 이 프로토콜에서 Wnt3A를 사용하지 않습니다 7,3,17. 이러한 요소의 요구 사항은 개별적으로 테스트되지 않았습니다.
상피 시트는 종양과 같이 거시적으로 보이는 병변 없이 정상 식도 또는 식도 점막에서 MEO를 생성하는 데 사용됩니다. 상피 시트의 사용은 출발 물질로서 상피 세포의 농축을 허용한다. 그러나, 종양을 보유하는 식도 점막으로부터 상피 시트의 분리는 상피하 구획으로의 ESCC 침범으로 인해 어렵다. 전체 식도는 MEO 배양을 시작하는 데 사용할 수 있지만 비상피 세포 집단의 존재는 초기 배양에서 오가노이드 형성률(OFR)을 감소시킬 수 있습니다. OFR은 현재의 MEO 배양 조건이 상피 세포가 BME 내에서 성장할 수 있도록 허용하기 때문에 후속 계대에서 상승할 것으로 예상됩니다. 참고로, 여기에 설명된 프로토콜은 다른 기관, 특히 구강 혀와 전위에도 적용될 수 있으며, 둘 다 4NQO 유발 편평 세포 발암에 취약합니다. 참고로, 우리는 상피 세포를 분리하지 않고 전체 조직에서 마우스 혀 오가노이드(MTO)와 마우스 전위 오가노이드(MFO)를 생성했습니다. 필요한 경우, 이러한 오가노이드는 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제된 상피 세포의 하위 집단(예: 높은 CD44 발현을 특징으로 하는 암 줄기 세포, CD73+ 추정 식도 줄기 세포)으로 만들 수 있습니다.
추가로, 비-상피 세포, 특히 섬유아세포는 BME 밖으로 이동하여 플라스틱 표면 상의 단층에서 성장할 수 있고, 이에 의해 암-관련 섬유아세포를 포함하는 쥐 식도 섬유아세포의 동시 확립을 허용한다. 3D BME에서 상피 세포 성장에 대한 선택성은 여기에 설명된 현재 조건 하에서 면역 세포 및 다른 세포 유형과 MEO의 공동 배양을 제한할 수 있습니다. 공동 배양 실험을 위한 최적화가 진행 중입니다. 추가적으로, 종양 침습성 전방은 기관형 3D 배양 8,18과 같은 대안적인 3D 배양 방법에 의해 모델링된 상피-기질 경계면에서 더 잘 요약될 수 있다. 더욱이, MEO는 상피 장벽 기능을 측정하기에 적합한 플랫폼이 아닐 수 있으며, 이는 경상피 전기 저항을 평가하기 위해 공기-액체 계면 배양을 활용하여 더 잘 평가할 수 있습니다 19,20,21.
MEO, 그리고 실제로 MTO 및 MFO의 가장 큰 장점은 양성 및 악성 모두의 원래 상피 구조를 요약하는 단일 세포 유래 구조의 빠른 성장입니다. 이러한 오가노이드의 배가 시간(DT)은 일반적으로 <20시간으로 추정됩니다. 4NQO를 처리하지 않은 마우스에서 얻은 정상 MTO의 성장 동역학은 정상 오가노이드의 장기 배양 능력과 예상되는 개체군 배가(PD) 수준 및 DT를 모두 보여줍니다(그림 9). 이 예에서 각 통과 동안 약 10개의 모집단 배가가 발생했으며 계산된 DT는 평균 18.5시간 및 18.3시간입니다. 초기 1차 배양 후 파종 밀도에 관계없이 일반적으로 15%-25%의 OFR이 예상되며, MEO는 크기가 더 작을 수 있지만 빠르면 4일째에 나타날 수 있습니다(그림 8). 위상차 현미경 검사에서 정상 식도 점막의 오가노이드는 표면이 매끄러운 구형 구조를 나타냅니다. 시간의 흐름에 따라 정상 오가노이드는 내부 세포 덩어리가 유사분열 후 말단 분화를 겪을 때 동심원 구조를 나타내어 층화된 편평 상피를 모방하는 분화 구배를 생성합니다. 신생물 오가노이드는 불규칙한 표면을 나타내며, 이는 바깥쪽으로 확장될 수 있는 기저 세포의 높은 증식 활성을 반영합니다. 증식-분화 구배를 표시하는 MEO의 능력은 증식성 식도 기저 각질세포가 어떻게 증식하고 유사분열 후 말단 분화를 겪을 수 있는지 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 해리된 MEO 세포를 계대배양함으로써 4NQO에 의해 유도된 유전독성 스트레스 하에서 상피 세포 자가 재생(그림 7)과 재생 또는 형질전환을 평가할 수 있습니다. 구강암의 맥락에서 MTO 모델을 활용하여 유사한 연구를 수행하여 설명된 4NQO 마우스 오가노이드 모델을 두경부 SCC에 적용하는 범위를 넓힐 수도 있습니다. 상피 재생은 줄기 세포를 의미할 수 있지만 MEO 시스템의 잠재적인 약점 중 하나는 MEO 형성이 세포 증식에 의존하기 때문에 정지 또는 드물게 분열하는 줄기 세포를 감지하지 못할 수 있다는 것입니다. MEO에 대한 최근의 단일 세포 분석 연구는 식도 상피 세포 이질성에 대한 실질적인 통찰력을 제공했습니다22.
