Analyse microscopique de la croissance bactérienne sous stress à l’aide de chambres microfluidiques

Commencez avec une plaque microfluidique remplie d’un milieu nutritif préchauffé.

Fixez la plaque au système de collecteur et scellez la configuration. Faites passer le fluide à travers les canaux pour éliminer les bulles d’air.

Placez l’installation sur une platine de microscope et préchauffez-la pour éviter l’expansion de la plaque pendant l’imagerie.

Ensuite, retirez le milieu, introduisez une culture bactérienne dans les entrées des cellules et un milieu induisant du stress dans les entrées de solution.

Le milieu induisant le stress contient un antibiotique qui arrête la division cellulaire sans inhiber une augmentation de la masse cellulaire.

Scellez le système, puis lancez le chargement des cellules pour transférer les bactéries dans la chambre de culture de la plaque.

À l’aide de la lumière transmise, localisez un champ de vision contenant des cellules individuelles uniformément réparties.

Injectez dans la chambre le milieu induisant le stress pour exposer les cellules à l’antibiotique.

À l’aide du mode de contraste de phase, capturez des images en accéléré pour observer la formation de cellules filamenteuses allongées avec une teneur accrue en ADN causée par l’inhibition de la division cellulaire médiée par les antibiotiques.

Tout d’abord, retirez la solution de conservation de la plaque microfluidique et remplacez-la par un fluide frais préchauffé à 37 degrés Celsius, comme décrit dans le Guide de l’utilisateur du logiciel microfluidique. Fixez la plaque microfluidique au système de collecteur.

Et dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Seal pour sceller la plaque sur le système de collecteur. Après cela, cliquez sur le bouton Amorçage. Positionnez la plaque microfluidique avec le système de collecteur sur la platine du microscope et préchauffez à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour éviter la dilatation de la chambre microfluidique.

Scellez la plaque microfluidique sur le système microfluidique en cliquant sur le bouton Seal Off. Remplacez le milieu du puits huit par 150 microlitres d’échantillon de culture et remplacez le milieu du puits un à cinq par le milieu souhaité, avec ou sans le réactif induisant le stress. Scellez la plaque microfluidique et placez-la sur la platine du microscope.

Dans le logiciel microfluidique, exécutez la procédure de chargement de cellule. Vérifiez que la charge des cellules est satisfaisante en regardant au microscope en lumière transmise. Faites soigneusement la mise au point en mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs champs de vision qui montrent des bactéries isolées et ne sont pas surpeuplées, environ 10 à 20 cellules par 100 microlitres carrés.

Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Exécuter une séquence personnalisée, puis programmez l’injection du milieu induisant le stress pendant 10 minutes à deux PSI, suivie d’une injection à un PSI pendant la durée souhaitée du traitement du stress. Effectuez une imagerie microscopique en mode time-lapse avec une image toutes les 10 minutes, en utilisant le contraste de phase en lumière transmise et une source lumineuse d’excitation de 560 nanomètres pour le signal mCherry si nécessaire. Démarrez l’acquisition d’images microscopiques et le protocole d’injection microfluidique en même temps.