Name: La micro-injection et lélectroporation dembryons dans le chordés Ciona intestinalis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez la micro-injection et l'électroporation d'embryons chez Ciona intestinalis pour étudier la régulation génique et le développement des chordés. Ces méthodes permettent d'explorer la fonction des gènes et les mécanismes évolutifs.

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Ce travail a été soutenu par l’Université d’Innsbruck, en Autriche, et l’Académie autrichienne des sciences (ÖAW).

1. Préparatifs pour microinjection et électroporation en Ciona Oeufs et zygotes <ol><li> Préparer 10 L d&#39;eau de mer artificielle avec HEPES (ASWH) pour la culture d&#39;embryons. Dissoudre mM NaCl 420, 9 mM de KCl, 10 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 24,5 mM MgCl 2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO 4 · 7H 2 O, et 2,15 mM NaHCO 3 dans l&#39; eau distillée deux fois (ddH 2 O) en agitant pendant une nuit. Ajouter 5 mM HEPES, pH 8,0, et de vérifier / ajuster le pH à 8,0. Stocker le ASWH à 4 ° C. Chauffez jusqu&#39;à 18 ° C et le filtrer avec du papier filtre avant utilisation. </li><li> Préparer une solution 20x inactivée dechorionation: thioglycolate de sodium à 20%, 1% dans la pronase ASWH. Stockez 500 aliquotes pi à -20 ° C, et diluer à un volume final de 10 ml ASWH avant utilisation. </li><li> Préparer 15 à 20 boîtes de culture pour les œufs / embryons. Verser fondue d&#39;agarose à 1% dans ASWH à 3,5, 5, 9 ou 15 cm des boîtes de Petri, en les enrobant d&#39;une mince couche de 1 à 2 mm.Que l&#39;agarose solidifier et couvrir les plaques avec ASWH. Stock eux à 4 ° C pendant 1-2 semaines maximum. Remplacez le ASWH avant utilisation. </li><li> Préparer des plats d&#39;injection spéciale. <ol><li> Versez une couche épaisse de 5-7 mm de fondu 1% d&#39;agarose dans un plat de 5 cm de Pétri, et placer un moule sur l&#39;agarose (comme une fermeture zip lock collé à une lamelle en plastique) pour produire une empreinte lors de la solidification de l&#39;agarose qui peut contenir des oeufs. Préparer 4 à 5 plats d&#39;injection et couvrir avec ASWH. Conserver à 4 ° C et le remplacer par ASWH frais avant utilisation. Utilisez uniquement des plaques fraîches pour injection (maximum de vieux un jour). </li></ol></li><li> Préparer β-galactosidase (LacZ) du tampon de coloration: 1 mM MgCl 2 .6H 2 O, 3 mM de K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM de K 3 [Fe (CN) 6] dans le tampon au phosphate salin (PBS) avec du Tween (PBT) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, 0,05% de Tween). Magasin in l&#39;obscurité à 4 ° C. Préparer le substrat LacZ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-gal, 10 U / ml) dans des aliquotes de 40 mg / ml dans du diméthylformamide (DMF) et les stocks de conserver à -20 ° C jusqu&#39;à ce que utilisation. </li><li> Tremper pipettes Pasteur dans l&#39;eau du robinet pendant la nuit pour éviter les embryons de coller. </li><li> Préparer des aiguilles d&#39;injection. <ol><li> Mettre en place un extracteur micropipette à des conditions telles que la chaleur 425, tirez 75, vitesse 75 et le temps 200 (à partir d&#39;un test de filament de rampe de 415). </li><li> Tirez 4 à 5 capillaires en verre contenant filament pour produire 8 à 10 longues, fines aiguilles normalement fermées à la pointe. Stocker les aiguilles dans une boîte à aiguilles sans poussière, attachée à un ruban adhésif double sur un support surélevé, pour éviter de casser les conseils et ce qui est pratique pour le remplissage de l&#39;aiguille. REMARQUE: Testez les aiguilles obtenues en injectant quelques oeufs avec colorant vital vert (tel que décrit dans la section 6) et régler l&#39;aiguille en tirant les conditions pour obtenir une forme de pointe qui permet d&#39;affiner et de REPETITive injection comme décrit dans 6.6. </li></ol></li><li> Préparer la solution d&#39;injection. 4 ul de la préparation de la solution d&#39;injection, par exemple, composé de 1 ul de 2 mM MO, 2 ul de 10 ug / ul de colorant vital vert et 1 ul ddH 2 O. Ajouter une concentration finale de 0,05 à 0,5 pg / pl d&#39;ARNm coiffés ou 20 ng / pl d&#39;ADN de plasmide selon la question expérimentale. Bien mélanger. Gardez sur la glace si la solution contient l&#39;ARNm. </li></ol> 2. Collecte des gamètes <ol><li> Adultes Dissect Ciona dans un 18 ° C refroidi salle d&#39;embryon. Utilisez de petits ciseaux et commencer à partir de la fin qui oppose les siphons sur le côté de l&#39;exhalation (plus court) siphon sous lequel l&#39;oviducte et la course de canal du sperme. </li><li> Exposer l&#39;oviducte et de faire délicatement une incision dans l&#39;oviducte en utilisant la pointe des ciseaux. Laissez tomber les oeufs écoule directement dans une plaque de 6 puits contenant ASWH en appuyant doucement l&#39;oviducte avec les ciseaux fermés décapage hors exgs. Transférer les oeufs restants avec une pipette Pasteur pré-rincé avec ASWH. </li><li> Déposer les œufs provenant de différents animaux dans différents puits. Observer la qualité des œufs dans le champ de dissection. NOTE: les œufs bien développés sont ronds et roses à légèrement jaune. Ils sont entourés d&#39;une couche vitelline non cellulaire, le chorion qui forme un espace périvitellin bien défini autour de l&#39;oeuf. Chorion est associée à des cellules de test dans ses cellules de follicules à l&#39;intérieur et en forme d&#39;étoile à l&#39;extérieur. Les œufs de faible qualité manquent souvent de l&#39;espace périvitelline ou les cellules folliculaires. Ils apparaissent moins rond, plus granulaire ou de couleur différente. ovocytes immatures sont plus petits et ont une couleur blanc argenté. </li><li> Couper le canal du sperme avec des ciseaux et recueillir le sperme concentré dans un tube de 1,5 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur séparée. Rassembler le sperme provenant de différents animaux (au moins deux) dans le même tube. sperme de magasin à 4 ° C pendant plusieurs jours. </li></ol> 3.Fertilisation <ol><li> Recueillir le sperme et les œufs à 18 ° C comme décrit à l&#39;étape 2. </li><li> Activer le sperme. <ol><li> Préparer 1 ml ASWH dans un tube de 1,5 ml et on mélange avec 50 pi de Tris 1 M pH 9,5. Ensuite, ajouter 20 ul de sperme concentré et mélanger doucement en inversant le tube. </li><li> Vérifiez l&#39;activation du sperme dans