Système Alphavirus Transducing: des outils de visualisation des infections dans les moustiques vecteurs

Les alphavirus sont des virus à ARN transmis par les moustiques et qui infectent de façon persistante les cellules de moustiques sensibles, avec une cytopathologie minimale. Ce protocole illustre l'utilité des systèmes transducteurs d'alphavirus infectieux exprimant des marqueurs fluorescents pour la détection de l'infection des vecteurs et de la transmission virale. Faites d'abord ingérer à des moustiques femelles un repas sanguin contenant l'alphavirus d'intérêt, puis déterminez l'efficacité d'infection des moustiques et sélectionnez uniquement les moustiques exprimant le gène marqueur.

Ensuite, récoltez la salive des moustiques infectés et démontrez la transmissibilité en infectant des cellules de moustiques en culture avec la salive recueillie. Résultats obtenus par microscopie épifluorescente. Visualisez un rapporteur protéique tel que la GFP et suivez ainsi l'infection du vecteur et la transmission du virus par des espèces de moustiques du genre *Aedes* ou *Culex*.

Les systèmes d'expression de virus alpha ou ATS peuvent être utilisés pour évaluer rapidement l'expression génique et les moustiques vecteurs, tant dans le cadre d'études sur les arbovirus qu'avant d'effectuer des manipulations plus complexes sur les moustiques, telles que la transgénèse. Ces procédures seront démontrées par le Dr Irma Sanchez Vargas, le Dr Eric Mossel et Aaron Phillips du laboratoire du Dr Ken Olson. Afin de produire un virus TS dans des cellules BHK-21, utilisez un virus recombinant symbis exprimant le rapporteur GFP après transcription in vitro, puis électroporez l'ARN du système transducteur de virus alpha dans des cellules BHK-21.

Ensuite, récupérez et amplifiez le virus avant l'infection. Préparez les moustiques pour un repas sanguin efficace à l'aide d'un nourrisseur artificiel en les privant de nourriture. Retirez le sucre 24 heures et l'eau 12 heures avant le repas.

Mélanger du sang d'animal défibriné ou citraté obtenu commercialement avec la suspension virale de souche TS dérivée de culture cellulaire préparée, afin d'obtenir une infection efficace de l'intestin moyen des moustiques. Formuler une suspension virale à une concentration de 10 puissance 7 unités formant des plaques par millilitre pour le repas sanguin, afin de stimuler l'ingestion par les moustiques. Ajouter du TP à une concentration finale de 0,02 molaire.

Placer une membrane intestinale de signe poreux sur l'ouverture du distributeur en verre à manchon d'eau. Ensuite, installer les distributeurs avec une circulation d'eau à 37 degrés Celsius. Puis, pipeter le repas dans la chambre et placer les distributeurs fermement sur le carton.

Après avoir laissé les moustiques se nourrir pendant 10 à 30 minutes, trier les moustiques anesthésiés au froid pour sélectionner les spécimens gorgés de sang, afin de permettre la réplication et la dissémination d'un virus TS dans les moustiques choisis. Incuber ceux-ci à 28 degrés Celsius et à 75 % d'humidité relative pendant huit à dix jours. Afin d'immobiliser les moustiques.

Placer le carton contenant le papier à quatre degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Transférer ensuite cinq à 10 moustiques sur une table réfrigérée adaptée à un microscope fluorescent. Examiner et trier les moustiques en fonction de la présence ou de l'absence de fluorescence.

Remettre les moustiques sélectionnés dans le carton en papier pour les utiliser selon les besoins. À ce stade, déterminer l'efficacité d'infection en utilisant l'intensité de fluorescence comme indicateur. Enfin, disséquer des tissus tels que les intestins moyens, les glandes SIV et les corps gras, et surveiller la fluorescence.

Ces organes et tissus peuvent être disséqués plus tôt si désiré. Priver les moustiques de source de sucre pendant 24 heures avant le repas. Préparer un tube capillaire de 50 microlitres ayant été chauffé, étiré et coupé, contenant trois à cinq microlitres de Cargill.

Utilisez de l'huile à immersion de type B afin de s'assurer que les moustiques ne s'échappent pas. Retirez-leur les pattes et les ailes. Insérez ensuite le rostre dans le tube.

Surveillez attentivement les gouttelettes de salive qui s'écoulent de la trompe dans l'huile d'immersion. Si nécessaire, appliquez une goutte de pilocarpine à 1 % sur le thorax du moustique afin d'augmenter la salivation après 60 à 90 minutes, retirez les moustiques et conservez-les pour une éventuelle isolation du virus. Pour prélever la solution du tube capillaire, expulsez une goutte du mélange salive-huile dans un tube contenant 500 microlitres de PBS stérile à 20 % enrichi de sérum fœtal bovin.

Filtrer l'inoculum à l'aide d'un filtre à seringue de 0,2 micron, puis utiliser cet inoculum pour infecter des cellules cultivées de moustique. L'efficacité de l'infection par le virus DS MRE 16 GFP cinq prime est évaluée par l'expression de la GFP. Au fil du temps, ces cellules ont été infectées par le virus à une multiplicité d'infection de 0,01.

Un microscope à fluorescence épiscopique permet une vue d'ensemble de la GFP dans le moustique infecté ainsi que dans les différentes parties du corps, ici à 10 jours post-infection. Une expression sélective de la GFP au niveau des organes indique une infection disséminée. Les intestins moyens présentent généralement des foyers d'infection distincts peu de temps après l'ingestion d'un repas sanguin contenant le virus, foyer qui s'étend ensuite à l'ensemble de l'intestin moyen postérieur au cours des stades ultérieurs post-infection.

Ces événements sont signalés par les rapporteurs GFP et DS RED. Le test de transmission indique que le virus GFP DS MRE 16 cinq prime exprime de manière stable la GFP tout au long de la période d'incubation extrinsèque. Chez le moustique, la GFP et la salive du moustique sont détectées dès huit jours post-infection.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment infecter oralement un moustique avec un virus ATS, comment évaluer visuellement l'infection virale chez un moustique, et comment évaluer la transmission du virus par le moustique.