Zellkulturtechniken und -praktiken zur Vermeidung von Kontaminationen durch Pilze und Bakterien im Forschungszellkulturlabor

Summary

Dieses Protokoll stellt wesentliche Zellkulturtechniken und -praktiken vor, die im Forschungszellkulturlabor angewendet werden sollen, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu vermeiden. Innerhalb der Kategorie der Bakterien wird besonderer Wert auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt.

Abstract

Zellkultur ist eine heikle Fähigkeit, die notwendig ist, um menschliche, tierische und Insektenzellen oder andere Gewebe in einer kontrollierten Umgebung zu züchten. Das Ziel des Protokolls ist es, die richtigen Techniken hervorzuheben, die in einem Forschungslabor verwendet werden, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu verhindern. Besonderer Wert wird auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt, die aufgrund ihrer geringen Größe und Resistenz gegen die meisten Antibiotika, die für die Zellkultur verwendet werden, ein wichtiges Anliegen im Zellkulturraum ist. Dieselben Techniken sorgen für ein kontinuierliches Wachstum und erhalten gesunde Zellen. Sowohl für neue als auch für erfahrene Anwender von Zellkulturen ist es wichtig, sich konsequent an diese Best Practices zu halten, um das Risiko einer Kontamination zu mindern. Einmal im Jahr sollten die Labore die Best Practices für Zellkulturen überprüfen und bei Bedarf eine Diskussion oder zusätzliche Schulungen durchführen. Frühzeitiges Ergreifen von Maßnahmen, um eine Kontamination von vornherein zu verhindern, spart Zeit und Geld im Vergleich zur Reinigung nach einer Kontamination. Universelle Best Practices halten Zellkulturen gesund und reduzieren so die Notwendigkeit, ständig neue Zellen aufzutauen, teure Zellkulturmedien zu kaufen und die Dekontamination und Ausfallzeiten des Inkubators zu reduzieren.

Introduction

Die Zellkultur hat viele Verwendungsmöglichkeiten im Forschungslabor. Seit den Anfängen der Zellkultur im frühen 20. Jahrhundert haben Zelllinien dazu beigetragen, die Wissenschaft voranzubringen. Zelllinien haben mehrere Vorteile; Verschiedene Zelllinien können Forschern helfen, die Zellbiologie zu untersuchen, Baculoviren für weitere Studien zu produzieren oder große Mengen eines Proteins von Interesse zu produzieren, um nur einige zu nennen¹. Zu den weiteren Anwendungen gehören die Untersuchung des Gewebewachstums, die Förderung der Impfstoffentwicklung, die toxikologische Forschung, die Untersuchung der Rolle von Genen in gesunden Organismen und Krankheitsmodellen sowie die Herstellung von Hybridzelllinien ^2,3. Zelllinien können auch die Herstellung von Medikamenten ermöglichen³. Bei der Arbeit mit Zelllinien sind geeignete aseptische Techniken erforderlich. Die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken sind auf Forschungslabore anwendbar, in denen Zellkulturen durchgeführt werden. Andere Laborumgebungen werden nicht diskutiert.

Kontamination ist oft das Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit bezieht sich der Begriff Kontamination im Allgemeinen auf Pilze und Bakterien. Das übergeordnete Ziel der in diesem Dokument beschriebenen Methode besteht darin, die Best Practices zur Vermeidung von Kontaminationen gründlich zu beschreiben. Alle Labormitglieder sollten sich an diese Praktiken halten, wenn sie im Zellkulturraum eines Forschungslabors arbeiten. Labore sollten sicherstellen, dass alle Mitarbeiter aktiv an der Anwendung dieser bewährten Verfahren zur Vermeidung von Kontaminationen beteiligt sind. Das Wissen über die richtigen Praktiken und Techniken trägt dazu bei, dass Zellkulturen lebensfähig, gesund und frei von Verunreinigungen bleiben. Die Entwicklung dieser Technik basiert auf Literaturrecherchen, sieben Jahren Erfahrung in der Arbeit mit Zellkulturen und der Notwendigkeit einer Methode, auf die sowohl Anfänger als auch erfahrene Zellkulturarbeiter jährlich zurückgreifen können.

Es besteht ein Bedarf an einer klaren, standardisierten Technik, der alle Forschungszellkulturlabore folgen sollten. Ein Großteil der Literatur zur Kontamination von Zellkulturen befasst sich mit dem Nachweis von Mykoplasmen, aseptischen Techniken, Kontaminationsquellen, der Beseitigung von Verunreinigungen und der Prävention durch den Einsatz von Antibiotika und regelmäßigen Tests 4,5,6,7,8. Obwohl diese Informationen hilfreich sind, gibt es in der Literatur keine Videos, die die richtigen Zellkulturtechniken demonstrieren, die man befolgen sollte. Der Vorteil der vorgestellten Praktiken gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der Schwerpunkt darauf liegt, eine Kontamination zu verhindern, bevor sie auftritt, anstatt Fehler später zu erkennen und zu korrigieren. Darüber hinaus sind eine gründliche Demonstration aseptischer Techniken, eine Diskussion über die Verhinderung von Pilz- und Bakterienwachstum sowie Informationen über den Luftstrom in Biosicherheitswerkbänken sowohl für Anfänger als auch für erfahrene Zellkulturmitarbeiter wertvoll.