une goutte de sperme placé sur un couvercle d&#39;une petite boîte de Pétri ou une lame de verre et d&#39;observer dans le champ de dissection. Les spermatozoïdes doivent être nager frénétiquement. </li></ol></li><li> Ajouter 100 à 200 ul de la solution de sperme activé à chaque puits d&#39;oeufs (contenant entre 100 et 1000 œufs), bien mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, de sorte que les oeufs flottent dans le milieu. Attendre 10 min sans déplacer les embryons. </li></ol> 4. dechorionation des ovules et des embryons <ol><li> Diluer une aliquote de 500 pi de 20x solution dechorionation à 10 ml en ASWH. Activer la solution dechorionation en ajoutant goutte à goutte 200 pi de 2.NaOH 5 M à la solution 10 ml 1x dechorionation. Un précipité laiteux se formera. Mélanger doucement en inversant le tube. </li><li> Collecter les oeufs ou les zygotes (après 10 minutes d&#39;attente à l&#39;étape 3.3) dans des tubes en verre à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Réunir les oeufs de 2 à 3 animaux dans un tube (autour de 1.000-5.000 oeufs / tube). Sédiments avec une centrifugeuse à la main en faisant tourner à grande vitesse (1200 xg) pendant environ 20 secondes pour former une pastille d&#39;embryon au fond du tube. Lentement arrêter la centrifugeuse et enlever le ASWH avec une pipette Pasteur. </li><li> Ajouter 4 ml de solution de dechorionation activé aux oeufs / zygotes sédimentées dans chaque tube. Suspendre les œufs / zygotes en les pipetant doucement monter et descendre à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur robinet traitée eau surmonté d&#39;une petite poire en caoutchouc. La solution doit tourner jaunâtre après 1-3 min. </li><li> Suivre la dechorionation en retirant une petite aliquote de la suspension d&#39;oeuf / zygote dechorionating à l&#39;aide de la pipette Pasteur. Déposez une goutte sur une lame et d&#39;observer sous le s disséquantchape. Gardez pipetage oeufs / zygotes de haut en bas et de vérifier toutes les 20-30 secondes. NOTE: les cellules Premières follicule se détachent, le chorion devient jaune et opaque, et enfin il se détache des zygotes. Rose dechorionated oeufs / zygotes vont tomber au fond du tube de verre. Le dechorionation ne devrait pas prendre plus de max. 5 min. </li><li> Remplir le tube avec ASWH fois 50% des œufs / zygotes sont dechorionated. NOTE: Très doucement centrifugeuse (8 xg) pendant environ 10-15 secondes correspondant à une vitesse très faible, juste assez pour sédimenter les œufs / embryons dechorionated. Lentement arrêter la centrifugeuse pour ne pas perturber le culot d&#39;oeufs / zygotes au fond du tube. </li><li> Éliminer la quasi-totalité du liquide du tube de verre, y compris le matériau flottant avec incomplètement dechorionated oeufs / zygotes et les remplacer par ASWH. pipeter lentement et pour laver et centrifuger doucement à nouveau comme dans l&#39;étape 4.2. Sinon, attendez zygotes à régler par gravité. Laver une fois de plus jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun débris chorionique est lauche. </li><li> les oeufs de transfert / zygote fraîchement rincé des boîtes de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Gardez les zygotes (pas d&#39;œufs) à faible densité (environ 200 embryons par boîte de 10 cm) pour éviter leur coller ensemble. Culture des embryons au stade désiré à des températures comprises entre 13 et 20 ° C. Alternativement, électroporation les zygotes (étape 5) ou injecter les œufs non fécondés (étape 6). </li></ol> 5. électroporation <ol><li> Fertiliser les oeufs et les zygotes dechorionate à 18 ° C, comme dans les sections 3 et 4. Fournir entre 50 et 400 œufs par échantillon d&#39;électroporation. </li><li> Préparer l&#39; ADN de plasmide de 50 ul dans un tube de 1,5 ml (max. D&#39; ADN plasmidique à 100 ug dans 50 ul ddH 2 O) et ajouter 200 ul de 0,95 M de mannitol. Bien mélanger par tourbillonnement. </li><li> Dispatch et la gravité sédimentent les zygotes dechorionated dans siliconés tubes de 1,5 ml. Retirez le ASWH jusqu&#39;à la marque de 100 pi sur le tube. </li><li> Procéder, consécutivement, pour chaque tube de zygote comme suit: ajouterune solution d&#39;ADN / mannitol à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Mélanger délicatement avec les zygotes et instantanément prendre le / mannitol / zygote suspension et de transfert d&#39;ADN à une cuvette d&#39;électroporation de 4 mm. </li><li> Placez la cuvette immédiatement dans le support d&#39;électroporation et de donner une impulsion unique de 16 msec à 50 V. </li><li> Retirez les zygotes de la cuvette en utilisant la même pipette Pasteur et les étaler sur une boîte de culture contenant ASWH frais et filtré. Pipeter les zygotes avant qu&#39;ils ne commencent à cliver environ 1 après la fécondation heures (HPF) à 18 ° C. </li><li> Rinçage de la pipette entre les échantillons dans un bêcher de ASWH. </li><li> Culture zygotes à 15-20 ° C à faible densité suffisante d&#39;environ 200 embryons par boîte de 10 cm pour éviter leur coller ensemble. </li></ol> 6. microinjection <ol><li> Préparer dechorionated oeufs pour l&#39;injection. <ol><li> Dechorionate les œufs séparément, de 2-4 animaux, tel que décrit dans la section 4. Gardez l&#39;e unfertilized et dechorionatedgg dans un petit agarose des boîtes de culture revêtues séparés. Lavez les oeufs plusieurs fois dans les plats pour enlever les débris. </li><li> Test de fertiliser petits lots des œufs dechorionated (environ 50) de chaque individu. Utilisez un 5 cm plat séparé pour chaque lot et appliquer 2 ul de sperme activé (étape 3.2). Bien mélanger en faisant tourbillonner les plats et étaler les oeufs dans le plat en déplaçant les plats de côté. Gardez le sperme et les oeufs ensemble pendant environ 10 minutes sans bouger. </li><li> Éliminer un maximum de sperme comme suit: transférer les oeufs fécondés dans un plat de culture frais ou rincer deux fois avec ASWH frais. Laissez les embryons clivant non perturbés jusqu&#39;au stade 32 cellules (à 18 ° C pendant environ 3 heures après la fécondation). Choisissez des œufs de la meilleure développement lot (meilleur pourcentage de fécondation et le plus tendance de clivage régulier) pour la microinjection. </li></ol></li><li> Mettre en place les aiguilles d&#39;injection. <ol><li> Remblai 4 aiguilles d&#39;injection dans une position verticale pour permettre la gravité flow le long du filament. 