Séparation par chromatographie sur couche mince de nucléotides (p)ppGpp isolés de bactéries induites par le stress

Commencer avec des extraits nucléotidiques radiomarqués obtenus à partir d’une culture bactérienne avant et après l’induction du stress.

En cas de stress, les enzymes bactériennes convertissent la guanosine triphosphate et la guanosine diphosphate en nucléotides induits par le stress, la guanosine pentaphosphate et la guanosine tétraphosphate.

Repérez les extraits sur une plaque de chromatographie sur couche mince pré-recouverte d’un polymère cationique en tant que phase stationnaire.

Placez la plaque dans une chambre contenant un tampon comme phase mobile, en veillant à ce que le liquide reste sous le spot pour éviter une diffusion précoce.

Laissez le tampon monter par capillarité, en séparant les nucléotides chargés négativement en bandes distinctes en fonction de leur charge et de leur taille.

Après le développement, retirez la plaque, séchez-la à l’air libre et coupez le dessus pour éliminer les isotopes libres et réduire le signal de fond.

Exposez la plaque à un écran sensible aux rayonnements pour détecter le signal radioactif.

L’augmentation des niveaux de guanosine tétraphosphate et de guanosine pentaphosphate après induction de stress révèle des changements dynamiques dans le pool de nucléotides de guanosine.

Tout d’abord, installez une plaque TLC en cellulose PEI de 20 x 20 centimètres.

Utilisez des ciseaux pour retirer les cinq centimètres supérieurs et utilisez un crayon doux pour marquer une ligne d’origine à un centimètre du bord. Appliquez une gouttelette de cinq microlitres de chaque échantillon sur la surface de l’Île-du-Prince-Édouard.

Avant que la tache ne puisse sécher, transférez la plaque dans un réservoir contenant une couche de phosphate monopotassique de 1,5 molaire suffisamment peu profonde pour ne pas toucher le point d’origine de l’échantillon. Couvrez le réservoir avec un joint étanche à l’air et laissez le liquide remonter vers le haut de la feuille coupée de 15 centimètres. Après cela, retirez le chromatogramme complètement développé et séchez-le à l’air libre à température ambiante.

Coupez et jetez la partie supérieure du chromatogramme contenant le P32 libre dans les déchets radioactifs. Utilisez un écran au phosphore pour exposer les films audioradiographiques pendant la nuit. Le lendemain, développez le film et utilisez un imageur phosphore pour capturer et quantifier le signal vert du phosphore.

Ensuite, utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier les taches radioactives.