Bakterien und Pilze sind die beiden häufigsten Arten von Verunreinigungen. Innerhalb der Bakterienkategorie sind Mykoplasmen aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Fähigkeit, sich unbemerkt zu vermehren, ein großes Problem. Es handelt sich um sich selbst replizierende Organismen ohne starre Zellwand, die auf eukaryotische Zellen angewiesen sind, um zu wachsen. Sie haben eine reduzierte Stoffwechselfähigkeit und können sich stark vermehren, während sie bei der routinemäßigen visuellen Inspektion von Zellkulturen und der regelmäßigen mikroskopischen Analyse unerkannt bleiben, obwohl die Transmissionselektronenmikroskopie Mykoplasmen nachweisen kann ^9,10. Darüber hinaus können sie mikrobiologische Filter¹⁰ passieren. Zellkulturmedium versorgt Mykoplasmen mit Nährstoffen, obwohl die Ergänzung mit Antibiotika leider keinen Einfluss auf Mykoplasmen^{hat 10}. Es ist zu beachten, dass es im Allgemeinen nicht notwendig ist, Medien mit Antibiotika zu ergänzen. Geeignete Techniken sollten ausreichen, um eine Kontamination in Schach zu halten. Eine Infektion mit Mykoplasmen führt nicht zum sofortigen Zelltod, ist aber für Forscher besorgniserregend, da sie die Reproduzierbarkeit und Qualität der Daten beeinträchtigt.

Das gesamte Laborpersonal sollte sich strikt an gute Zellkulturpraktiken halten. Kulturen sollten nach dem Neukauf, während der Zucht, vor der Kryokonservierung und nach dem Auftauen aus flüssigem Stickstoff auf Mykoplasmen getestet werden ^2,10. Auf dem Markt sind verschiedene Tests erhältlich, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Immunfärbung verwenden. ³ In der Literatur wird darauf hingewiesen, dass "menschliche Isolate einen großen Prozentsatz der in Zellkultur gefundenen Mykoplasmenkontaminanten ausmachen"⁵. Obwohl mehr als 200 Mykoplasmenarten beschrieben wurden, sind etwa sechs davon für die meisten Infektionen verantwortlich. Bei diesen sechs Arten handelt es sich um M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale und Acholeplasma laidlawii¹⁰. Wie bei anderen Arten von Kontaminationen werden diese durch Luft und Aerosole in Zellkulturen eingebracht⁵. Dies wird auch in anderen Arbeiten wiederholt, da der "menschliche Bediener potenziell die größte Gefahr im Labor darstellt^"7. Obwohl dies durch menschliches Versagen geschieht, kann das Risiko eliminiert werden, wenn ein Standardverfahren befolgt wird. Die Ausscheidung des Personals beschränkt sich nicht nur auf die Kontamination mit Mykoplasmen. Zellkulturen in einem Labor sind in der Regel mit denselben Mykoplasmenarten infiziert, was darauf hindeutet, dass sich die Kontamination aufgrund unsachgemäßer Zellkulturtechniken von einem Kolben zum anderen ausbreitet¹⁰.

Die Vermeidung von Kreuzkontaminationen ist auch ein weiterer Grund, warum geeignete Zellkulturtechniken befolgt werden sollten. Es wird darauf hingewiesen, dass mindestens 15 % bis 18 % der Zelllinien weltweit kreuzkontaminiert oder falsch identifiziert sein können^11,12. Neben der Untersuchung von Zelllinien auf Mykoplasmenkontamination sollten sie auch auf Kreuzkontamination getestet werden¹⁰. Für menschliche Zelllinien ist die Zelllinienauthentifizierung durch eine kostengünstige DNA-basierte Technik, die als Short Tandem Repeat (STR)-Profiling bezeichnet wird, der aktuelle internationale Referenzstandard, da es eine einfache Möglichkeit ist, die Identität der Zelllinie zu bestätigen 2,10,13,14. Die STR kann falsch markierte oder kreuzkontaminierte Zelllinien identifizieren, aber keinen falschen Gewebeursprung^{nachweisen 10,13,14}. Die Aussagekraft von Forschungsdaten kann beeinträchtigt werden, wenn Zelllinien falsch markiert, falsch identifiziert oder kontaminiert werden¹³. Ähnlich wie bei anderen Arten von Kontaminationen kann eine Kreuzkontamination aufgrund einer schlechten Technik auftreten, die zur Ausbreitung von Aerosolen führt, eines irrtümlichen Kontakts, der dazu führt, dass der falsche Zelltyp in einen Kolben gelangt, oder der Verwendung derselben Medienflasche und derselben Reagenzien mit unterschiedlichen Zelllinien¹⁰. Es sollte keine gemeinsame Nutzung von Medienflaschen erfolgen. Durch die gemeinsame Nutzung einer Flasche Medium zwischen zwei verschiedenen Zelllinien können diese Zellpopulationen gemischt werden, was dazu führt, dass der schneller wachsende Zelltyp den Kolben vollständig übernimmt. Dieser Austausch ist nicht wahrnehmbar und führt zu falscher Etikettierung und falscher Identifizierung². Eine Zelllinie kann auch mit einer anderen verwechselt werden, wenn Kulturen während der Handhabung oder Markierung^{verwechselt werden 10}. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, Reagenzien, Medien und Kolben getrennt voneinander aufzubewahren. Jedes Labormitglied sollte seine eigenen Medienflaschen haben. Es sollte keine Freigabe zwischen Lab-Mitgliedern erfolgen. Die Zelllinien selbst sollten von einer qualifizierten Mobilfunkbank und einem qualifizierten Anbieter erworben werden. Labore sollten keine Zellen gemeinsam nutzen. Studien zeigen, dass, obwohl STR- und Mykoplasmentests regelmäßig verwendet werden, in vielen Forschungsarbeiten in der Literatur bereits falsch identifizierte oder kontaminierte Zelllinien verwendet wurden¹⁵. Es ist umständlich, die Recherchen zu durchforsten, um diese problematischen Papiere zu finden und die Leser nachträglich über dieses Thema zu informieren. Prävention ist der beste Weg, um sicherzustellen, dass dieses Problem gar nicht erst auftritt.