0,5 solution de dépôt ul d&#39;injection (étape 1.8) contenant un colorant vital vert à l&#39;extrémité arrière des aiguilles qui sont positionnées l&#39;aiguille pointe vers le bas. Attendez que le liquide pour remplir la pointe de l&#39;aiguille au fond. </li><li> Repositionner les aiguilles à l&#39;horizontale et de les remblayer avec de l&#39;huile minérale à l&#39;aide d&#39;un métal fin et long ou embout de pipette en plastique. superposer lentement la solution d&#39;injection d&#39;huile minérale expulser toutes les bulles d&#39;air lors du remplissage de l&#39;aiguille. </li></ol></li><li> Configuration du micromanipulateur dans un 18 ° C Refroidi Chambre. <ol><li> Raccorder le tuyau en plastique du porte-aiguille pour une seringue en verre de 10 ml rempli d&#39;une huile minérale. Remblayer le tube et le porte-aiguille avec l&#39;huile et chasser les bulles d&#39;air. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans le porte-aiguille et positionner le support sur le micromanipulateur. </li><li> Ajuster le mouvement du support d&#39;aiguille le long d&#39;une ligne droite à un angle de 45 ° par rapport à la surface. </li></ol></li><li> Orientez le dechorionaoeufs ted le long de l&#39;empreinte d&#39;agarose de la coupelle d&#39;injection de sorte que les œufs peuvent être injectés par une une sous le microscope de dissection. </li><li> Briser la pointe de l&#39;aiguille, si nécessaire, en poussant doucement l&#39;aiguille contre l&#39;agarose ou contre un morceau de couverture en verre de glissement placé sur l&#39;agarose. Légèrement pression sur le bouton de la seringue pour vérifier que la pointe de l&#39;aiguille est ouverte (contenu d&#39;aiguilles vertes expulser). </li><li> Injecter les œufs fécondés, un par un, en introduisant d&#39;abord l&#39;aiguille dans l&#39;oeuf et un peu d&#39;aspiration pour briser la membrane d&#39;oeuf suivie d&#39;une injection. Injecter la solution d&#39;injection vert dans le milieu de l&#39;œuf jusqu&#39;à un maximum de 1/3 du diamètre de la cellule. (Ce qui correspond à environ 30 pl pour un diamètre d&#39;oeuf de 140 um). </li><li> Transférer les œufs non fécondés injectés dans un plat de culture frais et incuber à 15-18 ° C jusqu&#39;à ce que la fécondation. </li><li> Fertiliser les oeufs injectés avec du sperme fraîchement activé comme dans les fécondations de test (étape 6.1.2). éliminaea maximale du sperme en transférant les zygotes à un plat de culture frais. Etaler les embryons et ne les perturbe pas pendant les étapes de clivage (jusqu&#39;au stade 32 cellules). </li><li> Culture des embryons au stade désiré à une température comprise entre 13 et 20 ° C. </li><li> Recueillir les embryons en les agitant dans le milieu de la plaque et de les transférer dans siliconés tubes de 1,5 ml. Fix et aux taches, ou monter (étapes 7 et 8). </li><li> Comparez les phénotypes obtenus aux embryons de contrôle injecté. NOTE: Injecter une seconde MO, sans chevauchement qui cible la même transcription pour obtenir des phénotypes identiques. Rescue le phénotype MO spécifique (s) avec un ARNm modifié codant pour votre protéine d&#39;intérêt, mais qui ne sont pas reconnus par les organisations membres. Injecter un MO de contrôle qui ne donne pas de phénotype. </li></ol> 7. LacZ Coloration <ol><li> Recueillir les embryons à un stade souhaité dans siliconés tubes de 1,5 ml et les fixer à 0,2% de glutaraldéhyde dans 1 ml ASWH 15à 30 min au maximum. </li><li> Laver 2x 10 min avec 1 ml 1x PBT. </li><li> Rincer une nouvelle fois dans 500 tampon de coloration LacZ ul. Remplacer avec le substrat X-Gal additionné de 1 ml tampon de coloration (utiliser 10 pl / ml de 40 mg / ml X-Gal stock). Transférer les embryons dans une plaque à 12 puits pour une meilleure observation de la coloration. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité. Faire varier une incubation de 0,5 heure à une nuit à 4 ° C, à la température ambiante ou à 37 ° C en fonction de la résistance du conducteur en exprimant LacZ. </li><li> Laver les embryons jusqu&#39;à 4 fois dans 1 ml 1X PBT pour éliminer le tampon de coloration. </li><li> Post-fix pendant 10 min à température ambiante avec 2% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 ml 1x PBT ou 0,2% de glutaraldéhyde dans 1 ml 1x PBT pour l&#39;interprétation et la visualisation des embryons colorés. </li></ol> 8. Montage de par fluorescence Wmbryos Labelled <ol><li> Fixer les embryons d&#39;un stade de développement souhaité pendant 20 min à 2% PFA dans 1 ml ASWH. </li><li> Laver les embryons 2x dans 1 ml 1x PBT. Évitez les expositions lumineusesure en gardant les embryons dans des conditions sombres. </li><li> Transférez jusqu&#39;à 50 embryons à une diapositive. Retirer un maximum de PBT d&#39;abord avec une pipette et soigneusement avec une serviette en papier. </li><li> Ajouter 20-25 pi de milieu de montage. </li><li> Ajouter une lamelle en le positionnant dans un angle (d&#39;un côté de la première) et abaissez lentement avec un objet pointu (aiguille, pince, pointe de la pipette) en évitant les bulles jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon est couvert. Fixer la lamelle sur ses bords en utilisant des points d&#39;un vernis à ongles transparent. </li><li> Sceller l&#39;ensemble de la lamelle avec un vernis à ongles après séchage. Conserver dans l&#39;obscurité à -20 ° C. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il existe deux grandes techniques pour générer des embryons Ciona transgéniques: microinjection de l&#39; ARN ou de l&#39; ADN et l&#39; électroporation de l&#39; ADN. Ces techniques de perturbation des gènes dans les embryons Ciona ont été utilisés d&#39; abord dans les années 1990 , 7,8 et à partir de là successivement améliorées, et maintenant utilisés dans Ciona (et d&#39; autres genres de ascidie) 20 dans le monde entier. Les étapes critiques dans le protocole Transgénèse réussie en gamètes Ciona qui sont facilement collectées à partir d&#39; animaux adultes dépend d&#39;un certain nombre de facteurs critiques. La qualité des gamètes dépend de la saison de reproduction (généralement de mai à Décembre dans l&#39;Atlantique Nord, l&#39;évolution de la température de l&#39;eau et de l&#39;oxygénation), sur la qualité de l&#39;eau de mer dans les aquariums (au bon salinité, les adultes restent en bonne santé pendant 2-4 semaines) , et enfin sur la manipulation