Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

Bonjour, je m’appelle Ken Paradiso. Je travaille pour Ling Gang Wu au National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural Program, qui est situé au NIH sur le campus de Bethesda. Je vais vous montrer les techniques pour le pincement par patch d’enregistrement présynaptique caly tenu.

Donc, pour préparer le tissu cérébral, nous retirons le cerveau du rat. Nous avons mis le cerveau à l’intérieur de cette solution, qui serait une solution glacée à faible teneur en calcium, et elle bouillonnerait de carbogène pour s’assurer qu’il y a un apport d’oxygène au cerveau à tout moment. Et il doit également être glacé pour minimiser l’AD afin de minimiser la quantité de dégâts.

Le cerveau serait donc maintenant dans cette solution. Nous le sortions, le coupions de manière appropriée pour qu’il puisse être placé sur le bloc, monté sur le bloc avec du corrélat Sano ou de la colle folle, mais remplissions ensuite la chambre avec une solution glacée à faible teneur en calcium, la bullions, la placions sur le vibrateur, puis coupions des tranches de 180 à 190 microns d’épaisseur à une fréquence de lame de 70 hertz et à une vitesse avancée de 0,01 à 0,02 millimètre par deuxième. Cela représenterait donc 10 à 20 microns par seconde.

Une fois que chaque tranche est faite, nous transférons les tranches de la solution saline glacée dans cette chambre, qui contient une solution de calcium normale. C’est la même solution que celle dans laquelle nous enregistrons et c’est à une température physiologique de 37 degrés. Nous mettons ensuite les tranches ici pour la récupération.

Il reste ici pendant une demi-heure à une heure avant que les expériences de physiologie ne soient exécutées. Donc, ici, j’ai le cerveau et je vais le sortir de la solution. Il s’agit donc d’un cerveau plus grand à des fins de démonstration.

Il s’agit d’un rat P 20. Nous allons le retourner. C’est le tronc cérébral qui nous intéresse.

Donc, cette zone ici et le calice que le calice a tenu se trouve à peu près dans cette zone, juste là. Donc, ce que nous allons faire, c’est couper le reste du cerveau, isoler le tronc cérébral, puis préparer le tronc cérébral pour la chambre de tranchage. D’accord, nous allons donc couper le reste du cerveau en isolant simplement le tronc cérébral.

Je vais le retourner pour montrer où nous en sommes. Normalement, nous ne le ferions pas de cette façon, et encore une fois, nous pouvons simplement nous débarrasser de toute cette partie. En le retournant, nous avons isolé le tronc cérébral et nous faisons juste une autre coupe juste là.

D’accord, c’est tout. C’est le tronc cérébral. Le calice de tenu est juste là et là.

C’est le tronc cérébral. Encore une fois, nous allons le repousser un peu. Nous allons couper un côté du cervelet et cela va permettre au tronc cérébral de s’asseoir sur le côté comme ça.

Nous mettons un peu de colle acrylique Sano et la gardons posée sur le côté, nous la remplissons rapidement de glace froide, de solution froide à faible teneur en calcium. Mettez-y la conduite d’oxygène dès que possible. Nous le ramassons maintenant et l’amenons au vibrato.

Nous l’introduisons rapidement pour arriver au début du cerveau, puis une fois que nous arrivons au début du cerveau, nous réduisons la vitesse à 0,01 millimètre par seconde. C’est donc 10 micros par seconde. Il avance donc à un rythme incroyablement lent.

La première partie du cerveau est la partie qui a le mtb, qui est le Niles médial du corps trapézoïdal. Et c’est la partie qui contient, d’accord, donc une fois que je l’ai dans la pipette de transfert, j’essaie de l’amener aussi près que possible de la pointe de la pipette. Et il y a la tranche de cerveau et je la transfère assez rapidement dans cette chambre, qui contient une solution d’enregistrement standard qui contient des niveaux normaux de calcium et aussi une température plus élevée.

Et cela permettra aux tranches de récupérer après les procédures de tranchage qu’elles sont prêtes à partir d’expériences de physiologie. D’accord, donc à partir de maintenant, ce sera la même chose encore et encore. L’équipement suivant est ce que j’utiliserai pour faire le serrage du patch.

Nous disposons d’un microscope vertical à platine fixe. La platine est fixe, comme je l’ai dit, de sorte que le microscope se déplace en dessous à partir d’un manipulateur. Nous utilisons des perruques et un micro manipulateur Newman pour tenir la scène, la tête de l’amplificateur, nous utilisons un amplificateur EPC 10 patch clamp de chez heca.

Et ce que j’aurais dû mentionner aussi, c’est que nous utilisons la DIC avec la lumière infrarouge. Nous avons donc une caméra IR ici, et donc tout ce que nous voyons sera vu à l’écran lorsque nous recherchons des IAO. L’amplificateur de patch clamp est contrôlé par ce logiciel, qui s’appelle Pulse, qui est également, qui est également de Heca, et contrôlera l’amplificateur et toutes les expériences de physiologie.

