Name: Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez une méthode de complémentation GFP pour visualiser les contacts cellule-cellule médiés par les cytonèmes dans les disques imaginaux d'aile de Drosophila. Cette technique permet d'étudier la communication cellulaire en temps réel.

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Le pilote nubbin-GAL4 est utilisé pour exprimer CD4-spGFP1-10 spécifiquement dans la région de la poche d’aile du DP (Figure 1A). Le pilote PerM-LexA21 est utilisé pour exprimer CD4-spGFP11 spécifiquement dans le PerM (Figure 1A). Ces deux systèmes d’expression sont indépendants l’un de l’autre, permettant l’expression simultanée et spécifique de différents transgènes dans DP et PerM (Figure 1B,C).
Le schéma génétique de base consiste à croiser des mouches pour générer des larves du génotype nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10 ; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. En tant que contrôle négatif, nous laissons de côté le transgène LexAop-CD4-spGFP11 . D’autres transgènes (par exemple, codage protéique, ARN double brin) peuvent être exprimés à volonté dans la couche DP (sous le contrôle de séquences UAS ) ou dans le PerM (sous le contrôle de l’opérateur LexA).
Il s’agit d’un protocole d’imagerie en direct qui ne peut pas être interrompu. La préparation du matériel est estimée à ~10 min. Les dissections ne doivent pas être effectuées pendant plus de 20 minutes à la fois avant l’imagerie. L’imagerie dure ~30 min et ne devrait pas durer plus de ~1 h. Pour plusieurs conditions ou un grand nombre d’échantillons, la procédure doit être effectuée en plusieurs cycles pour garantir les meilleurs résultats.
1. Préparation du matériel
<ol>
	<li>Avant la dissection, une pince à épiler propre, une plaque de dépression en verre à 9 puits (ou un autre récipient adapté à la collecte et au nettoyage des larves) et une boîte de Pétri réutilisable recouverte de Sylgard (silicone) utilisée pour la dissection avec 70 % d’éthanol.</li>
	<li>Préparez les lames de microscope en effectuant un lavage à l’éthanol à 70 %, puis en collant un espaceur d’imagerie sur la lame séchée. Découpez des puits individuels dans la bande de 8 puits à l’aide de ciseaux et coupez-les en deux (figure 2A). Retirez le support de protection d’un côté de chaque moitié et collez les entretoises sur la glissière, légèrement espacées pour créer un espace abrité au milieu où les disques seront placés (Figure 2B). REMARQUE : D’après notre expérience, cela simplifie le montage de l’échantillon car le volume précis de fluide transféré sur la lame est moins critique. Tout petit volume excédentaire s’écoulera simplement par l’espace lors de la lamelle. Comme nous n’imaginons que pendant une période relativement courte (généralement ~1 h), nous n’avons rencontré aucun problème avec le séchage moyen.</li>
	<li>Décongelez le milieu d’imagerie en direct (milieu de drosophile de Schneider non supplémenté stocké dans des aliquotes congelées de 10 ml) et gardez-le facilement accessible dans un seau à glace.</li>
	<li>Dans un tube de microcentrifugation de 2 mL, mélanger 1,5 mL de milieu avec 20 μL de 200 μg/mL de Hoechst 33342 (concentration finale de 2,7 μg/mL). Gardez le tube sur de la glace. REMARQUE : Cette forme spécifique de colorant Hoechst est utilisée car elle est hautement perméable à la membrane. ATTENTION : Des gants doivent être utilisés lors de la manipulation de Hoechst 33342. Les outils doivent être lavés après utilisation.</li>
</ol>
2. Dissection du disque de l’aile et préparation de la glissière
<ol>
	<li>Après le croisement génétique et l’élevage à 25 °C, prélevez les larves errantes du troisième stade dans le tube et lavez-les dans un milieu d’imagerie en direct froid dans une plaque de dépression en verre à 9 puits. REMARQUE : Les cytonèmes sont très fragiles. Dans les étapes suivantes, il faut prendre soin de manipuler les tissus autour des disques, en essayant d’éviter tout contact direct entre les disques et les outils de dissection. Nous préparons trois ou quatre larves à la fois, car il est inévitable d’endommager quelques disques, et cela ne peut devenir perceptible qu’au cours des étapes d’imagerie.</li>
	<li>Sous le microscope de dissection, transférez les larves dans une goutte de support d’imagerie en direct sur une boîte de Pétri recouverte de silicone et commencez à disséquer à l’aide de deux pinces à dissection. Pour ce faire, maintenez d’abord la tête et la partie antérieure du corps stables en pinçant les larves avec une paire de pinces à environ un tiers de la longueur du corps (à partir de la partie antérieure). À l’aide de la deuxième paire de pinces, pincez le corps juste en arrière de la première pince. Ensuite, retirez la partie postérieure des larves pour isoler la « moitié » antérieure.</li>
	<li>Inversez la moitié antérieure en la fixant avec une pince à épiler de chaque côté de l’extrémité coupée et en poussant la tête avec l’autre paire (comme si vous retourniez une chaussette), pour exposer les structures internes, y compris les disques imaginaux, la trachée, les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin.</li>
	<li>Retirez soigneusement les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin, en prenant soin de ne pas déranger les troncs latéraux de la trachée, qui doivent recouvrir et protéger les disques alaires.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, transférez avec précaution les moitiés antérieures nettoyées avec les disques alaires attachés dans une goutte de support d’imagerie en direct propre avec du Hoechst, placée entre les entretoises sur une lame préparée (Figure 2C). Isolez les disques alaires du reste des tissus en les disséquant doucement loin des fines branches de la trachée qui se connectent au disque, à l’aide d’une lame de la pince de dissection ou d’un fil de tungstène fin attaché à un porte-aiguille de dissection. Jetez le reste de la carcasse.</li>
	<li>Orientez les disques à l’aide d’une lame de la pince à dissection ou de l’aiguille de dissection en fil de tungstène. En raison de leur forme aplatie en forme de goutte d’eau, les disques alaires tomberont avec le DP ou le PerM vers le haut. Pour ce protocole, orientez tous les disques avec le côté PerM vers le haut.</li>
