Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

La capacité d’imager le système vasculaire cérébral et d’enregistrer la dynamique du flux sanguin dans le cerveau intact de rongeurs vivants est une technique puissante qui peut être appliquée à l’étude de l’ischémie cérébrale ou de la physiologie cérébrale normale. Ici, nous montrerons comment utiliser deux photomicroscopies pour imager la dynamique du flux sanguin dans le néocortex de souris vivantes à l’aide de colorants fluorescents injectés dans la veine de la queue. Cette technique a été développée à l’origine par David Kleinfeld dans Winfred Dank.

Bonjour, je suis Ricardo Mota du laboratoire de Carlos Porter Cayo au département de neurologie de l’Université de Californie à Los Angeles. Dans une vidéo précédente, nous vous avons montré la méthode d’implantation d’une fenêtre crânienne pour des expériences d’imagerie chronique in vivo. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure d’imagerie de la dynamique du flux sanguin dans le cortex cérébral à travers une fenêtre crânienne.

Cette préparation est très utile car elle permet d’imager profondément à l’intérieur du cerveau à l’aide de la microscopie laser à photons. Alors, commençons. Afin d’imager le système vasculaire cérébral, les animaux doivent être injectés par voie intraveineuse avec un colorant fluorescent.

Nous utilisons des colorants conjugués Dexter parce que le moty dextron empêche le colorant de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s’échapper des vaisseaux sanguins. Les souris sont anesthésiées avec de l’isolin de fluor, 4 % pour l’induction et 1,5 à 2 % lors de l’injection. Ensuite, la queue est désinfectée avec trois écouvillons d’alcool à 70 % avec une aiguille de calibre 26, 75 à cent microlitres d’une solution à 5 % de R domine Dextran dissous dans une solution saline est injectée par la veine de la queue.

À mi-chemin le long de la tige de la queue, les animaux peuvent être imagés immédiatement après l’injection dans la veine de la queue jusqu’à ce que la matrice soit excrétée dans l’urine, qui deviendra rose si vous utilisez le colorant ERO domine Environ deux heures après l’injection de colorant fluorescent Dexter, la souris est anesthésiée avec du fluor. Encore une fois, 4 % pour l’induction, un à 1,5 % pour l’imagerie. La souris est solidement fixée à l’aide de la barre de titane à la platine du microscope, qui contient un coussin chauffant thermorégulé pour garder l’animal au chaud.

Une pommade pour les yeux est appliquée pour garder les yeux humides. La vitre de couverture de la fenêtre crânienne est nettoyée avec de l’alcool à 70 %. La fenêtre est positionnée parallèlement au plan focal et centrée dans le champ de vision.

Sous l’objectif quatre x, il est préférable de prendre une photo des vaisseaux de surface du cerveau avec un appareil photo numérique. Cette image sera utilisée comme image de référence dans les séances d’imagerie suivantes pour trouver la région de l’image de manière répétée de jour en jour. L’objectif 40 x est ensuite remplacé par un objectif 40 x immersion dans l’eau.

Sans déplacer la scène, l’image numérique de la vue est prise. Encore une fois, les coordonnées du manipulateur de scène sont mises à zéro. Nous utilisons l’image numérisée comme logiciel d’acquisition d’images.

Ceci a été écrit dans MATLAB par Tom Paul Rudo et Bernardo Sabatini dans le laboratoire de Carls Voto. Nous allumons ensuite tous les autres équipements, le laser, le wattmètre, les tubes photomultiplicateurs, les amplificateurs, etc. La zone de la fenêtre qui convient à l’imagerie est brièvement balayée à faible grossissement pour trouver les meilleures régions.

Une fois ceux-ci identifiés, la pile à faible grossissement de la région choisie à imager est prise et ses coordonnées XY sont annotées pour enregistrer la dynamique du flux sanguin dans les petits vaisseaux ou les capillaires. Nous utilisons des balayages linéaires le long d’au moins 40 microns du vaisseau d’intérêt. Ces balayages uniques d’une seconde sont effectués en utilisant le moins de puissance laser possible, et les coordonnées et l’angle de balayage sont notés.

Une fois la séance d’imagerie terminée, l’animal est déplacé dans une chambre chaude où il peut se remettre de l’anesthésie. Nous montrons ici une pile d’une centaine d’images prises tous les cinq microns avec notre microscope à deux photons à travers une fenêtre crânienne placée sur le cortex somatosensoriel d’une souris de cinq mois à qui on a injecté du dextran de r Domine par la veine de la queue. Cette séquence d’images montre le réseau complexe de petits et grands vaisseaux sanguins, y compris les capillaires.

Nous venons de vous montrer une méthode de visualisation de la dynamique du flux sanguin in vivo à travers une fenêtre crânienne. Il s’agit d’une méthode extrêmement puissante pour imager la dynamique du flux sanguin cérébral dans le système vasculaire cortical, par exemple, pour étudier les altérations du flux sanguin après un accident vasculaire cérébral. Plusieurs imaginations peuvent être réalisées à différents moments dans les BUL en utilisant des injections répétées de colorant fluorescent dans la veine de la queue.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans les conditions les plus propres et les plus stériles possibles et d’avoir une main très stable. D’accord, et c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.