Essai d’invasion de cellules tumorales : une méthode 3D in vitro basée sur une matrice native pour évaluer les interactions entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses

- Pour commencer le test, commencez par pipeter une suspension de cellules de fibroblastes complétée par de l’acide ascorbique dans une plaque à puits et incuber. L’acide ascorbique augmente la prolifération des fibroblastes. Il stimule également la sécrétion de composants ECM natifs, intégrant ainsi les cellules proliférantes dans l’épaisse matrice extracellulaire.

Libérez doucement la matrice de la surface de la plaque et laissez-la flotter dans le support. La matrice se contracte et s’épaissit avec plus de dépôt et de remodelage de la matrice, donnant naissance à un tissu ressemblant au derme natif. Étalez la matrice sur un maillage poreux. Ensuite, ensemencez les cellules cancéreuses épithéliales sur la matrice et incubez pour que les cellules se stabilisent et se fixent.

Transférez l’ensemble sur une plate-forme grillagée pré-assemblée dans un plat. Ajoutez un média pour compléter uniquement la couche inférieure de la matrice afin de générer une interface air-liquide pour les cellules situées au-dessus. Pendant la culture, l’interface favorise la prolifération et la différenciation des cellules tumorales. Les cellules sécrètent également des protéases qui dégradent l’ECM, facilitant leur migration et leur invasion dans la matrice.

Dans le protocole suivant, nous ferons la démonstration d’un test d’invasion utilisant des cellules de carcinome épidermoïde cutané sur une matrice native dérivée de fibroblastes stromaux primaires.

- Commencez par ensemencer 200 000 fibroblastes par puits dans des plaques à 6 puits dans un milieu de fibroblastes complété par de l’acide L-ascorbique 2-phosphate fraîchement préparé. Remplissez à nouveau les cellules tous les 2 à 3 jours avec 2 à 5 millilitres de milieu frais. Une épaisse couche de cellules incrustées dans la matrice extracellulaire, visible à l’œil nu, se formera au bout de 6 semaines. Selon les cellules utilisées, la matrice visible peut se former tôt ou tard et peut commencer à se détacher de la parabole, comme on le voit ici.

Pour libérer cette couche de la plaque de culture tissulaire, grattez doucement la circonférence de la matrice avec une pointe de micropipette de 1 millilitre, puis poussez les bords de la matrice vers le centre du puits. Les cellules et la matrice native doivent se détacher facilement de la surface de la plaque et flotter maintenant dans le support.

Répartissez la matrice native à l’intérieur du support pour éviter qu’elle ne se replie sur elle-même. Laissez la matrice native flotter et se remodeler pendant 5 jours, en continuant à changer de support tous les 2 à 3 jours. En raison de la résistance à la traction et du remodelage intrinsèque, la matrice se contractera considérablement et se réduira à une matrice native plus petite mais plus épaisse, moment auquel elle sera prête à être utilisée pour l’essai d’invasion.

Pour le test d’invasion, utilisez d’abord une pince émoussée pour transférer doucement la matrice native sur un filet en nylon. Une fois sur le net, utilisez une pointe de micropipette de 1 millilitre et une pince émoussée pour étaler doucement la matrice afin qu’elle repose aussi à plat que possible. Ensuite, étalez une petite quantité de vaseline sur une extrémité d’un cylindre clonal stérile par matrice. Ensuite, placez les cylindres sur les matrices natives, côté vaseline vers le bas, pour assurer une étanchéité parfaite entre la matrice native et les anneaux clonaux.

Maintenant, ajoutez 250 000 cellules de carcinome épidermoïde cutané, ou SCC, dans un milieu de croissance kératinocytaire dans les cylindres. Une fois que les cellules cutanées du CSC se sont installées sur la matrice native, retirez les cylindres. Ensuite, soulevez le filet de nylon, la matrice native et les cellules SCC cutanées jusqu’à l’interface air-liquide et sur un support en treillis métallique en acier inoxydable plié.

Enfin, ajoutez un milieu de croissance de kératinocytes complété par de l’acide ascorbique jusqu’à ce que le niveau du milieu touche le fond de la matrice native, en changeant le milieu tous les 2 à 3 jours et en récoltant à 7 et 14 jours après l’ensemencement des cellules cutanées du SCC.

• Invasion Protocol – A method used to study tumor cell invasion in a laboratory setting.
• Tumor Cell Invasion – The process by which cancer cells migrate from the primary site and invade surrounding tissues.
• Primary Tumor Cell Culture Protocol – An established method for growing primary tumor cells in vitro.
• Cell Invasion Assay – Laboratory test designed to quantify the invasion capabilities of cancer cells.
• Extracellular Matrix (ECM) – A network of non-cellular components present within all tissues and organs.

• Introduce Invasion Protocol – A laboratory method investigating tumor cell behaviors (e.g., invasion protocol).
• Key Concepts – Review components of cell invasion, such as tumor cells and ECM (e.g., ECM).
• Underlying Mechanisms – Discuss how tumor invasion occurs in the broader context of cell biology.
• Connect to Experiment – Tie the theory to cancer invasion assays and our protocol.

• What is the Invasion Protocol and how to carry out a Tumor Cell Invasion assay?
• How is a Primary Tumor Cell Culture Protocol executed?
• What role does the Extracellular Matrix (ECM) play in Tumor Cell Invasion?

• Practical Applications – Invasion protocols aid in cancer research (e.g., Oncology).
• Industry Impact – Improve treatment strategies in healthcare (e.g., Cancer therapy).
• Societal Importance – Understanding tumor invasion can help address the global cancer burden.
• Link to Scientific Advancements – Ongoing research enhances our grasp of tumor cell invasion and treatment options.