Das einfache Besprühen von Gegenständen mit 70 % EtOH kann Organismen abtöten. 70 % EtOH wirkt, indem es Proteine denaturiert und Lipide in den am häufigsten kontaminierenden Organismen, einschließlich Bakterien und Pilzen, auflöst¹⁶. Studien haben gezeigt, dass 70 % die effektivste Konzentration ist; Oberflächenproteine koagulieren nicht schnell mit 70% EtOH, so dass sie in die Zelle eindringen können, während das darin enthaltene Wasser für den Denaturierungsprozess von Proteinen notwendig ist. Aufgrund des Konzentrationsunterschieds von Wasser und Alkohol auf beiden Seiten der Zellwand gelangen 70 % EtOH in die Zelle, um sowohl enzymatische als auch Strukturproteine zu denaturieren. Wenn Schimmelbildung in Kolben beobachtet wird, muss der gesamte Inkubator dekontaminiert werden, indem er zunächst mit 70 % EtOH besprüht und trocken gewischt wird, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubationszeit über Nacht bei 60 °C¹⁷. Dies tötet die meisten Schimmelpilze und Bakterien ab.

Der Hauptvorteil von Präventionspraktiken gegenüber alternativen Techniken zur Beseitigung von Kontaminationen im Nachhinein besteht darin, dass Labormitarbeiter durch die frühzeitige Verhinderung von Kontaminationen sicher sein können, dass ihre Zellkulturen gesund sind und keine hohen Kosten mit der Dekontamination von Inkubatoren oder der Entsorgung von Zellkulturen verbunden sind. Die Eliminierung von Mykoplasmenkontaminanten ist z. B. danach nicht effizient⁷. Wenn Sie sich frühzeitig die Zeit nehmen, um sicherzustellen, dass das Laborpersonal richtig geschult ist, der Zellkulturraum in sich geschlossen ist und ein Standardverfahren verwendet wird, sparen Sie Zeit und Geld.

Protocol

1. Vorbereitungen

1. Allgemein
   1. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel, der nur im Zellkulturraum und nicht in anderen Teilen des Labors getragen werden darf.
      HINWEIS: Der Laborkittel muss nicht steril sein.
   2. Tragen Sie neue Handschuhe, die keine anderen Oberflächen berührt haben. Achten Sie darauf, dass die Handschuhe fest sitzen. Puderfreie Nitrilhandschuhe sind am besten.
      Anmerkungen: Die Handschuhe müssen nicht steril sein.
   3. Um sich auf die Arbeit vorzubereiten, sprühen Sie die Handschuhe, die Ärmel des Laborkittels und das Innere der biologischen Sicherheitswerkbank mit 70 % EtOH ein. Wischen Sie die Arbeitsfläche und die Glasscheibe mit einem fusselfreien Papiertuch trocken.
      HINWEIS: Die Verwendung von 70 % EtOH tötet Bakterien mit der höchsten Effizienz^{ab 16}. Das Papiertuch muss nicht steril sein.
   4. Halten Sie Wasserbäder im Zellkulturraum und verwenden Sie diese nur zum Erwärmen von Nährmedien oder zum Auftauen von Zellen. Entleeren und waschen Sie die Wasserbäder einmal pro Woche gemäß den Reinigungsanweisungen des Herstellers.
2. Im Inneren der biologischen Sicherheitswerkbank
   1. Begrenzen Sie die Anzahl der Gegenstände, die in den Schrank gebracht werden. Unterbrechen Sie den Luftstrom in der biologischen Sicherheitswerkbank nicht, indem Sie die vorderen oder hinteren Gitter blockieren.
      Anmerkungen: In Abbildung 1 wird erläutert, wie Luft in einem Schrank strömt.
   2. Sprühen Sie alle Gegenstände im Schrank mit 70 % EtOH ein und wischen Sie sie trocken. Beginnen Sie damit, die Oberseite der Medienflasche zu besprühen und sich nach unten zu arbeiten. Wischen Sie es in ähnlicher Weise mit einem sauberen Papiertuch trocken und arbeiten Sie sich nach und nach nach nach unten. Gehen Sie nicht wieder nach oben in Richtung der Kappe.
   3. Wenn der Schrank groß genug ist, um serologische Pipetten aufzunehmen, können sie im Inneren platziert werden, andernfalls können sie in einem Behälter aufbewahrt werden, der an der Außenseite des Schranks montiert ist. Überprüfen Sie vor der Verwendung beide Seiten der umhüllten Pipette auf Löcher, Risse oder Einstiche in der Verpackung. Reißen Sie die Verpackung nicht ab. Schälen Sie stattdessen vorsichtig die Enden der Verpackung, führen Sie die serologische Pipette in eine Pipettenhilfe ein und entfernen Sie die Hülle in einer fließenden Bewegung.
   4. Bewegen Sie den Mauszeiger nicht über geöffnete Flaschen oder Flaschen; Greifen Sie über offene Flaschen oder Flaschen oder öffnen Sie Gegenstände über bereits geöffnete Gegenstände in der biologischen Sicherheitswerkbank.
      Anmerkungen: Der Luftstrom im Inneren des Gehäuses drückt auf die Arbeitsfläche, so dass z. B. Verunreinigungen auf der Hülse in die Zellkulturen gelangen können.
   5. Gießen Sie keine Flüssigkeiten ein. Fügen Sie sie stattdessen mit einer serologischen Pipette hinzu. Nachdem Sie das Medium ergänzt haben, mischen Sie den Inhalt gründlich und initialisieren Sie die Flasche. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie ein Etikett für das beifügen, womit das Medium ergänzt wurde.

