Évaluation de la fréquence des mutations chez les bactéries à l’aide du dosage de la bêta-glucosidase

Prenez une culture de bactéries génétiquement modifiées.

Les bactéries sont induites à exprimer une variante mutante de l’ADN polymérase avec une activité de relecture défectueuse, ce qui augmente les risques d’erreur de réplication.

Ces erreurs peuvent conduire à des mutations spontanées dans la région régulatrice, qui dépriment le gène de la bêta-glucosidase et déclenchent l’expression de l’enzyme bêta-glucosidase.

Prélever des échantillons à intervalles réguliers et évaluer le nombre de générations bactériennes dans chaque culture. Centrifuger les échantillons et jeter le surnageant.

Remettez la pastille en suspension dans un tampon.

Ajouter une solution de perméabilisation et mélanger pour perméabiliser la membrane bactérienne.

Transférez les échantillons bactériens perméabilisés dans une plaque multi-puits.

Ajoutez un substrat qui pénètre dans la bactérie et réagit avec l’enzyme bêta-glucosidase, produisant un produit coloré.

Mesurez l’intensité de la couleur pour déterminer l’activité de la bêta-glucosidase.

Analyser l’activité de la bêta-glucosidase dans les cultures bactériennes pour déterminer la fréquence des mutations au fil des générations.

Transférez une seule colonie d’E. coli