correcte des gamètes lors de l&#39;extraction des adultes, comme détaillé ci-dessous pour les différentes étapes duprotocole. Au cours des étapes de préparation, incubation pipettes Pasteur avec de l&#39;eau du robinet empêchera embryons de coller et de l&#39;eau de mer pré-incubation des boîtes de Pétri agarose revêtu va éliminer les substances toxiques libérées de l&#39;agarose. En général, les plats peuvent être préparés jusqu&#39;à 2 semaines avant son utilisation, stocké à 4 ° C pour éviter la croissance des bactéries et on les rince fraîchement avant leur utilisation. Un jour vieux, petits plats semblent meilleures pour les injections. L&#39;efficacité et la durée de dechorionation est une étape cruciale dans le protocole comme un traitement prolongé des œufs / embryons va nuire au développement. Une préparation minutieuse (pas d&#39;agitation) et de stockage correct (à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine) préserver la qualité de la solution de dechorionation. Proteases dans la solution perdent de leur efficacité si l&#39;un mélange trop violemment à la préparation ou au fil du temps, notamment si elles sont conservées à la température ambiante pendant de longues heures / jours. Nous avons optimisé cette étape critique en utilisant une solution de dechorionation frais commodémentpréparé à partir d&#39;aliquotes congelées de 20x solution stock. La manipulation correcte des fragiles œufs dechorionated / embryons est essentielle et le cisaillement ou poignarder des embryons alors pipetage sera préjudiciable. Lors de pipetage, les embryons sont maintenus autant que possible dans la suspension (en douceur &quot;soufflage&quot; de liquide à tourbillonner les suivie par une pipetage lisse mais rapide), tout en maintenant la pipette en verre à la verticale plutôt que horizontale. Ces soins applique à toutes les étapes de pipetage pour le lavage, la remise en suspension et de transfert des oeufs / embryons dans et hors des tubes, des cuvettes ou des plaques, avant et après fixation. Lors de la fixation, une attention particulière devrait également être pris à des dispositifs de pipetage séparés pour vivre contre embryons fixes pour éviter toute toxicité à partir de restes de fixateurs. Microinjection est assez délicate dans Ciona œufs / embryons en raison de leur petite taille et de la résilience de la membrane vitelline et dépend de la taille de la pointe optimisée de façon critiquel&#39;aiguille d&#39;injection, un angle parfait d&#39;injection (mouvement de l&#39;aiguille en une seule ligne, le long du rayon d&#39;oeuf) et un finement réglé, l&#39;ouverture manuelle de la membrane vitelline (par aspiration avant l&#39;aspiration à l&#39;injection). Celui-ci est seulement possible si les bulles d&#39;air soient complètement éliminées de la tubulure d&#39;injection qui contient de l&#39;huile minérale pour lisser la pression d&#39;aspiration / d&#39;injection. En outre, les plus petits morceaux de débris de poussière ou de l&#39;œuf se bouchent l&#39;aiguille, et sont facilement évités par des conditions de travail propres et étapes de rinçage pour les oeufs avant le transfert sur le plat d&#39;injection. injection Post, le transfert des oeufs sur des boîtes fraîches évitera des effets toxiques à partir d&#39;embryons morts ne pas avoir survécu à la procédure d&#39;injection. Dépannage Les problèmes potentiels dans la procédure peuvent être adressées par les solutions suivantes. taux de fécondation faibles peuvent provenir de l&#39;activation de sperme insuffisant, faible propreté d&#39;oeuf ou de gros volumes de fertilisation. Utilisez freshly ont été réunies et le sperme moins dilué. Vérifier le mouvement du sperme lors de l&#39;activation. Lavez les oeufs avec ASWH avant la fécondation, comme décrit dans l&#39;étape 4.2. Réduire le volume de l&#39;eau et de réduire la quantité d&#39;oeufs par boîte de fertilisation / puits. embryons Losing au cours des étapes de préparation peuvent être évitées en ajoutant une goutte de solution de dechorionation pour centrifuger plus efficacement vers le bas les œufs / embryons undechorionated. Dechorionation temps devrait être optimisée en oeufs partiellement dechorionated ne sédiments et dechorionation prolongée est toxique, à l&#39;origine des embryons à exploser. le développement Asynchronous peut provenir de sperme résiduel libéré lors de la dissection. Gardez les lots d&#39;œufs séparés de différents animaux pour éviter incontrôlée fertilisation croisée. Un développement anormal peut avoir diverses causes. Au début et à la fin de la saison, après avoir maintenu l&#39;embryon à partir de différents individus séparés, les meilleurs lots peuvent être sélectionnés. Eviter de perturber les embryons pour la10 min qui suivent la fécondation pour éviter d&#39;interférer avec leur ségrégation ovoplasmique. Veiller à ce que les embryons ne commencent à se diviser, tout en étant transféré comme pipetage sépare les blastomères sœurs et les résultats dans les embryons partiels. Utiliser moins de sperme pour les œufs dechorionated pour éviter polyspermie. Utilisez des plats agarose fraîchement préparés, mais rincés. Assurez-vous que le dispositif de pipetage est fixateur libre. Gardez embryons de contrôle qui ne sont pas dechorionated et non électroporation pour détecter au cours de laquelle le développement étape a été perturbée. Compléter les embryons avec des antibiotiques en cas de contamination et de décomposition se produit. Si le dispositif d&#39;injection est «bouché», l&#39;ouverture de l&#39;aiguille d&#39;injection peut être vérifiée en expulsant une partie de son contenu souillé. matériau de colmatage peut être effacé en faisant glisser soigneusement la pointe de l&#39;aiguille à travers l&#39;agarose. Les bulles d&#39;air dans la tubulure d&#39;injection et / ou de l&#39;aiguille doit être supprimée. Changez l&#39;aiguille pour un meilleur contrôle du volume d&#39;injection comme neetip dle peut se briser ou se boucher le long injection. Rincer les œufs et les placer dans un plat d&#39;injection propre si des débris se sont accumulés dans le plat. Centrifuger la solution d&#39;injection avant le remplissage des aiguilles fraîches afin de sédimenter toutes les petites particules ou des cristaux. Aussi utile est la pratique de l&#39;injection uniquement avec colorant vital. Vérifiez la technique d&#39;injection par la