2. Arbeiten mit adhärenten Zelllinien

1. Wenn eine Plastikflasche benötigt wird, sprühen Sie den gesamten Beutel ein und legen Sie ihn in den Schrank.
2. Verwenden Sie autoklavierte Glaspipetten oder sterile Einwegpipetten aus Kunststoff, um die Medien oder Waschlösungen anzusaugen. Entfernen Sie vorsichtig die Metallkappe vom Vorratsbehälter. Isolieren Sie eine Glaspipette, indem Sie den Behälter vorsichtig schräg schütteln. Wenn Sie in den Behälter greifen, vermeiden Sie es, andere Pipetten zu berühren.
   Anmerkungen: Fassen Sie die gewählte Pipette nur von einem Ende aus an.
3. Setzen Sie die Verschlüsse der Flaschen so schnell wie möglich wieder auf. Legen Sie die Kappen verkehrt herum auf die Arbeitsfläche, so dass der Rand die Arbeitsfläche nicht berührt. Fassen Sie die Kappe nicht von oben oder unten; Berühren Sie stattdessen die Kappen von den Seiten.
4. Verwenden Sie zum Absaugen von Flüssigkeiten einen Vakuumkolben, der sich außerhalb des Schranks in einem sekundären Behälter auf dem Boden befindet.
   Anmerkungen: Werfen Sie keine flüssigen Abfälle in Säcke für biologisch gefährliche Abfälle, da die Beutel undicht werden. Bei der Arbeit im Schrank entsteht Abfall. Wenn Sie die Hände zu oft in den Schrank hinein- und herausbewegen, wird der Luftstrom unterbrochen. Lassen Sie alle Abfälle vorübergehend im Schrank. Legen Sie es zur Seite, damit es die Arbeit nicht unterbricht.
5. Besprühen Sie die Handschuhe großzügig mit 70 % EtOH, wenn sie trocken sind. Reiben Sie die Hände aneinander, damit die Handschuhe nicht tropfnass sind.
6. Wenn eine serologische Pipette versehentlich etwas im Schrank berührt, zögern Sie nicht, sie wegzuwerfen. Beginnen Sie von vorne mit einer sauberen serologischen Pipette, anstatt eine zu verwenden, die möglicherweise kontaminiert ist.

4. Zellen prüfen und lagern

1. Bevor Sie die Zellen in den Inkubator legen, überprüfen Sie, wie sie unter dem Mikroskop aussehen. Wenn die Zellen gründlich suspendiert wurden, sollten einzelne Zellen beobachtet werden.
2. Sprechen Sie nicht, niesen, husten Sie nicht und atmen Sie nicht schwer in die Inkubatoren. Öffnen und schließen Sie schnell die Türen des Inkubators. Wenn Sie die Türen länger als nötig offen lassen, können in der Luft vorhandene Verunreinigungen in die Inkubatoren gelangen.
   HINWEIS: Das Tragen einer Maske während der Arbeit im Zellkulturraum kann helfen, da Mykoplasmen im menschlichen Mund vorhanden sein können. Vermeiden Sie die Verwendung von Mobiltelefonen im Zellkulturraum, da das Sprechen nicht empfohlen wird.
3. Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse aller Flaschen fest verschlossen sind, bevor Sie die Flaschen aus dem Schrank nehmen.
4. Lagern Sie Zellkulturmedien bei Nichtgebrauch im Dunkeln bei 4 °C, da sie lichtempfindlich sind.
5. Besprühen Sie das Innere des Schranks nach Abschluss der Zellkulturarbeit erneut mit 70 % EtOH und wischen Sie die Oberfläche mit einem Papiertuch trocken. Leeren Sie die Abfallsäcke für biologisch gefährliche Abfälle. Wiederholen Sie diesen Vorgang und tauschen Sie die Handschuhe aus, wenn Sie zu einer anderen Zelllinie wechseln.

5. Arbeiten mit Suspensionszelllinien

1. Stellen Sie bei Suspensionszellen, die in Glaskolben gezüchtet wurden, sicher, dass die Handschuhe gründlich mit 70 % EtOH besprüht werden, berühren Sie dann die Aluminiumfolie mit den nassen Handschuhen und besprühen Sie nur den Boden des Kolbens, bevor Sie ihn in den Schrank stellen.
2. Wenn Sie eine Probe für die Zellzählung entnehmen, nehmen Sie nur ein 1,5-ml-Röhrchen aus dem Behälter. Berühren Sie keine anderen Röhren. Legen Sie die Kappe verkehrt herum auf die Arbeitsfläche. Berühren Sie nicht die innere Felge. Behandeln Sie es vorsichtig von den Seiten und ersetzen Sie es, wenn Sie fertig sind.
3. Entfernen Sie vorsichtig das doppelt gefaltete Stück Alufolie, das den gesamten Flaschenhals bedeckt. Fassen Sie den Glaskolben nur von unten an – berühren Sie ihn nicht vom Hals aus – sobald die Folie entfernt ist. Verwenden Sie eine serologische 1-ml-Pipette, um eine Probe für die Zellzählung zu entnehmen.
4. Lassen Sie das Medium nicht an der Seite der Kolben heruntertropfen. Wenn dies der Fall ist, sprühen Sie ein Papiertuch mit 70 % EtOH ein und reinigen Sie es sofort.
5. Stellen Sie sicher, dass Verschlüsse und Aluminiumfolie festgezogen sind, bevor Sie Flaschen oder Flaschen aus den biologischen Sicherheitswerkbänken entfernen.

6. Inkubation der Zellen

1. Verwenden Sie separate Inkubatoren für verschiedene Zelltypen, um eine Kreuzkontamination der verschiedenen Zelltypen zu verhindern.

7. Sammlung von flüssigen Abfällen

1. Sammeln Sie flüssige Abfälle in einem Vakuumkolben, der sich außerhalb des Schranks auf dem Boden befindet, in einem Sekundärbehälter mit der Aufschrift "Abfall".
   Anmerkungen: Der Schlauch ist an einen HEPA-Filter (High Efficiency Particulate Absorbing) angeschlossen, der monatlich ausgetauscht wird.