	<li>Ajustez le volume du support pour remplir entièrement le puits, légèrement au-dessus du niveau de l’espaceur d’imagerie, en ajoutant ou en retirant le support au besoin. Retirez le support de protection de la face supérieure de chaque moitié d’espaceur d’imagerie, puis abaissez soigneusement une lamelle sur l’échantillon. Appuyez doucement sur la lamelle à l’endroit où elle entre en contact avec les entretoises d’imagerie (par exemple, avec l’extrémité arrondie de la pince de dissection) pour vous assurer que la lamelle adhère à l’entretoiseur. REMARQUE : Le niveau moyen doit être légèrement au-dessus de la hauteur de l’entretoise pour éviter de piéger les bulles d’air, mais pas trop haut pour ne pas générer un débit important lorsque la lamelle est abaissée.</li>
</ol>
3. Imagerie
<ol>
	<li>Imagez des échantillons à température ambiante à l’aide d’un microscope confocal (laser argon ion avec une longueur d’onde de 488 nm pour GFP, laser UV avec une longueur d’onde de 350 nm pour Hoechst) équipé d’une lentille d’immersion dans l’huile 40x/1,30 NA et d’un logiciel de microscopie. Acquérez des piles d’images avec une taille de pas de 1 μm qui s’étendent juste au-dessus du niveau le plus élevé de la PerM (où la fluorescence de Hoechst diminue) à la face basale du DP, ce qui équivaut généralement à plus de 100 images par pile. Acquérez des piles d’images répétées pour générer des vidéos timelapse. REMARQUE : Nous imaginons une diapositive pendant pas plus de ~1-2 h.</li>
	<li>Pour les paramètres du logiciel du microscope, acquérez des images à l’aide d’un codage 8 bits, d’une moyenne de ligne de 2, d’un gain de détecteur généralement compris entre 650 et 750 et de pistes de canaux séparés pour réduire le débordement du signal. Utilisez des paramètres laser et de détecteur identiques pour toutes les conditions, prédéterminés en effectuant des tests sur chaque condition au préalable. REMARQUE : À un grossissement de 40x, nos images ont une résolution de 5,0386 pixels par μm (taille de pixel : 0,1985 x 0,1985 μm2). Dans notre configuration, les paramètres optimaux du microscope confocal comprenaient l’intensité laser la plus élevée possible (sans endommager les tissus) pour capturer autant de signal que possible, tout en produisant peu ou pas de saturation ; et le bruit le plus bas possible, tel qu’évalué sur les commandes négatives, obtenu en réduisant le décalage du détecteur et la vitesse d’acquisition (si nécessaire). Nous utilisons généralement moins de 5 % de puissance laser et la vitesse maximale de la tête de balayage ('9' dans les paramètres du logiciel Zen). L’acquisition d’une seule pile d’images prend généralement ~1 min 45 s, et les images sont prises toutes les 2 à 3 minutes pour des analyses en accéléré.</li>
</ol>
4. Analyse d’images
<ol>
	<li>Piles de projets à l’aide de la fonction de projection d’intensité maximale du progiciel ImageJ (cliquez sur l’image | Piles | Z, sélectionnez Intensité maximale dans le menu).</li>
	<li>Dans les images MIP, déterminez la surface de la poche alaire en fonction du motif de pliage du disque alaire (à l’aide du canal Hoechst) à l’aide de la sélection de polygones. Utilisez la même sélection sur le canal GFP avec la fonction Effacer l’extérieur (cliquez sur Modifier | Clear outside) pour définir la valeur de chaque pixel extérieur à 0.</li>
	<li>Dans les images MIP, utilisez le canal Hoechst pour nettoyer les images GFP, en supprimant spécifiquement tous les points artéfactuels qui apparaissent dans les deux canaux en réglant la valeur de pixel concernée à 0 (cliquez sur Sélection de polygones, puis Modifier | effacer).</li>
	<li>Dans les images MIP nettoyées, utilisez la fonction Histogramme (cliquez sur Analyser | Histogramme | List) pour obtenir et copier la liste de toutes les valeurs de pixel dans un tableau d’une feuille de calcul.</li>
	<li>Définissez une valeur seuil basée sur l’analyse du signal de fond dans les contrôles négatifs (puis vérifiée dans d’autres échantillons ; voir la discussion).</li>
	<li>Calculez le pourcentage de surface positive à la GFP à l’aide de la formule suivante : % surface positive à la GFP = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Normalisez les données à la fin en divisant chaque valeur par la moyenne de la condition de référence (qui est définie sur 1). REMARQUE : Pixel valide = pixel dont la valeur est ≥ 1, ignorant ainsi tout pixel supprimé dont la valeur a été définie sur 0. Les valeurs de pixel de 0 ne se produisent pas naturellement.</li>
	<li>Pour déterminer où dans les disques se localise le signal GFP reconstitué, utilisez des recoupes XZ d’empilements d’images pour regarder l’axe apicobasal de l’épithélium du disque. Effectuez les recoupes aux Fidji sans interpolation et augmentez la hauteur de l’image sur l’axe Z à l’aide de la fonction Scale avec interpolation bilinéaire pour améliorer la visibilité.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
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<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscope de dissection Discovery V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscope de dissection</td></tr><tr><td>Pince Dumont #55, Conseils de biologie</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11255-20</td><td>Pince à dissection</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC</td><td>Panneton et al., 2015</td><td>souche de mouche pour l’expression de Slik</td></tr><tr><td>FIDJI</td><td></td><td>Schindelin J. et al. (2012)&nbsp ;</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570&nbsp ;</td><td>Imagerie en direct Coloration nucléaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp ; </td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>souche de mouche</td></tr><tr><td>Microscope confocal LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Centre de stock de drosophile de Bloomington (BDSC)</td><td>86108</td><td>souche de mouche</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph et al., 2025</td><td>souche de mouche</td></tr><tr><td>PYREX 9-dépression verre spot platesell</td><td>Corning Sciences de la vie</td><td>7220-85</td><td>pour la collecte et le lavage des larves</td></tr><tr><td>Milieu de drosophile de Schneider</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21720024</td><td>support d’imagerie en direct</td></tr><tr><td>Entretoises d’imagerie SecureSeal, 8 puits, 0,12 mm d’épaisseur</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>entretoise</td></tr><tr><td>Kit élastomère de silicone SYLGARD 184</td><td>Sylgard</td><td>3097358-1004</td><td>pour la fabrication de plaques de dissection</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp ; </td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>souche de mouche</td></tr><tr><td>Noir Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td>logiciel d’acquisition</td></tr></tbody></table>

