Évaluation de la fréquence des mutations chez les bactéries à l’aide du dosage de la bêta-glucosidase

Prenez une culture de bactéries génétiquement modifiées.

Les bactéries sont induites à exprimer une variante mutante de l’ADN polymérase avec une activité de relecture défectueuse, ce qui augmente les risques d’erreur de réplication.

Ces erreurs peuvent conduire à des mutations spontanées dans la région régulatrice, qui dépriment le gène de la bêta-glucosidase et déclenchent l’expression de l’enzyme bêta-glucosidase.

Prélever des échantillons à intervalles réguliers et évaluer le nombre de générations bactériennes dans chaque culture. Centrifuger les échantillons et jeter le surnageant.

Remettez la pastille en suspension dans un tampon.

Ajouter une solution de perméabilisation et mélanger pour perméabiliser la membrane bactérienne.

Transférez les échantillons bactériens perméabilisés dans une plaque multi-puits.

Ajoutez un substrat qui pénètre dans la bactérie et réagit avec l’enzyme bêta-glucosidase, produisant un produit coloré.

Mesurez l’intensité de la couleur pour déterminer l’activité de la bêta-glucosidase.

Analyser l’activité de la bêta-glucosidase dans les cultures bactériennes pour déterminer la fréquence des mutations au fil des générations.

Transférez une seule colonie d’E. coli TOP10 contenant les vecteurs pBAD-ε et pGOOD1-εD12A11 dans un millilitre de milieu LB traité avec des antibiotiques.

Incuber la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, diluer la pré-culture de 1 à 250 dans trois flacons contenant 10 millilitres de milieu frais. Ajoutez les inducteurs un millimolaire d’arabinose, d’IPTG ou d’arabinose et d’IPTG, et incubez la culture induite à 37 degrés Celsius pendant huit heures.

Préparer les cultures non induites en parallèle. Prélever des aliquotes d’un millilitre et les diluer de un à 500 dans des flacons neufs contenant 10 millilitres de milieux frais, complétés ou non par des inducteurs. Ensuite, incubez le mélange pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, répétez les étapes en commençant par la dilution de la pré-culture et prélevez des aliquotes d’un millilitre. Les aliquotes sont ensuite placées dans le congélateur.

Ensuite, déterminez le nombre de générations qui se sont produites dans chaque culture. Transférer 100 microlitres de dilutions en série appropriées d’inoculum et de culture sur des plaques LB.

Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, comptez les colonies sur les plaques LB.

Calculer le log du nombre de cellules présentes dans l’inoculum ou log I et dans la culture à la fin de la croissance ou log C, et déterminer le nombre de générations.

Ensuite, centrifugez la culture à 5 000 g pendant 20 minutes et mettez les cellules en suspension dans un millilitre de 50 millimolaires de tris HCL, pH 7,6, 50 millimolaires de NaCl.

Pour perméabiliser les cellules, ajoutez deux à trois gouttes de chloroforme et faites un vortex pendant 20 secondes.

Enfin, déterminez l’activité glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque à 96 puits.

Ajoutez 100 microlitres de cellules perméabilisées et 100 microlitres de substrat d’utilisation de p-nitrophényl-D-glucopyranoside dans chaque puits, tout en évitant la création de bulles d’air dans les puits.

Lisez l’absorbance à 420 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques et d’un filtre.