8. Aufräumen

1. Entfernen Sie den Abfallsack und waschen Sie die Glasflaschen so schnell wie möglich. Führen Sie ein Gläserspülprotokoll an der Spüle. Siehe Ergänzungsdatei 1 für das Waschprotokoll.
2. Autoklavieren Sie die Zellkulturgläser, anstatt sie an eine Glaswaschanlage zu schicken. Bewahren Sie es getrennt von Glaswaren im Hauptbereich des Labors auf.
   Anmerkungen: SF-9-Zellen hinterlassen einen Rand abgestorbener Zellen an der Seite der Kolben, wenn das Glas nicht gut geschrubbt wird. Siehe Ergänzungsdatei 1 für das Autoklavenprotokoll.

9. Organisation

1. Organisieren Sie den Zellkulturraum so, dass sich alle Vorräte in einem Bereich befinden, wodurch die Notwendigkeit für Labormitglieder, den Raum auf der Suche nach Vorräten zu verlassen, minimiert wird.
2. Kennzeichnen Sie alle Plastikflaschen, die zur Entnahme von Zellen verwendet und anschließend in der Zellkultur wiederverwendet werden, als "Nur zur Verwendung in Zellkulturen". Verwenden Sie die dafür vorgesehenen Zellkulturflaschen für einen bestimmten Zelltyp. Bewahren Sie die Flaschen im Zellkulturraum auf, damit sie leicht zugänglich sind.

10. Identifizierung von Bakterien-, Pilz- und Mykoplasmenkontamination

HINWEIS: Die Nichtbeachtung des oben genannten Arbeitsablaufs kann zu einer Kontamination mit Bakterien, Pilzen und Mykoplasmen führen.

1. Achten Sie immer vor Beginn der Arbeit auf starke Trübung, zusätzliches Wachstum in Form von Fuzzy-Kugeln und dichte Zellansammlungen an der Seite, die alle Indikatoren für eine Kontamination sind.
   HINWEIS: Ein erfahrenes Auge kann den Unterschied zwischen der durch mikrobielle Kontamination verursachten Trübung und der tatsächlichen Zelle erkennen. Während die Zellen das normalerweise klare Medium trüb erscheinen lassen, verursacht die bakterielle Kontamination eine starke Trübung mit weißer Farbe.
   1. Identifizieren Sie Schimmelpilzverunreinigungen visuell, indem Sie das Auftreten von runden, unscharfen Kugeln bemerken, die im Medium schweben (siehe Abbildung 2).
   2. Erkennen Sie eine bakterielle Kontamination visuell, wenn das Medium trüb, weiß oder turbulent ist (siehe Abbildung 2).
   3. Identifizieren Sie eine Mykoplasmenkontamination, indem Sie einen monatlichen Mykoplasmentest durchführen. Ein PCR-basierter Test weist die Benutzer an, eine 1,5-ml-Zellprobe zu entnehmen, eine Zellzählung mit 10 μl durchzuführen, auf 0,08 x 10⁶ Zellen/ml zu verdünnen, die Zellen herunterzudrehen, die Zellen mit dem im Kit enthaltenen Puffer zu lysieren und ein letztes Mal herunterzufahren. Der Überstand wird mit Primern inkubiert, die eine Reihe von Mykoplasmenarten amplifizieren. Führen Sie ein DNA-Gel durch, um die Banden zu visualisieren. Keine Banden bedeuten, dass Mykoplasmen nicht identifiziert sind.
      Anmerkungen: Diese Hauptverunreinigung kann im menschlichen Mund vorhanden sein. Es hat sich bewährt, Zellen nach dem Auftauen und vor der Verwendung für Experimente auf Mykoplasmenkontamination zu testen. Kontrollieren Sie die Zellen anschließend einmal im Monat auf Mykoplasmenkontamination. Viele Unternehmen bieten Mykoplasmen-Testkits an. Wählen Sie eine aus, die geeignet ist.

Representative Results

Wenn die in diesem Artikel beschriebenen Zellkulturtechniken und -praktiken nicht befolgt werden, kann es im Forschungszellkulturlabor zu einer Kontamination durch Pilze und Bakterien kommen. Abbildung 2 zeigt Kolben mit Verunreinigungen sowohl in der Suspensions- als auch in der adhärenten Kultur.

Wenn keine aseptischen Techniken befolgt werden, kann es 2–3 Tage später zu einer Schimmelpilzkontamination kommen. Runde, unscharfe Kugeln, die im Medium schweben, sind in Suspensionszellen wahrnehmbar, während Schimmelwachstum in anhaftenden Zellen als große, unregelmäßige, weiße oder grüne Flecken beobachtet werden kann.

Bei Bakterien wird eine Kontamination am nächsten Tag beobachtet. Die Medien sind turbulent, weiß und trübe. Die weiße Farbe ist typisch für Bakterienzellen, die sich viel schneller vermehren als Zelllinien. Ein geübtes Auge ist in der Lage, den Unterschied zwischen nicht kontaminierten Medien und kontaminierten Medien zu erkennen. Bei angehängten Zellen kann man eine Flasche mit ungeöffnetem Medium mit einem Kolben vergleichen, um zu prüfen, ob Turbulenzen im Kolben zu sehen sind.

In der biologischen Sicherheitswerkbank sollte die Anzahl der Gegenstände so gering wie möglich gehalten werden. Vermeiden Sie es, Gegenstände auf die hinteren und vorderen Grills zu legen (siehe Abbildung 3). In diesem Schrank befinden sich ein Satz Pipetten, Spitzen, autoklavierte Glaspipetten, eine Pipettenhilfe und Markierungen. Der Arbeitsbereich in der Mitte ist frei. Es ist eine gute Idee, Schränke auf diese Weise zu organisieren. Darüber hinaus sollte der Bediener einen sauberen Laborkittel und Handschuhe tragen, bevor er mit der Arbeit beginnt. Eine Sprühflasche mit 70 % EtOH sollte in der Nähe aufbewahrt werden, damit der Bediener seine Handschuhe häufig einsprühen kann. Die Haut wird mit Handschuhen oder einem Laborkittel bedeckt. Der Bediener sollte seinen Stuhl so einstellen, dass seine Arme bei der Arbeit im Schrank in einem 90°-Winkel stehen und Gegenstände im Schrank leicht erreichbar sein sollten (siehe Abbildung 4).