système d’expression double basé sur la complémentation gfp pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

Pour tester l’utilité de la procédure GRASP pour mesurer les contacts entre les cellules DP et PerM, nous avons examiné des disques alaires de quatre génotypes différents : des disques de contrôle négatif de type sauvage (génotype : w1118) qui n’afficheront que des niveaux de fond d’autofluorescence dans le canal GFP ; disques exprimant le CD4-spGFP1-10 dans la couche DP, mais dépourvus du transgène CD4-spGFP11, qui montrera le niveau de fluorescence produit par GFP1-10 seul (que nous pensions néglige...

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En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Le kinétochore est où le SAC lance son signal de contrôle de la ségrégation mitotique des chromatides sœurs. Une méthode est décrite pour visualiser le recrutement et le roulement de l'une des protéines du kinétochore et sa coordination avec le mouvement des chromosomes dans...

Etudier Checkpoint mitotique en illustrant le comportement dynamique des protéines Kinetochore et Motion chromosomique chez Vivre<em&gt; Drosophila</em&gt; Les embryons syncytial

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence d’un cerveau de drosophile transgénique pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales. Le cerveau exprime des protéines ciblées sur la membrane fusionnées avec différentes combinaisons d’épitopes antigéniques sous le contrôle d’un système de recombinase gliale spécifique. Les cerveaux isolés et fixes sont colorés avec des anticorps primaires spécifiques aux épitopes antigéniques, suivis d’anticorps secondaires conjugués aux...

Coloration par immunofluorescence du cerveau de la drosophile pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.

Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Cet article décrit un protocole efficace de dissection imaginaire des disques et de coloration par anticorps, économique en matière de réactifs et facilitant la manipulation de disques imaginaux en petites quantités.

Dissection à petite échelle et coloration par anticorps des disques imaginaux oculaires-antennaux et des ailes provenant de Drosophila melanogaster

Découvrez une méthode de complémentation GFP pour visualiser les contacts cellule-cellule médiés par les cytonèmes dans les disques imaginaux d'aile de Drosophila. Cette technique permet d'étudier la communication cellulaire en temps réel.

Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile (Vidéo) | JoVE Journal

Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile

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