La micro-injection et l'électroporation d'embryons dans le chordés Ciona intestinalis

L’objectif global des techniques de transfection transitoire chez les embryons de Ciona est d’étudier la régulation des gènes et la fonction nécessaires pour former des larves semblables à des têtards, en tirant parti de leur lignée cellulaire invariante et de leur génome compact des invertébrés, afin de mieux comprendre les origines des invertébrés chordés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique moléculaire, telles que les mécanismes conservés du programme de développement des chordés qui sont pertinents pour la recherche sur les cellules souches et pour la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’avec l’électroporation d’embryons, vous pouvez traiter des centaines ou des milliers d’embryons synchronisés en une journée.

Généralement, les individus novices dans cette méthode auront du mal, en raison de la déchorionisation de l’embryon fragile, et parce qu’il est délicat de développer une technique de micro-injection efficace. Commencez par disséquer des adultes de Ciona dans une salle d’embryons refroidie à 18 degrés Celsius. Utilisez de petits ciseaux pour faire une incision à l’extrémité opposée des siphons et sur le côté du siphon le plus court, sous lequel passe l’oviducte et le canal spermatique.

Allongez l’incision pour exposer l’oviducte. Ensuite, utilisez la pointe des ciseaux pour faire une incision précise dans l’oviducte. Appuyez doucement sur l’oviducte avec les ciseaux fermés et retirez les œufs.

Laissez les œufs tomber directement dans une assiette à six puits contenant de l’eau de mer artificielle avec HEPES. À l’aide d’une pipette pasteure, préalablement rincée avec de l’ASWH, pour recueillir et transférer les ovules restants. Pour collecter des spermatozoïdes, coupez le canal spermatique avec les ciseaux, puis utilisez une pipette pasteur séparée pour recueillir les spermatozoïdes concentrés et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre.

Activez les spermatozoïdes en combinant un millilitre d’ASWH et 50 microlitres de Tris dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de sperme concentré, fermez le capuchon et mélangez doucement en inversant le tube ou à l’aide d’une pipette pasteur. Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de la solution de spermatozoïdes activés dans chaque puits d’ovules, et mélangez bien en pipetant de haut en bas, de sorte que les ovules flottent dans le milieu.

Commencez la déséchorionation en collectant les zygotes et en les distribuant dans des tubes de verre. Avec la centrifugeuse à main, faites tourner les zygotes à douze cents fois G pendant environ 20 secondes, puis arrêtez lentement la centrifugeuse. Retirez l’ASWH des granulés à l’aide d’une pipette pasteur.

Ajoutez quatre millilitres de solution de déchorionation activée à la pastille dans chaque tube. Suspendez les zygotes en les pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette pasteur traitée à l’eau du robinet, surmontée d’une petite poire en caoutchouc. La solution devrait devenir jaunâtre après 1 à 3 minutes.

Lors de la déchorionnation, prélever une petite aliquote de la suspension déchorionnante à l’aide de la pipette pasteur. Déposez une goutte sur une lame et observez-la sous le microscope à dissection. Pipetez la suspension zygote de haut en bas et vérifiez la lame toutes les 20 à 30 secondes.

D’abord, les cellules folliculaires se détachent, puis le chorion devient jaune et opaque, et enfin, il se détache des zygotes. Les zygotes déchorionnés roses couleront au fond du tube de verre. Une fois que plus de 50 % des zygotes sont déchoionnés, remplissez le tube d’ASWH.

Centrifuger très doucement pendant environ 10 à 15 secondes, juste assez pour sédimenter les zygotes déchorionnés. Arrêtez lentement la centrifugeuse. Retirez presque tout le liquide du tube en verre, y compris tout matériau flottant, et remplacez-le par ASWH.

Pipetez lentement de haut en bas pour laver, puis centrifugez doucement comme précédemment. Lavez à nouveau jusqu’à ce qu’il ne reste plus de débris de chorion. Sédimentation gravitaire le lavage aux zygotes déchorionnés dans des tubes siliconés de 1,5 millilitre.