Viele Arten von Mykoplasmen können mit einem PCR-basierten Assay zuverlässig identifiziert werden. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse eines negativen Mykoplasmentests. Die Bande auf der linken Seite zeigt die Molekulargewichtsstandards für DNA. Die vier Bänder auf der rechten Seite sind Positivkontrollen. Unter den getesteten Zelltypen treten keine Banden auf, da keine Mykoplasmen nachgewiesen wurden.

Wenn das Medium pH-Indikatoren enthält, ist es rot für den optimalen pH-Wert der Zellen bei 7,4. Sobald die Zellen wachsen, ändert sich die Farbe des Mediums von Rot zu Gelb³. Diese Farbveränderung kann auch auftreten, wenn Bakterien den Kolben übernehmen und überwuchern (Abbildung 6). Die gelbe Farbe zeigt an, dass der pH-Wert niedrig ist. Die Beobachtung einer neuen, ungeöffneten Flasche mit Medien neben einem Kolben ist eine objektive Möglichkeit, die Kontamination in den angeschlossenen Zellen zu beobachten. Bei Suspensionskulturen kann der Anwender den Kolben genau beobachten, ob Wucherungen im Medium schwimmen oder ob ein dicker Ring aus überwucherten Bakterienzellen um das Innere des Glaskolbens vorhanden ist. Für beide Zelltypen kann eine kleine Probe entnommen und unter dem Mikroskop beobachtet werden. Wenn andere Wucherungen oder Zellformen beobachtet werden, insbesondere wenn sich die Zellen bewegen, ist dies ein Indikator für eine Kontamination (Abbildung 7). Vor der Zellzählung sollte eine gründliche Reinigung des Hämozytometers durchgeführt werden, da diese Art von Trümmern möglicherweise nur auf dem Hämozytometer und nicht in den Zellkulturen selbst vorhanden ist.

Der Geruch kann ein weiterer Indikator für eine Kontamination in einem Inkubator sein. Bakterienüberwucherung hat einen typischen Geruch, den ein erfahrener Zellkulturanwender bemerken wird. Der Geruch stimmt immer mit einem kontaminierten Kolben überein, obwohl ein infizierter Kolben nicht immer den gesamten Inkubator riechen lässt.

Schimmelpilzbefall tritt tendenziell häufiger bei HEK 293 S-Zellen auf, die in Suspension gezüchtet wurden. Eine bakterielle Kontamination tritt häufiger in SF-9-Zellen auf. Dies kann daran liegen, dass RIC-Zellen mit Feuchtigkeit gezüchtet werden, was zu einer Feuchtigkeitsansammlung in den Inkubatoren führt. SF-9-Zellen werden ohne Feuchtigkeit gezüchtet, so dass die Umgebung trockener ist. Die Kontaminationsrate in adhärenten Kulturen ist geringer als die Kontaminationsrate in Suspensionskulturen. Dies kann an der kleineren Kolbengröße, der Einweghaltigkeit des Kolbens oder der belüfteten Kappe anstelle der Verwendung von Aluminiumfolie liegen.

Mykoplasmen können weder mit bloßem Auge noch mit einem normalen Lichtmikroskop beobachtet werden, obwohl eine spezielle Transmissionselektronenmikroskopie Mykoplasmen nachweisen kann. Ein Mykoplasmen-Bestimmungskit sollte verwendet werden, um die Zellkulturen monatlich zu testen. Viele Arten von Mykoplasmen können mit einem PCR-basierten Assay zuverlässig identifiziert werden. Eine kurze Beschreibung, wie dieser PCR-Test durchgeführt wird, finden Sie im Abschnitt Protokoll, und weitere Informationen zu Mykoplasmen finden Sie im Abschnitt Diskussion.