fertilisation des œufs injectés et non injectées. Enfin, la consultation avec un collègue expérimenté peut être utile pour améliorer la technique d&#39;injection. Pour contrôler les effets hors-cible un deuxième non-chevauchement des MO et de sauvetage avec un ARNm modifié qui est pas reconnu par les OM peut fidèlement exclure des effets phénotypiques non spécifiques à Ciona. Microinjection: signification et les limites Microinjection dans Ciona a été utilisé pour générer le premier plan pour un réseau de régulation génique de l&#39; embryon entier (GRN) dans un chordés 11. Cependant, en dépit d&#39;une telle remaréalisation rkable, microinjection dans des embryons Ciona a ses limites, en raison de la taille relativement petite (0,14 mm de diamètre) des œufs Ciona. Par rapport à celles d&#39;autres espèces de chordés où l&#39; ADN étranger / ARNm est introduit par microinjection, les œufs Ciona sont relativement difficiles à manipuler et le taux d&#39;embryons Ciona injectés par expérience reste faible (en moyenne 30 à 50 embryons par expérience), ce qui empêche des analyses quantitatives. Néanmoins, pour les facteurs maternels perturbatrices dans Ciona, microinjection de MOs est la méthode de choix aussi d&#39;étudier leur implication dans l&#39; apparition zygotique du développement de la cellule 16 à 32 stades 15. En outre, il est possible cependant beaucoup plus difficile de micro-injection blastomères individuels jusqu&#39;au stade 16-32 cellulaire. Enfin, la microinjection reste la technique la plus efficace pour générer des embryons transgéniques (par l&#39; ARNm ou l&#39; injection d&#39;ADN) dans les espèces d&#39;ascidies autres que Ciona, pour lequel entièrement optimiprotocoles d&#39;électroporation zed n&#39;existent pas. Électroporation: signification et les limites Pour surmonter le faible nombre et d&#39; autres contraintes de microinjection, la plupart de la communauté Ciona a utilisé électroporation d&#39;ADN plasmidique depuis qu&#39;il a été élaboré et publié en tant que protocole optimisé et normalisé par Zeller et al. En 2004 9. En effet, des milliers d&#39;embryons Ciona transgéniques peuvent être générés en une heure jusqu&#39;à 500 embryons électroporées simultanément dans une cuve à l&#39;aide d&#39;une seule impulsion de 50 V de 16 ms. L&#39;approche consistant à générer un nombre considérable d&#39;embryons transgéniques est encore unique parmi les organismes modèles des chordés. Cela a conduit Ciona être rapidement reconnu comme un système de modèle puissant pour réaliser in vivo l&#39; analyse des potentiels régions cis et -Informations règlementaires localisation cellulaire / subcellulaire, comme illustré ici. Bien que electroporatidans zygotes Ciona a fondamentalement révolutionné le domaine de la recherche chordés GRN, la technique néanmoins fait face à certaines limites. Tout d&#39; abord, les plasmides sont transitoirement introduits dans des embryons Ciona et sont très probablement hérité sous forme de tableaux extrachromosomiques, ce qui rend la stabilité de l&#39; ADN plasmidique électroporation spéculative. En outre, il est très difficile, voire impossible, de contrôler les copies de plasmides par électroporation qui seront absorbés par zygote, entraînant ainsi des variations phénotypiques. Un autre problème qui rend difficile d&#39;interpréter les résultats d&#39;électroporation est un phénomène que nous appelons mosaïcisme. ADN plasmidique par électroporation peut être pris en des positions différentes de l&#39;embryon au stade d&#39;une cellule; qui détermine qui et combien de quarts du zygote recevront plasmidique être héritée par les blastomères descendants. Ces variations font clairement l&#39;interprétation des effets quantitatifs plus difficile. Cependant, la plupart des problèmes qui viennent avec electroporation variabilité sont résolus par une quantité appropriée d&#39;échantillons biologiques, avec comptage et des statistiques de LacZ (ou GFP) des cellules positives, ce qui est facile à obtenir en un seul lot. Polyvalence et le potentiel de l&#39;électroporation pour le génie génétique Électroporation permet éventuellement pour le dépistage à mi-débit des potentiels régions cis et -Informations règlementaires analyses quantitatives de la fonction des gènes , une fois clonées dans reporter ou d&#39; expression des plasmides. En raison du génome Ciona compact, l&#39; identification et le clonage des régions régulatrices potentielles est assez simple 3. Une stratégie pour l&#39; utilisation de la richesse des données de la communauté est mise en évidence dans la figure 2A. Clonage de rapporteurs et de gènes codant des plasmides est en outre facilitée par la génération de Ciona adapté, GATEWAY compatibles suites de vecteurs 19 et une longueur compatible ORF de la bibliothèque 18. Les deux outils sont disponibles à la communauté etpermettre efficace restriction recombinaison, sans enzyme des conducteurs de régulation et les régions codantes, comme représenté sur la figure 2B. Au cours des dernières années, l&#39; électroporation a été adapté avec succès pour réaliser la manipulation génétique des tissus ciblés avec des plasmides qui expriment gènes outils d&#39;édition tels que les composants CRISPR / cas9 sous le contrôle des pilotes spécifiques du tissu 21,22. Ces approches vont rapidement progresser notre compréhension de la dynamique des GRNS et les mécanismes de signalisation potentiellement conservés, y compris les codes de facteurs de transcription impliqués dans la formation des tissus et la sortie progressive de la pluripotence. En outre, déficitaire tissu-spécifique ou gain de fonction des approches (par CRISPR / cas9 ou par surexpression) en utilisant électroporation seront déterminants pour étudier orthologues Ciona de gènes associés à des maladies humaines. En effet, les catalogues pour orthologues Ciona de gènes de maladies humaines et leur longueur ORF codant clones sont facilement available pour l&#39; analyse en Ciona 1 8. En raison du génome large duplications chez les vertébrés, la plupart des gènes humains possèdent des paralogues fonctionnellement redondantes qui compliquent l&#39; analyse de la fonction génique 1. Ciona étant un système plus simple , avec l&#39;agencement typique des tissus cordé dans les larves doivent découvrir des rôles fondamentaux de ces gènes importants, souvent fonctionnellement conservés.