악성 형질전환은 개별 MEO 구조와 MEO를 포함하는 세포의 핵 이형성에 대한 신중한 형태학적 평가에 의해 평가될 수 있습니다. 전체 엑솜 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱에 의한 MEO의 분자 프로파일링은 전종양 및 ESCC 병변의 뚜렷한 특성을 나타낼 수 있습니다. 그러나 악성 형질전환에 대한 궁극적인 검사는 ESCC 세포의 종양원성을 문서화하기 위해 면역결핍 또는 면역적격 마우스에 MEO를 이식해야 할 수 있습니다. syngeneic immunocompetent 마우스에 이식된 ESCC MEO는 또한 종양 면역 미세환경을 조사하기 위한 우수한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
MEO의 응용 분야는 광범위합니다. 형태학, 생화학 및 다중 오믹스 접근법 외에도 유세포 분석은 DNA 합성, 세포자멸사, 자가포식 및 미토콘드리아 호흡과 같은 세포 과정을 분석하는 데 활용될 수 있을 뿐만 아니라 생체 외의 유전적 및 약리학적 변형에 해당하는 MEO 내에서 세포의 고유한 하위 집합을 정의하는 세포 표면 마커를 분석할 수 있습니다 7,23 . 또한, 오가노이드는 상피 세포와 간질, 면역 세포 또는 심지어 마이크로바이옴 사이의 상호작용을 평가하기 위한 공동 배양 실험에 사용될 수 있다24. 마지막으로, MEO는 세포 유형-특이적 유전자 조절 프로모터 (예를 들어, Sox2, 사이토케라틴 Krt5 및 Krt15) 하에서 발현되는 형광 리포터 단백질과 같은 세포 계통-추적가능한 유전자 변형을 운반하는 마우스로부터 생성될 수 있다3,4,7,25.
요약하면, MEO는 ESCC 연구에 매우 중요한 도구입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 MEO가 생성, 유지 관리 및 특성화가 비교적 쉽고 ESCC 및 식도 종양의 특징을 요약할 수 있는 다용도 모델을 나타낸다는 것을 보여주는 것을 목표로 합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 위해 컬럼비아 대학교 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 공유 리소스(유세포 분석, 분자 병리학, 공초점 및 특수 현미경)에 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Alan Diehl 박사, Adam J. Bass, Kwok-Kin Wong 박사(NCI P01 식도 발암 메커니즘)와 Rustgi 및 Nakagawa 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 다음 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: P01CA098101(HN 및 AKR), R01DK114436(HN), R01AA026297(HN), L30CA264714(SF), DE031112-01(FMH), KL2TR001874(FCC), 3R01CA255298-01S1(JG), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (CL), R01DK132251 (CL), R01DE031873 (CL), P30DK132710 (CM 및 HN) 및 P30CA013696 (AKR). HN과 CL은 Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award를 수상했습니다. HN은 Fanconi Anemia Research Fund Award를 수상했습니다. FMH는 Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME)와 American Association for Cancer Research Award를 수상했습니다. J.G.는 미국 위장병 학회 (AGA) 상을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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