Abbildung 1: Luftströmung in einer Biosicherheitswerkbank. Biologische Sicherheitswerkbänke saugen kontaminierte Luft aus dem Raum selbst und aus dem Schrank durch die vorderen und hinteren Gitter. Diese Luft strömt unter die Metallarbeitsfläche, zur Rückseite des Schranks und nach oben zum Gerät, wo sich ein HEPA-Filter befindet. Dort strömt die Luft durch den Filter und wird gefiltert. Diese saubere Luft drückt auf die Arbeitsfläche. Aufgrund der Art und Weise, wie der gefilterte Luftstrom im Schrank nach unten gedrückt wird, empfiehlt es sich, nicht zu schweben. Zum Beispiel ist es unerwünscht, eine Hülse auf einer offenen Flasche zu haben und zu riskieren, dass potenzielle Verunreinigungen in das Medium gedrückt werden. Die Anzahl der Gegenstände, die in den Schrank gebracht werden, sollte auf ein Minimum beschränkt werden, und die Gegenstände sollten nicht auf die vorderen oder hinteren Gitter gelegt werden, um den Luftstrom nicht zu unterbrechen. Ein zu schnelles Ein- und Ausfahren der Arme aus dem Schrank kann ebenfalls den Luftstrom stören. Erstellt für NuAire, Inc., von Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Verwendung mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Nicht kontaminierte Suspensions- und adhärente Zellen sowie Zellen, die mit Schimmelpilzen oder Bakterien kontaminiert sind. Das erste Bild links enthält Insektenzellen (SF-9-Zellen), die nicht kontaminiert sind. Das zweite Bild zeigt einen weiteren Kolben mit diesen Zellen, die mit Schimmel kontaminiert sind. Der dritte Kolben war mit Bakterien verunreinigt, wie man an dem dicken, weißen, trüben Aussehen erkennen kann. Der zweite und dritte Kolben waren kontaminiert, weil keine der richtigen Zellkulturtechniken und -praktiken befolgt wurden. Alle Kolben wurden noch am selben Tag vorbereitet. Das Wachstum wurde am nächsten Tag bei bakterieller Kontamination und 2 Tage später bei Schimmelpilzbefall beobachtet. Es werden nicht kontaminierte adhärente Zellen (Hek293-Zellen) zusammen mit Schimmelpilz- und Bakterienkontaminationen in adhärenten Kulturen gezeigt. Schimmelpilzbefall wird in der zweiten Zeile in einer runden Petrischale dargestellt. Das Foto wurde von der Oberseite der Schüssel aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Organisation des Zellkulturschranks. In der biologischen Sicherheitswerkbank sollte die Menge der Gegenstände so gering wie möglich gehalten werden. Das Ablegen von Gegenständen auf die hinteren und vorderen Grills sollte vermieden werden. In diesem Schrank befinden sich ein Satz Pipetten, Spitzen, autoklavierte Glaspipetten, eine Pipettenhilfe und Markierungen. Der Arbeitsbereich in der Mitte ist frei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Die richtige Arbeitsweise eines Bedieners unter der Strömungshaube. Ein Bediener sollte einen sauberen Laborkittel und Handschuhe tragen, bevor er mit der Arbeit beginnt. Eine Sprühflasche mit 70 % EtOH sollte in der Nähe aufbewahrt werden, damit der Bediener seine Handschuhe häufig einsprühen kann. Die Haut wird von den Handschuhen oder dem Laborkittel bedeckt. Der Bediener sollte seinen Stuhl so einstellen, dass seine Arme in einem 90°-Winkel stehen, wenn er im Schrank arbeitet. Gegenstände sollten im Schrank leicht erreichbar sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Ein negatives Mykoplasmen-Testergebnis. Viele Arten von Mykoplasmen können mit einem PCR-basierten Assay zuverlässig identifiziert werden. Die Bande auf der linken Seite zeigt die Molekulargewichtsstandards für DNA. Die vier Bänder auf der rechten Seite sind Positivkontrollen. Unter den getesteten Zelltypen treten keine Banden auf, da keine Mykoplasmen nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Normaler Farbwechsel des Mediums von Rot zu Gelb. Zellkulturmedien verfärben sich von rot zu gelb, wenn pH-Indikatoren vorhanden sind. Die gelbe Farbe zeigt an, dass der pH-Wert niedrig ist und das Medium ausgetauscht werden sollte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Beobachtung von Verunreinigungen unter dem Lichtmikroskop. Wenn bei der Zellzählung andere Wucherungen oder Zellformen unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden, kann dies ein Indikator für eine Kontamination sein. Es ist zu beachten, dass vor der Zellzählung eine gründliche Reinigung des Hämozytometers durchgeführt werden sollte, da diese Art von Trümmern möglicherweise nur auf dem Hämozytometer und nicht in den Zellkulturen selbst vorhanden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsdatei 1: Anhang Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Während die Kontamination eines der Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten ist, werden die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken dazu beitragen, die Risiken zu mindern. Zu den kritischen Schritten gehören das Tragen eines sauberen Laborkittels, der nur im Zellkulturraum verwendet wird, die Verwendung sauberer, puderfreier Handschuhe, die häufig mit 70 % EtOH besprüht werden und beim Wechsel zwischen den Zelllinien gewechselt werden, die Ermutigung jedes Einzelnen, Medienflaschen nicht zu teilen, die gründliche Reinigung des Schranks vor und nach Beendigung der Arbeit, Das saubere Auspacken von serologischen Pipetten, das Vermeiden eines längeren engen Kontakts mit offenen Flaschen oder Kolben, das Nichtteilen von Medienflaschen zwischen mehreren Zelllinien und das schnelle Öffnen und Schließen von Inkubatortüren. Darüber hinaus gewährleistet das Waschen und Autoklavieren der eigenen Glaswaren die Qualitätskontrolle, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Verunreinigungen von außen eingeführt werden. Zu den Methoden der Qualitätskontrolle gehören die Verwendung von Autoklavenband, um anzuzeigen, ob der Sterilisator die richtige Temperatur von 121 °C erreicht hat, die regelmäßige vorbeugende Wartung des Geräts und die visuelle Inspektion des Kolbens, um sicherzustellen, dass er ordnungsgemäß geschrubbt wurde¹⁸. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Verwendung separater Inkubatoren für verschiedene Zelltypen, um sicherzustellen, dass Kontaminationen von einem Zelltyp nicht auf andere übertragen werden und auch um sicherzustellen, dass es nicht zu Kreuzkontaminationen mit Zellen kommt.

Bakterielle und Pilzinfektionen sind die beiden häufigsten Eindringlinge in Zellkulturen. Einer der Hauptkontaminanten, M. orale, ist die häufigste Mykoplasmenspezies im menschlichen Mund und stellt auch "das häufigste Isolat dar, das 20 % bis 40 % aller Mykoplasmeninfektionen in Zellkulturen ausmacht"⁴. Mit anderen Worten, das Laborpersonal ist die Hauptquelle dieser Kontamination. Im Zellkulturraum ist dies immer ein Problem, da Mykoplasmen ein kleiner, langsam wachsender Mikroorganismus sind, dem eine starre Zellwand fehlt, der 0,45-μm-Filter passieren kann⁴. Studien zeigen, dass die Inzidenz einer Mykoplasmenkontamination bei 15 % bis 35 % kontinuierlicher menschlicher oder tierischer Zelllinien liegt⁴. Darüber hinaus zeigen Statistiken, dass etwa 5 % bis 30 % der weltweiten Zelllinien mit Mykoplasmen kontaminiert sind⁶. Leider sind Mykoplasmen resistent gegen die meisten Antibiotika, die für die Zellkultur verwendet werden, und eine Infektion kann die Zellphysiologie und den Stoffwechsel beeinträchtigen ^4,6. Obwohl die Kontamination den Zellstoffwechsel nicht verlangsamt, kann sie das Endprodukt kontaminieren⁶. Infektionen können bestehen bleiben, ohne dass die Labormitglieder Zellschäden bemerken. Wenn es zu einer Kontamination kommt, sind die Kosten für das Auftauen neuer Zellen, die Zeit, die für die Vermehrung der neuen Kulturen aufgewendet wird, die teuren Medien, die verschwendet wurden, die Dekontamination von Inkubatoren und die Zeit, die die Kollegen damit verbringen, darauf zu warten, dass ihre Experimente wieder aufgenommen werden, enorm. Unser Labor schätzt, dass die Gesamtverlustzeit 2 Wochen beträgt und die Gesamtkosten im Zusammenhang mit der Kontamination einer typischen Proteinexpression von 8 l menschlicher Säugetierzellen 1.400 US-Dollar betragen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken bieten gute vorbeugende Maßnahmen, um zusätzliche Kosten, Zellverluste und Ausfallzeiten zu minimieren.