Récemment, la séquence du génome et de répertoires de gènes transcrits sont devenus accessibles dans un certain nombre d&#39;organismes modèles. Détermination de gènes liens fonctionnels, cependant, et la façon dont ces connexions sont câblés dans l&#39;ADN pour exécuter une activité de transcription à travers le temps et l&#39;espace embryonnaire, reste un défi majeur, en particulier chez les vertébrés. La complexité des interactions réglementaires et de la complexité des génomes 1,2, notamment chez les vertébrés, ralentissent les analyses fonctionnelles efficaces, en particulier au niveau de l&#39; ADN in vivo. En effet, aucun GRN est actuellement analysée de la fécondation à l&#39;état final, terminale différenciée de l&#39;organisme en développement. L&#39;ascidie C. intestinalis représente un organisme modèle où une telle complète GRN analyse peut être possible. Il a un génome non dupliquées typique des invertébrés avec peu de redondance génique. Vertébrés, en revanche ont subi deux séries de duplications que HAVe généré familles de gènes plus grandes et la diversification fonctionnelle, mais aussi la redondance entre les paralogues. Les séquences -Informations règlementaires cis compactes (les unités de commande de GRNS) de C. intestinalis, et une lignée embryonnaire invariables avec quelques cellules rappellent C. elegans. En outre, sa position phylogénétique unique en tant que groupe soeur invertébrés aux vertébrés dans les chordés permet l&#39; observation du développement, à une résolution cellulaire, du plan de corps de chordés formant 3-6. La question clé qui assure le succès futur de la génomique fonctionnelle dans des organismes modèles est la génération d&#39; un grand nombre d&#39;embryons pour quantitatives perturbations in vivo. Le développement de la technique de micro - injection dans les œufs Ciona 7, et la possibilité d&#39;obtenir rapidement de nombreux animaux transgéniques transitoirement par électroporation in vivo dans des centaines de Ciona zygotes 8,9 a été une percée dans <em&gt; Ciona génomique fonctionnelle. Ici, nous présentons d&#39;abord la technique de microinjection plus laborieuse pour le ciblage des gènes individuels qui reste la méthode de choix pour morpholino (MO) knockdown du gène médiée, notamment des transcriptions maternelles. oligos MO généralement cibler l&#39;ATG initiateur ou les sites d&#39;épissage de l&#39;ARN et interfèrent avec la traduction des protéines. Nous montrons ensuite comment électroporation dans les œufs fécondés de Ciona permet à un grand nombre d&#39;embryons à analyser de façon quantitative, ouvrant ainsi des voies d&#39;analyse efficace des exhausteurs in vivo et d&#39;intensité forte tissu-spécifique ou perte d&#39;approches de fonction, avec le possibilité pour les manipulations et analyses simultanées. Nous démontrons aussi comment Ciona outils communautaires sont utilisés pour la prévision silico des régions régulatrices et le clonage efficace des pleins cadres de lecture ouverts (ORF) dans des vecteurs d&#39;expression. Enfin, nous démontrons différentielles subcellulaire des localisations marquées par fluorescenceou des protéines marquées sur la surexpression par électroporation.

<table><tbody><tr><td>Laboratoire avec température constante (~18 &deg ; C)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Pour le travail</td></tr> de <tr><td>l’embryon Ciona intestinalis adultes</td><td>UPMC - Station Biologique, Roscoff, France</td><td></td><td>Pour la collecte des gamètes</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>CaCl2x2H2O</td><td>Roth</td><td>A119.1</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>MgCl2x6H2O</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>MgS04x7H2O</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>6885.1</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>Hepes&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td>Pour ASWH</td></tr><tr><td>Thioglycolate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>MZ-6</td><td>pour la déchorionation</td></tr><tr><td>pronase&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T0632-100G</td><td>Pour la déchorionation</td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td>Pour l’électroporation</td></tr><tr><td>de l’ADN plasmidique (préparation >1&micro ; g/&micro ; l)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.100</td><td>Pour l’électroporation ou la microinjection</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>tout fournisseur</td><td></td><td>Pour le revêtement des boîtes de culture embryonnaire</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en plastique</td><td>VWR</td><td>612-2079</td><td>Enduites de 1 % d’agarose dans ASWH, recouvertes d’ASWH</td></tr><tr><td>Petits ciseaux</td><td>tout fournisseur</td><td></td><td>Pour la dissection des gamètes</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>6771.1</td><td>Pour l’activation de la solution de déchorionation</td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>5429.3</td><td>1 M pH 9,5, pour l’activation des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td>Traité par immersion dans l’eau du robinet pendant au moins 12 heures</td></tr><tr><td>Centrifugeuse manuelle</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>1011</td><td>Utilisation de tubes à centrifuger en verre</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>T3406-250EA</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubes Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur carré</td><td>Bio Rad Gene Pulser Xcell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation 4 mm</td><td>Eurogentec</td><td>CE-0004-50</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>Sto Premium</td><td>PR248212600</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>VWR</td><td>ECN 613-1551</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G6257-10ML</td><td>Pour fixation dans LacZ coloration</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P6148-500G</td><td>Pour la fixation d’échantillons fluorescents</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>Pour le montage d’échantillons fluorescents</td></tr><tr><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &szlig ;-D-Galactopyranoside)</td><td>Roth</td><td>2315.2</td><td>Substrat LacZ ; stock dans 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide)</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6&#8226 ; 3H2O</td><td>Merck</td><td>4984</td><td>Pour tampon de coloration LacZ</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Merck</td><td>4973</td><td>Pour tampon de coloration</td></tr><tr><td>LacZ Na22HPO4</td><td>Roth</td><td>4984.2</td><td>Pour PBT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Pour PBT</td></tr><tr><td>Tween&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>SLBJ5103V</td><td>pour</td></tr><tr><td>l’huile minérale</td> PBT <td>Sigma</td><td>M8410</td><td>a testé la culture embryonnaire</td></tr><tr><td>Green Vital Dye</td><td>Fast Green Sigma&nbsp ;</td><td>F7251</td><td>pour micro-injection ; 10&micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette (Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modèle P-97</td><td>Pour tirer les aiguilles d’injection</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté GC100TF-10</td><td>Harvard Apparatus Ltd. UK</td><td>30-0038</td><td>1,0 mm de diamètre extérieur x 0,78 mm de diamètre intérieur, contenant du filament, pour micro-injection</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MWS-2</td><td>Système hydraulique à huile à trois axes ; pour un mouvement fin 3D pendant l’injection</td></tr><tr><td>Porte-injection</td><td>Narishige</td><td>1M-H1</td><td>Pour tenir les aiguilles d’injection, tout le système rempli d’huile minérale</td></tr><tr><td>Seringue en verre Walter</td><td>Graf & Co GmbH & Co. KG&nbsp ;</td><td>N° 95199.10427A4</td><td>10 ml FortunaOptima ; rempli d’huile minérale, pour le réglage fin de la pression de micro-injection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Morpholinos&nbsp ;</td><td>GeneTools LLC, Pilomath, OR, États-Unis</td><td></td><td>Injection à 0,25-0,5 mM</td></tr><tr><td>ARNm coiffé</td><td>Ambion mMessage mMashine kit</td><td></td><td>Injection à 0,05-0,5&micro ; g/&micro ; l&nbsp ;</td></tr><tr><td>Injection d’ADN</td><td></td><td></td> plasmidique <td>à 20 ng/&micro ; l</td></tr><tr><td>Kit de clonage de recombinaison</td><td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td><td>11789-013</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonage de recombinaison</td><td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA tag</td><td>anticorps abcam</td><td>ab9110</td><td>pour l’immunofluorescence, utiliser 1:400 dans 3 % BSA/PBT</td></tr><tr><td>TRITC chèvre anti-lapin</td><td>anticorps Jackson</td><td>111-025-144</td><td>pour l’immunofluorescence, utiliser 1:300 dans 3 % BSA/PBT</td></tr></tbody></table>

la micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; ciona intestinalis</em

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Les organismes modèles simples sont essentiels pour les études in vivo des processus de développement et de différenciation cellulaire. Actuellement, la distance évolutive par rapport à l’homme des systèmes modèles conventionnels d’invertébrés et la complexité des génomes des vertébrés sont des défis critiques pour la modélisation des conditions normales et pathologiques humaines. Le chordé Ciona intestinalis est un chordé invertébré qui a émergé d’un ancêtre commun avec les vertébrés et peut représenter des caractéristiques à l’interface entre les invertébrés et les vertébrés. Un plan corporel commun avec une composition cellulaire et génomique beaucoup plus simple devrait dévoiler des liens de réseau de régulation des gènes (GRN) et des lectures génomiques fonctionnelles expliquant les phénomènes de la condition des vertébrés. Le génome compact de Ciona, une lignée embryonnaire fixe avec peu de divisions et de grandes cellules, combiné à des outils communautaires polyvalents, favorise des analyses fonctionnelles génétiques efficaces dans cet organisme. Nous présentons ici plusieurs méthodes cruciales pour cet organisme modèle prometteur, qui appartient au groupe frère le plus proche des vertébrés. Nous présentons des protocoles pour la transgenèse transitoire par électroporation, ainsi que l’inactivation de gènes médiée par la microinjection, qui fournissent ensemble les moyens d’étudier la fonction des gènes et les éléments régulateurs génomiques. Nous étendons nos protocoles pour fournir des informations sur la façon dont les bases de données communautaires sont utilisées pour la conception in silico d’expériences de régulation ou de fonctionnalité génique. Un exemple d’étude démontre comment de nouvelles informations peuvent être obtenues sur l’interaction et la quantification de facteurs neuronaux sélectionnés conservés entre Ciona et l’homme. De plus, nous montrons des exemples de localisation subcellulaire différentielle dans les cellules embryonnaires, suite à l’électroporation de l’ADN chez Ciona zygotes. Enfin, nous discutons du potentiel de ces protocoles à être adaptés à l’interférence génique spécifique des tissus avec les méthodes émergentes d’édition de gènes. Les approches in vivo de Ciona surmontent les principales lacunes des organismes modèles classiques dans la quête de la découverte des mécanismes conservés dans le programme de développement des chordés, pertinents pour la recherche sur les cellules souches, la découverte de médicaments et l’application clinique ultérieure.

Nous présentons transgénèse transitoire et knockdown de gènes dans Ciona intestinalis, un groupe de soeur chordés aux vertébrés, en utilisant des techniques de microinjection et électroporation. Ces méthodes facilitent la génomique fonctionnelle dans cet invertébré simple qui comporte des caractéristiques rudimentaires de vertébrés, y compris notochorde et la tête épithéliums sensorielle, et de nombreux orthologues de gènes de maladies humaines associées.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Le but général des techniques de transfection transitoire chez les embryons de Ciona est d'étudier la régulation et la fonction des gènes nécessaires à la formation de larves de type têtard, en tirant parti de leur lignée cellulaire invariante et de leur génome d'invertébré compact, afin de mieux comprendre les origines des chordés invertébrés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique moléculaire, telles que les mécanismes conservés du programme de développement des chordés, qui présentent un intérêt pour la recherche sur les cellules souches et la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, grâce à l'électroporation des embryons, il est possible de manipuler des centaines, voire des milliers d'embryons synchronisés en une seule journée.En général, les personnes novices avec cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la déchorionation délicate de l'embryon et du fait qu'il est difficile de développer une technique d'injection microscopique efficace. Commencez par disséquer des adultes de Ciona dans une chambre d'embryons refroidie à 18 degrés Celsius. Utilisez de petites ciseaux pour pratiquer une incision à l'extrémité opposée des siphons et sur le côté du siphon le plus court, sous lequel se trouvent l'oviducte et le canal spermatique.Allongez l'incision pour exposer l'oviducte. Ensuite, utilisez la pointe des ciseaux pour pratiquer une incision précise dans l'oviducte. Appuyez doucement sur l'oviducte avec les ciseaux fermés et retirez les œufs.Laisser les œufs tomber directement dans une plaque à six puits contenant de l'eau de mer artificielle avec du HEPES. Utiliser une pipette de Pasteur pré-rincée avec du ASWH pour recueillir et transférer les œufs restants. Pour recueillir le sperme, couper le canal spermatique avec les ciseaux, puis utiliser une pipette de Pasteur distincte pour recueillir le sperme concentré et le transférer dans un tube de 1,5 millilitre.Activer les spermatozoïdes en combinant un millilitre de ASWH et 50 microlitres de Tris dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, ajouter 20 microlitres de spermatozoïdes concentrés, fermer le bouchon et mélanger délicatement en retournant le tube ou à l’aide d’une pipette de Pasteur. Puis, ajouter de 100 à 200 microlitres de la solution de spermatozoïdes activés dans chaque puits contenant les œufs, et bien mélanger par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette, de sorte que les œufs flottent dans le milieu.Commencez la décoquillage en collectant les zygotes et en les dispensant dans des tubes en verre. À l’aide de la centrifugeuse manuelle, centrifugez les zygotes à douze cents fois G pendant environ 20 secondes, puis arrêtez lentement la centrifugeuse. Retirez l’ASWH des culots à l’aide d’une pipette de Pasteur.Ajoutez quatre millilitres de solution de déchorionation activée au culot dans chaque tube. Suspendez les zygotes en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette Pasteur traitée à l’eau du robinet, munie d’une petite poire en caoutchouc. La solution doit devenir jaunâtre après 1 à 3 minutes.Pendant la déchorionation, prélevez une petite aliquote de la suspension de déchorionation à l’aide de la pipette Pasteur. Déposez une goutte sur une lame et observez-la au microscope stéréoscopique. Aspirez et expulsez la suspension de zygotes plusieurs fois avec la pipette et vérifiez la lame toutes les 20 à 30 secondes.D'abord, les cellules folliculaires se détachent, puis le chorion devient jaune et opaque, et enfin, il se détache des zygotes. Les zygotes déchorionés roses couleront au fond du tube en verre. Une fois que plus de 50 % des zygotes sont déchorionés, remplissez le tube avec de l'ASWH.Centrifuger très doucement pendant environ 10 à 15 secondes, juste assez pour faire sédimenter les zygotes déchorionés. Arrêter lentement la centrifugation. Retirer presque tout le liquide du tube en verre, y compris tout matériau flottant, et le remplacer par du ASWH.Pipetez lentement de haut en bas pour laver, puis centrifugez délicatement comme précédemment. Lavez à nouveau jusqu'à ce qu'aucun débris de chorioine ne reste. Faites sédimenter par gravité le lavage vers les zygotes déchorionés dans des tubes de 1,5 millilitre silanisés.Après la sédimentation, retirez l'ASWH jusqu'au repère de 100 microlitres sur le tube. Utilisez maintenant une pipette de Pasteur pour ajouter 250 microlitres d'ADN préparé au préalable en solution de mannitol dans un tube de zygotes. Mélangez délicatement, puis transférez immédiatement le mélange dans une cuvette d'électroporation de quatre millimètres.Placez la cuvette dans le support d'électroporation et appliquez une seule impulsion de 16 millisecondes à 50 volts. Ensuite, retirez les zygotes de la cuvette à l’aide de la même pipette de Pasteur et expulsez-les dans une boîte de culture contenant du milieu ASWH frais et filtré. Agitez la boîte pour répartir les zygotes.Rincez la pipette dans un bécher contenant de l'ASWH, puis passez à l'échantillon suivant. Après avoir électroporé tous les zygotes, cultivez les zygotes à une température de 15 à 20 degrés Celsius. Installez le micromanipulateur dans une pièce refroidie à 18 degrés Celsius.Connectez le tube en plastique et le porte-aiguille à une seringue en verre de 10 millilitres remplie d'huile minérale. Remplissez le tube et le porte-aiguille d'huile par aspiration, puis expulsez toutes les bulles d'air. Insérez l'aiguille d'injection contenant 0,5 microlitre de solution d'injection avec du colorant vert vital dans le porte-aiguille.Et positionnez le support sur le micromanipulateur. Ajustez le porte-aiguille afin qu’il se déplace en ligne droite selon un angle de 45 degrés par rapport à la surface. Orientez les œufs déchorionés dans une petite boîte de culture recouverte d’agarose, le long d’une encoche, de manière à pouvoir les injecter un par un sous le microscope stéréo.Si nécessaire, cassez la pointe de l'aiguille en poussant doucement l'aiguille contre un morceau de lame de verre, placé sur l'agarose. Appliquez une légère pression pour vérifier que la pointe de l'aiguille est ouverte. Injectez les œufs non fécondés un par un, en introduisant d'abord l'aiguille dans l'œuf, puis en aspirant légèrement pour rompre la membrane de l'œuf.Ensuite, injectez la solution d'injection verte au milieu de l'œuf, jusqu'à un maximum du tiers du diamètre de la cellule. Après avoir injecté tous les œufs, retirez l'aiguille, transférez les œufs injectés non fécondés dans une nouvelle boîte de culture et incubez-les à une température de 15 à 18 degrés Celsius jusqu'à la fécondation. L'injection microscopique a été utilisée pour étudier la régulation du facteur de transcription de la myéline de Ciona intestinalis, ou MyT, au stade de gastrula des embryons de Ciona.Suivi par hybridation in situ, l'expression endogène est observée chez les précurseurs de la plaque neurale de la sixième rangée chez le type sauvage. L'injection microscopique de morpholinos visant à inhiber des facteurs embryonnaires précoces, tels que la boîte Forkhead A, un facteur de transcription, élimine l'expression globale de MyT. En revanche, l'expression de MyT est activée de façon ectopique lors de la répression de nodal, suggérant que nodal réprime normalement l'expression de MyT dans ces précurseurs du cordon nerveux latéral.Le facteur de transcription GATAa a été marqué par une étiquette Venus et électroporé dans des blastomères ectodermiques avec un promoteur pfog. Comme on le voit ici, GATAa est principalement localisé dans les noyaux, ce qui est attendu pour un facteur de transcription. Alors que l'expression de Venus est ubiquitaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une transfection transitoire par électroporation dans des zygotes de Ciona synchronisés, comment manipuler les embryons déchorionés fragiles et comment trouver l'angle correct pour la micro-injection. Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie vers la génomique fonctionnelle. Elles permettent d'explorer la fonction des gènes, les réseaux régulateurs géniques et la conservation de modules développementaux, importants pour la formation des tissus également chez l'homme.

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