Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile

Notre recherche vise donc à comprendre comment les cellules situées à distance dans les tissus communiquent entre elles. Nous utilisons le disque imaginal de l’aile de drosophile comme système modèle pour essayer de comprendre comment la cytidine se forme, comment elle fonctionne et quel rôle elle joue dans le contrôle local de la croissance des tissus. Des études suggèrent que les facteurs de croissance voyagent souvent à travers des projections cellulaires spécialisées comme les filopodes de signalisation basés sur l’actine, appelés cytonèmes, afin d’être livrés aux cellules cibles.

Les cytonèmes sont des structures très minces et fragiles qui sont facilement perturbées par le protocole de fixation. Pour les observer, vous devez utiliser des approches d’imagerie en direct dédiées avec des protéines exprimées marquées par fluorescence. Cela limite considérablement l’outil et les approches que nous pouvons utiliser pour les étudier.

Nous avons identifié une protéine kinase appelée Slik qui est impliquée dans la biogenèse du cytonème. L’expression de Slik dans une couche épidurale du disque imaginal de l’aile déclenche la formation du cytonème qui a traversé la lumière du disque et stimule la prolifération des cellules dans la couche épithéliale voisine. À l’avenir, nous aimerions identifier la protéine agissant en aval de Slik pour favoriser la formation du cytonème, identifier le ligand qui est délivré via ce cytonème pour favoriser la perforation, et mieux comprendre l’importance physiologique de ce mécanisme dans le contrôle de la croissance tissulaire.

Pour commencer, coupez des puits individuels dans la bande de huit puits à l’aide de ciseaux, puis coupez chaque puits en deux. Retirez le support de protection d’un côté de chaque moitié et collez les entretoises sur la lame de microscope, en les espaçant légèrement pour créer un espace central abrité pour le placement du disque. Cueillez les larves errantes du troisième stade dans le tube d’élevage après le croisement génétique et l’incubation à 25 degrés Celsius.

À l’aide d’un microscope à dissection, transférez les larves dans une goutte de support d’imagerie en direct sur une boîte de Pétri recouverte de silicone. À l’aide de deux pinces à dissection, commencez la dissection en pinçant les larves à environ 1/3 de la longueur du corps à partir de l’avant avec une paire de pinces pour les maintenir stables. Avec la deuxième paire, pincez le corps juste en arrière jusqu’au premier point et tirez pour séparer la moitié postérieure, en isolant la section antérieure.

Inversez la moitié antérieure en saisissant les deux côtés de l’extrémité coupée avec une pince à épiler et en poussant la tête à l’aide d’une deuxième paire, en la retournant. Cela expose des structures internes telles que les disques imaginaux, la trachée, les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin. Retirez les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin à l’aide d’une pince, en prenant soin de ne pas déranger les troncs trachéaux latéraux recouvrant les disques alaires.

À l’aide d’une pince, transférez les moitiés antérieures nettoyées avec les disques d’aile attachés dans une goutte de support d’imagerie en direct propre avec des crochets placés entre les entretoises de lame. Pour isoler les disques alaires, disséquez-les doucement des fines branches trachéales à l’aide d’une lame de la pince de dissection ou d’un fin fil de tungstène monté sur un porte-aiguille de dissection. Jeter la carcasse restante.

Orientez les disques alaires à l’aide d’une pince à dissection, d’une lame ou d’une aiguille en tungstène de manière à ce que la membrane péripodiale soit tournée vers le haut. Ajustez le volume moyen de manière à ce qu’il remplisse légèrement le puits au-dessus du niveau de l’entretoise. Retirez le support de protection supérieur de l’espaceur d’imagerie et abaissez doucement une lamelle sur l’échantillon.

Appuyez sur la lamelle aux points de contact de l’entretoise à l’aide de l’extrémité arrondie de la pince pour assurer une bonne adhérence. Pour projeter les piles d’images dans ImageJ, sélectionnez Image, puis Piles, puis Projet Z, puis choisissez Intensité maximale dans le menu. Dans les images de projection d’intensité maximale, identifiez la zone de la poche de l’aile en fonction du motif de pliage du disque de l’aile à l’aide du canal des crochets et de l’outil de sélection de polygones.

Appliquez la même sélection au canal GFP, puis sélectionnez Modifier suivi de Effacer l’extérieur pour éliminer le bruit en dehors de la région sélectionnée. Utilisez le canal crochets dans les images de projection d’intensité maximale pour identifier les points artificiels dans les images GFP. Ensuite, sélectionnez la zone à l’aide de l’outil de sélection de polygones.

Cliquez sur Modifier et choisissez Effacer. Dans les images de projection d’intensité maximale nettoyées, sélectionnez Analyser, puis Histogramme, puis choisissez Liste pour obtenir toutes les valeurs de pixel. Copiez cette liste dans un tableur.

Pour définir une valeur de seuil, analysez le signal d’arrière-plan dans les échantillons de contrôle négatif et confirmez cette valeur à l’aide d’autres images d’échantillons. Calculez le pourcentage de surface GFP positive en divisant le nombre de pixels au-dessus du seuil par le nombre total de pixels valides et en multipliant le résultat par 100. Enfin, normalisez chaque valeur calculée après l’avoir divisée par la moyenne de la condition de référence, qui est définie sur un.

Dans les disques de type sauvage dépourvus des deux composants GFP divisés, seule une autofluorescence granulaire GFP minime a été observée près du centre de la poche de l’aile, et ce signal de base a été utilisé pour définir un seuil de fluorescence. Les disques exprimant uniquement la GFP1-10 fendue par CD4 dans la couche proprement dite du disque ont montré des niveaux de fluorescence indiscernables du type sauvage, confirmant la nature non fluorescente de GFP1-10 seul. La co-expression de CD4 split GFP1-10 dans le disque proprement dit et de CD4spGFP11 dans la membrane péripodiale a conduit à une augmentation notable des taches GFP discrètes et brillantes localisées à la lumière du disque, avec une zone de fluorescence positive significativement plus grande au-dessus du seuil que les témoins.

L’expression de Slik dans le disque proprement dit a provoqué une forte augmentation de la densité des noyaux de la membrane péripodiale et une augmentation spectaculaire de l’intensité du signal GFP dans la région de la poche alaire, suggérant que les cytonemes induits par Slik établissent un contact amélioré avec les cellules de la membrane péripodiale.