Après la sédimentation, retirez l’ASWH jusqu’à la marque de 100 microlitres sur le tube. Utilisez maintenant une pipette pasteur pour ajouter 250 microlitres d’ADN préalablement préparé dans une solution de mannitol dans un tube de zygotes. Mélangez délicatement et transférez immédiatement le mélange dans une cuvette d’électroporation de quatre millimètres.

Placez la cuvette dans le support d’électroporation et donnez une impulsion unique de 16 millisecondes à 50 volts. Retirez ensuite les zygotes de la cuvette à l’aide de la même pipette pasteur et expulsez-les dans une boîte de culture contenant de l’ASWH frais et filtré. Agitez le plat pour étaler les zygotes.

Rincez la pipette dans un bécher d’ASWH, puis passez à l’échantillon suivant. Après avoir écroporé tous les zygotes, cultivez les zygotes à 15 à 20 degrés Celsius. Installez le micro-manipulateur dans une pièce refroidie à 18 degrés Celsius.

Connectez le tube en plastique et le porte-aiguille à une seringue en verre de 10 millilitres remplie d’huile minérale. Remplissez le tube et le porte-aiguille avec de l’huile et expulsez les bulles d’air. Insérez l’aiguille d’injection contenant 0,5 microlitre de solution d’injection avec un colorant vital vert dans le porte-aiguille.

Et positionnez le support sur le micro-manipulateur. Ajustez le porte-aiguille de manière à ce qu’il se déplace le long d’une ligne droite à un angle de 45 degrés par rapport à la surface. Orientez les œufs déchorionnés dans une petite boîte de culture enrobée d’agarose le long d’une indentation, de sorte que les œufs puissent être injectés un par un sous le microscope de dissection.

Si nécessaire, cassez la pointe de l’aiguille en poussant doucement l’aiguille contre un morceau de lamelle en verre, placé sur l’agarose. Appliquez une légère pression pour vérifier que la pointe de l’aiguille est ouverte. Injectez les ovules non fécondés un par un, en introduisant d’abord l’aiguille dans l’œuf et en aspirant légèrement pour briser la membrane de l’œuf.

Ensuite, injectez la solution d’injection verte au milieu de l’œuf, jusqu’à un tiers maximum du diamètre de la cellule. Après avoir injecté tous les œufs, retirez l’aiguille, transférez les œufs injectés et non fécondés dans une boîte de culture fraîche et incubez à 15 à 18 degrés Celsius jusqu’à la fécondation. La micro-injection a été utilisée pour étudier la régulation du facteur de transcription de la myéline de Ciona intestinalis ou MyT au stade gastrula des embryons de Ciona.

Surveillée par hybridation in situ, l’expression endogène est observée dans la sixième rangée des précurseurs de la plaque neurale chez le type sauvage. La micro-injection de morpholinos pour éliminer les facteurs embryonnaires précoces, tels que la boîte A de Forkhead, un facteur de transcription, élimine l’expression globale de MyT. À l’inverse, l’expression de MyT est activée de manière ectopique lors de la régulation négative du ganglion, ce qui suggère que le nodal réprime normalement l’expression de MyT dans ces précurseurs de la moelle nerveuse latérale.

Le facteur de transcription GATAa a été marqué avec une étiquette de Vénus et électroporé en blastomères ectodermiques avec un pilote pfog. Comme on le voit ici, GATAa est principalement localisé dans les noyaux, comme prévu pour un facteur de transcription. Alors que l’expression de Vénus est omniprésente.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une transfection transitoire par électroporation dans des zygotes Ciona synchronisés, de la façon de manipuler les embryons déchorionnés fragiles et de la façon de trouver le bon angle de micro-injection. Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie à la génomique fonctionnelle. Explorer la fonction des gènes, les réseaux de régulation des gènes et conserver les modules de développement, importants pour la formation des tissus également chez l’homme.