Änderungen dieser Praktiken werden nicht empfohlen. Alle Labormitglieder sollten vor der Arbeit im Zellkulturraum geschult werden und dann jedes Jahr eine Auffrischungsschulung erhalten⁷. Labormitglieder sollten den Zellkulturraum auch so organisieren, dass sich alle erforderlichen Vorräte in einem Bereich befinden, wodurch die Notwendigkeit für Labormitglieder, den Zellkulturraum auf der Suche nach Vorräten zu verlassen, minimiert wird.

Einschränkungen der vorgestellten Techniken werden beobachtet, wenn die Kontamination aus externen Quellen wie Serum, Inkubatoren, defekten Autoklaven, verschmutzten Laborkitteln oder der Quelle der Zellen stammt. Eine Fehlersuche bei der Technik kann erforderlich sein, wenn es trotz strikter Einhaltung dieses Protokolls zu einer Kontamination kommt. Viele äußere Faktoren können zu dieser Art von Kontamination beitragen. Labormitglieder müssen umsichtig sein und externe Quellen überprüfen. Zum Beispiel kann die vom Lieferanten gekaufte Partie des fötalen Kälberserums (FBS) mit Mykoplasmen kontaminiert gewesen sein. Im Vergleich zu den 1950er Jahren ist dies heute ein seltenes Ereignis, aber es kann immer noch passieren⁶. Alle Medienflaschen sollten weggeworfen werden, wenn eine Kontamination festgestellt wird, und das Protokoll durch Auftauen neuer Zellen und Verwendung neuer Medien neu gestartet werden. Die Kontamination kann bereits im Inkubator vorhanden gewesen sein, wenn es sich um Schimmel oder Bakterien handelt. Die anderen Kolben im selben Inkubator sollten überprüft werden, um festzustellen, ob Bakterien- oder Schimmelwachstum beobachtet wird. Alle kontaminierten Kolben sollten weggeworfen und der Inkubator dekontaminiert werden. Wenn keine Verunreinigung festgestellt wird, sollte der Autoklav auf Fehlfunktionen überprüft werden. Es kann sein, dass die Glaswaren von vornherein nicht richtig autoklaviert wurden. Das Autoklavenband kann seine Farbe ändern, obwohl der Autoklav keine 121 °C erreicht. Danach sollte das Verfallsdatum der verwendeten Antibiotikalösungen überprüft werden. Möglicherweise müssen neue Lösungen angeschafft werden. Schließlich sollte die Quelle der Zellen berücksichtigt werden; Stammen sie von einem vertrauenswürdigen Laborlieferanten oder wurden sie von einem anderen Labor ausgeliehen? Zellen sollten immer von einem vertrauenswürdigen Laborlieferanten gekauft und niemals von einem anderen Labor ausgeliehen werden. Schließlich sollten Laborkittel gewaschen werden, um ihre Sauberkeit zu gewährleisten¹⁹. Die Dekontamination von Inkubatoren sollte immer dann in Betracht gezogen werden, wenn ein Kolben kontaminiert wurde. Bakterienzellen oder Schimmelpilzsporen dürfen sich nicht vermehren und Verunreinigungen weiter verbreiten.

Bestehende Methoden reflektieren die Beseitigung von Kontaminationen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden konzentrieren sich eher auf die Prävention als auf die Beseitigung von Kontaminationen. Es gibt mehrere Verfahren zur Verwendung von Antibiotika zur Entfernung von Mycoplasma²⁰. Der Einsatz von Antibiotika ist jedoch riskant, da sie die Infektion möglicherweise nicht vollständig beseitigen und "die Entwicklung resistenter Organismen ermöglichen können"¹². Tatsächlich erwiesen sich "72 % der Kulturen, die kontinuierlich in Antibiotika gezüchtet wurden, als Mykoplasmen-positiv, während nur 7 %, die ohne Antibiotika gezüchtet wurden, infiziert waren"¹². Diese Daten unterstreichen die Idee, dass der Einsatz von Antibiotika zwar empfohlen wird und hilfreich sein kann, ein übermäßiger Gebrauch oder eine vollständige Abhängigkeit von Antibiotika jedoch nicht von Vorteil ist. Darüber hinaus kann die Verwendung von Antibiotika zur Entfernung von Verunreinigungen nur dazu führen, dass das Problem bestehen bleibt. Antibiotika-Lösungen sind nicht notwendig; Wenn die in diesem Artikel beschriebenen Techniken befolgt werden, sollte eine Kontamination erfolgreich verhindert werden.

Die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken können in Zukunft verwendet werden, um eine aseptische Umgebung bei der Durchführung des monatlichen Mykoplasmentests und bei der Herstellung hausgemachter kompetenter Bakterienzellen aufrechtzuerhalten. Beide Protokolle erfordern eine saubere Umgebung, ähnlich wie bei der Arbeit in der Zellkultur, damit das Endprodukt nicht kontaminiert wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques