Microinjection de gonades : une méthode d’administration de composés directement dans la lignée germinale de C. elegans

- Pour préparer l’injection, utilisez un pic à vis sans fin pour poser une trace d’huile d’halocarbure sur un tampon d’agarose. Placez les vers dans l’huile et immobilisez-les en les poussant doucement sur le tampon gélosée. Assurez-vous que l’huile recouvre complètement les animaux. Il permet à l’oxygène d’atteindre les vers tout en empêchant la dessiccation. Ensuite, placez le tampon d’agarose sur un microscope à injection et positionnez l’aiguille perpendiculairement au ver, en ciblant l’extrémité distale d’un bras gonadique.

Poussez doucement l’aiguille à travers la cuticule et injectez dans le bras gonadique l’acide nucléique ou le composé d’intérêt. Chaque bras gonadique contient un syncytium germinal qui se développera en ovocytes individuels. Le matériel injecté dans la gonade distale sera incorporé dans ces ovocytes et affectera la génération suivante.

Après avoir injecté des vers, remplacez l’huile par un tampon M9. Une fois que les vers commencent à bouger, transférez-les dans une plaque de gélose NGM avec de la nourriture bactérienne. Dans le protocole suivant, la méthode de micro-injection de gonades est utilisée pour délivrer un complexe Cas9 afin de cibler et d’éditer le gène dpy-10.

- Commencer par la préparation de C. elegans et de coussinets d’agarose comme décrit dans le protocole de texte. Placez un tampon d’injection d’agarose et une lamelle sur un endoscope de dissection. À l’aide d’un pic à vis sans fin, posez une petite trace d’huile d’halocarbure le long d’un bord du tampon. Ensuite, utilisez le cure-vis recouvert d’huile pour soulever plusieurs vers de la plaque de gélose NG et les déposer dans la trace d’huile. À l’aide d’un poil fin attaché à une pipette, comme un cil ou une moustache de chat, positionnez les vers en parallèle en poussant doucement les vers dans le coussinet d’agarose. Jusqu’à ce que vous soyez à l’aise avec la procédure de micro-injection, ne montez et n’injectez qu’un seul ver à la fois.

Une fois en position et fixé au tampon, recouvrez les vers avec quelques gouttes supplémentaires d’huile d’halocarbure à partir de la pointe du pic à vers. Placez la lamelle avec les vers montés sur le microscope à injection. Sous un faible grossissement, positionnez les vers perpendiculairement à l’aiguille d’injection, qui a été remplie avec la solution RNP, comme décrit dans le protocole de texte.

Passez à un grossissement élevé et repositionnez l’aiguille adjacente au bras gonadique, correspondant à la région près des noyaux chez le pachytène moyen à tardif. À l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille contre le ver, en enfonçant légèrement la cuticule. Ensuite, d’une main, tapotez le côté de la platine du microscope pour faire passer l’aiguille à travers la cuticule. Appuyez sur la pédale ou le bouton d’injection, remplissez lentement le bras de la gonade avec le mélange d’injection et retirez l’aiguille. Répétez l’étape avec l’autre bras gonadique.

Une fois les vers injectés, retirez la lamelle dans le tampon d’agarose et placez-la sous un microscope à dissection. À l’aide d’une pipette capillaire tirée, déplacez l’huile des vers en pipetant un tampon M9 sur eux. Effectuez ce traitement pour libérer les vers de l’agar. Au bout de 10 minutes, lorsque les vers se débattent dans le tampon, déplacez-les vers une plaque de gélose NG avec des bactéries OP50 à l’aide de la pipette capillaire tirée. Placez l’assiette à 20 degrés Celsius pendant deux à trois heures jusqu’à ce que les vers se soient rétablis et se déplacent. Une fois récupérés, transférez individuellement les vers dans des plaques de gélose NG avec OP50 Ensuite, transférez les plaques dans un incubateur à 25 degrés Celsius.