Préparation du tissu de vessie de souris pour la visualisation d’une infection bactérienne

Commençons par une souris euthanasiée avec une vessie exposée, pré-infectée par des bactéries pathogènes.

Les bactéries envahissent l’urothélium et forment des colonies. À maturité, ces bactéries rompent la cellule épithéliale et infectent les cellules environnantes.

Insérez un cathéter relié à une seringue remplie de fixateur. Instillez lentement le fixateur pour gonfler la vessie et préserver son architecture.

Clampez l’urètre pour conserver le fixateur et conserver la forme de la vessie.

Retirez la sonde, puis coupez l’urètre. Transférez la vessie dans un fixateur frais et incubez pour préserver la structure.

Séparez la vessie en deux demi-cubelets pour exposer l’urothélium, puis rincez avec un tampon.

Teignez avec un réactif à base de métal pour renforcer le contraste, puis lavez avec de l’eau ultrapure.

Déshydratez les sections à l’aide d’un gradient d’éthanol, suivi d’un séchage au point critique.

Coupez chaque coupe de vessie séchée en deux.

L’échantillon est désormais prêt pour un traitement en aval afin de visualiser les interactions hôte-pathogène.

Une fois la seringue à pointe coulissante à tuberculine avec fixateur, fixez un cathéter à l’extrémité, biseaument face aux marques de la seringue.

Coupez l’excès de tube à 1 à 2 millimètres de l’extrémité de l’aiguille, en faisant attention à ne pas exposer la pointe de l’aiguille. Faites un coup de seringue pour enlever les bulles et poussez le ventouse pour évacuer l’air. Ensuite, remplissez le cathéter avec un fixateur sur un tube de microcentrifuge. Après anesthésiation et sacrifice de la souris, une fois les jambes sécurisées, ouvrez la zone pelvienne de la souris avec des pinces et une paire de ciseaux chirurgicaux pour exposer la vessie. Écartez doucement la graisse adjacente, mais laissez la vessie en place.

Tenez la seringue avec la main dominante en pointant l’aiguille vers le bas. Trempez la pointe du cathéter dans un lubrifiant stérile et positionnez la pointe du cathéter à l’ouverture urétrale, en maintenant le canon de la seringue à un angle de 30 à 45 degrés au-dessus du corps de la souris.

Appliquez une pression vers le bas dans le sens des aiguilles d’une montre et insérez doucement le cathéter dans l’urètre. Lorsque la pointe du cathéter entre, faites pivoter la seringue vers la queue de la souris tout en continuant à faire glisser le cathéter plus loin dans l’urètre jusqu’à ce que le corps de la seringue soit parallèle à la surface de travail. L’ensemble de la tige de l’aiguille du cathéter doit entrer dans la souris, positionnant la pointe du cathéter dans la lumière de la vessie. Administrez lentement entre 50 et 80 microlitres de fixateur, ce qui fait gonfler la vessie comme un ballon.

Maintenez le cathéter en place et relevez légèrement la seringue en inclinant la pointe vers le haut. De l’autre main, ouvrez un hémostat et glissez une pointe sous l’aiguille du cathéter à l’intersection de l’urètre. Fermez partiellement l’hémosat jusqu’à ce qu’il touche juste l’aiguille.

Faites doucement glisser l’aiguille du cathéter hors de la vessie tout en serrant et verrouillant complètement l’hémostat pour éviter la perte du fixateur. Saisir l’hémostat de façon à ce qu’il soit parallèle à la surface de travail, avec la vessie posée dessus. Soulevez doucement et découpez soigneusement sous l’hémostatique pour retirer la vessie avec l’hémostat encore attaché.

Placez la vessie et l’hémostat attaché dans un tube Falcon contenant un fixateur chauffé. Assurez-vous que la vessie est complètement immergée dans le liquide et ne soit pas pressée contre les parois du tube.

Pour imager la vessie par microscopie électronique à balayage, coupez-la en sagitte avec une lame de rasoir ou un scalpel propre et double face, puis effectuez une seconde coupe tangentielle à l’hémostate pour libérer la vessie. Cela donne deux coupes demi-vessie. S’il reste des coussinets graisseux à l’extérieur de la vessie, retirez-les doucement.

Rincez les moitiés de la vessie trois fois dans un tampon de cacodylate de sodium. Colorez le tissu avec du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon cacodylate de 0,15 molaire pendant 1 heure à température ambiante. Effectuez cette étape avec le récipient de teinture enveloppé dans du papier aluminium pour maintenir un environnement sombre. Après la teinture, rincez les moitiés de la vessie trois fois dans de l’eau ultra-pure.

Si de l’huile osmicée est visible à la surface de l’eau, aspirez-la ou évacuez-la pour éviter toute contamination lors des étapes de séchage. Après déshydratation du tissu, coupez les deux moitiés de la vessie avec un rasoir propre à double face pour obtenir un total de quatre morceaux.