Système Alphavirus Transducing: des outils de visualisation des infections dans les moustiques vecteurs

Les virus alpha sont des virus à ARN nés des moustiques qui infectent de manière persistante les cellules sensibles des moustiques avec une cytopathologie minimale. Ce protocole montre l’utilité des systèmes de transduction du virus alpha infectieux qui expriment des rapporteurs fluorescents pour la détection de l’infection vectorielle et de la transmission du virus. Nourrissez d’abord les moustiques femelles avec un repas de sang contenant le virus alpha d’intérêt, puis déterminez l’efficacité de l’infection par les moustiques et sélectionnez uniquement les moustiques exprimant le gène marqueur.

Ensuite, récoltez la salive des moustiques infectés et démontrez la transmissibilité en infectant les cellules de moustiques cultivées avec la salive recueillie. Résultats obtenus par microscopie épi-fluorescente. Visualisez un rapport de protéines comme la GFP et suivez ainsi l’infection vectorielle et la transmission du virus par les espèces de moustiques des années 80 ou QE.

Les systèmes d’expression du virus alpha ou ATS peuvent être utilisés pour évaluer rapidement l’expression des gènes et les moustiques vecteurs pour les études sur les arbovirus ainsi qu’avant d’effectuer des manipulations plus difficiles des moustiques telles que la transgenèse des moustiques. La Dre Irma Sanchez Vargas, le Dr Eric Mossel et Aaron Phillips du laboratoire du Dr Ken Olson feront la démonstration de ces procédures. Afin de produire un virus TS dans les cellules Bhk 21, utilisez un virus recombinant symbis qui exprime le rapporteur GFP après transcription in vitro, électro-évalue l’ARN du système de transduction du virus alpha génomique dans les cellules bhk 21.

Ensuite, sauvez et amplifiez le virus avant l’infection. Préparez les moustiques pour une alimentation sanguine efficace à partir d’une mangeoire artificielle par privation de nourriture. Retirez le sucre 24 heures et l’eau 12 heures avant la tétée.

Mélange de sang animal défibrillé ou citrated obtenu commercialement avec la culture cellulaire préparée dérivée d’une suspension de virus TS pour une infection efficace de l’intestin moyen des moustiques. Formulez 10 à sept unités de formation de plaque par millilitre de titre de virus pour le repas de sang afin de stimuler les moustiques à s’engorger. Ajouter un TP à une concentration finale de 0,02 molaire.

Placez une membrane intestinale de signe de pores sur l’embouchure de la mangeoire en verre à enveloppe d’eau. Ensuite, installez les mangeoires avec de l’eau en circulation à 37 degrés Celsius. Ensuite, pipetez le repas dans la chambre et placez les doseurs en toute sécurité sur le carton.

Après avoir nourri les moustiques pendant 10 à 30 minutes, trier les moustiques anesthésiants froids pour les échantillons gorgés de sang afin de permettre la réplication et la dissémination d’un virus TS chez les moustiques sélectionnés. Incuber à 28 degrés Celsius et 75 % d’humidité relative pendant huit à 10 jours. Afin d’immobiliser les moustiques.

Placez le carton de maintien du papier à quatre degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Maintenant, transférez cinq à dix moustiques sur une table de refroidissement adaptée pour une utilisation sur un microscope fluorescent. Examinez et triez les moustiques en fonction de la présence ou de l’absence de fluorescence.

Remettez les moustiques sélectionnés dans le carton en papier pour les utiliser comme vous le souhaitez. À ce stade, déterminez l’efficacité de l’infection en utilisant l’intensité fluorescente comme approximation. Enfin, disséquez les tissus tels que les intestins moyens, les glandes SIV et les corps adipeux, et surveillez la fluorescence.

Ces organes et tissus peuvent être disséqués plus tôt si vous le souhaitez. Priver les moustiques de la source de sucre pendant 24 heures avant le repas. Préparez un tube capillaire de 50 microlitres qui a été chauffé, tiré et ciselé avec trois à cinq microlitres de Cargill.

Huile d’immersion de type B pour éviter que les moustiques ne s’échappent. Retirez leurs pattes et leurs ailes. Insérez maintenant le probos dans le tube.

Surveillez attentivement les gouttelettes de salive qui s’échappent du probos dans l’huile d’immersion. Si nécessaire, placez une goutte de pilocarpine à 1 % sur le thorax du moustique pour augmenter la salivation après 60 à 90 minutes, retirez les moustiques et stockez-les pour l’isolement futur du virus. Maintenant, pour récolter la solution du tube capillaire, expulsez le mélange d’huile de salive dans un tube contenant 500 microlitres de 20 % de F-B-S-P-B-S stérile.

Filtrez l’inoculum à travers un filtre à seringue de 0,2 micron, puis utilisez cet inoculum pour infecter les cellules cultivées dans les cellules de moustiques. L’efficacité de l’infection par cinq premiers virus DS MRE 16 GFP est évaluée par l’expression de la GFP. Au fil du temps, ces cellules ont été infectées par le virus à 0,01 multiplicité d’infection.

Un microscope à épifluorescence permet de voir l’ensemble du corps de la GFP chez le moustique infecté ainsi que dans les différentes parties du corps ici 10 jours après l’infection. L’expression sélective de la GFP dans un organe est indicative d’une infection disséminée. Les intestins moyens ont généralement des foyers distincts d’infection tôt après l’ingestion d’un repas de sang contenant un virus qui se propage dans tout l’intestin moyen postérieur plus tard après l’infection.

Ces événements sont signalés par les reporters de la GFP et de la DS RED. Le test de transmission indique que cinq premiers virus DS MRE 16 GFP expriment de manière stable la GFP tout au long de la période d’incubation extrinsèque. Chez le moustique ici, la GFP et la salive du moustique sont détectées dès huit jours après l’infection.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter oralement un virus A TS à un moustique, de la façon d’évaluer visuellement l’infection virale d’un moustique et de la façon d’évaluer la transmission du virus par le moustique.