Les résultats s’afficheront sur cet écran. Le caly have held est un grand terminal présynaptique, et parce qu’il est grand, il nous permet de nous connecter physiquement au terminal. Nous pouvons donc prendre des enregistrements présynaptiques et c’est quelque chose d’unique, surtout dans le SNC.

Cela nous permet donc de mesurer les canaux calciques activés présynaptiquement. De plus, nous pouvons mesurer l’activité du potentiel d’action si nous voulons stimuler le nerf qui mène au calice. Ce que nous faisons dans ce laboratoire, c’est mesurer un processus appelé exocytose, qui est la fusion de vésicules contenant un neurotransmetteur avec la membrane.

Maintenant, dans ces vésicules fusionnent avec la membrane dans le processus appelé exocytose, elles ajoutent de la membrane à la terminaison synaptique, et nous pouvons mesurer cela comme un changement de capacité. Nous obtiendrons une augmentation de la capacité à mesure que la membrane est ajoutée au terminal, de sorte que les expériences que je vais montrer aujourd’hui sont des mesures de capacité, présynaptiques lorsque la membrane est retirée. Vous ne pouvez donc pas continuer à ajouter de la membrane, vous devez bien sûr en enlever.

Ce processus s’appelle l’endocytose ou l’absorption membranaire. Nous pouvons également mesurer cela et cela sera mesuré comme une diminution du niveau de capacité et nous en montrerons des exemples plus tard. Maintenant, ce que cela nous permet de faire, c’est de surveiller l’activité des canaux calciques et également de surveiller certaines des protéines impliquées dans l’exocytose et l’endocytose et de les étudier.

Nous pouvons mettre des choses comme des peptides pour bloquer les protéines impliquées dans l’exo ou l’endocytose. Nous pouvons également utiliser des toxines qui font la même chose. Nous pouvons également ajuster les quantités de calcium qui entrent dans le terminal, de sorte que nous pouvons vraiment étudier le processus d’exocytose, la libération de neurotransmetteurs, ainsi que l’absorption de la membrane qui suit cet événement.

Il s’agit du tube contenant notre solution d’enregistrement intracellulaire. Nous le préparons à l’avance puis nous le congelons et nous pouvons généralement l’utiliser pendant plusieurs semaines à un mois avant de devoir faire une nouvelle solution. Encore une fois, nous avons réfléchi juste avant de faire nos enregistrements, et vous allez toujours avoir une certaine quantité de particules de poussière ou d’autres types de débris qui vont pénétrer dans votre tube.

Vous pouvez faire l’une des deux choses suivantes. Vous pouvez soit retirer la solution et la filtrer, soit la faire tourner pendant une minute ou deux, puis retirer la solution, en laissant une partie inférieure qui contiendrait des débris et d’autres matériaux à l’intérieur. Je préfère donc le faire tourner et je vais le faire tout de suite.

Il s’agit donc du tube contenant notre solution intracellulaire. Il est dégelé. Nous allons le faire tourner pendant environ deux à trois minutes dans une petite centrifugeuse, et cela devrait suffire à extraire les grosses particules de poussière de la solution.

Alors maintenant, je retire simplement le haut, la solution que nous venons de tourner, en faisant attention de ne pas l’agiter, je la transfère dans un tube propre, et j’en retire environ 90 %. J’essaie de ne pas le faire à nouveau, de récupérer ce dernier petit morceau. Je vais donc m’arrêter là.

Je l’ai mis sur de la glace immédiatement pour qu’il reste bien froid pendant l’expérience. C’est très important. C’est la, c’est l’une de nos pipettes.

Nous l’utilisons pour les enregistrements intracellulaires. Il s’agit d’un verre de silice à paroi épaisse, d’un diamètre extérieur de deux millimètres, d’un diamètre intérieur de 1,16 millimètre. Tout d’abord, nous remplissons la pipette.

Nous appliquons donc une aspiration, nous mettons la pipette dans la solution d’enregistrement et nous appliquons une aspiration pour essayer de remplir la toute pointe de la pipette, qui autrement ne se remplira pas autrement. Une fois que nous avons fait cela, nous prenons un tube capillaire et remplissons le reste de l’électrode en prenant simplement le dos de votre pipette. Il s’agit d’une technique de physiologie standard et de l’effleurer littéralement.

Vous courez le risque de casser l’extrémité de la pipette, mais vous aurez aussi, si vous ne le faites pas, vous aurez souvent des bulles d’air. D’accord, nous l’avons maintenant placé sur notre porte-pipette, qui est connecté à notre étage avant de l’amplificateur patch plant. Il y a un fil de chlorure d’argent là-bas.

Le fil de chlorure d’argent entre en contact avec la solution intracellulaire, ce qui nous permet de mesurer l’activité électrique dans la terminaison présynaptique. Donc, ce que nous faisons, c’est que nous trouvons la tranche qui contient beaucoup d’IAO. Nous voulons une forte densité d’OEA.

C’est-à-dire que nous recherchons le noyau médial du corps trapézoïdal, qui est le MNTB, et c’est là que se trouve le terminal, qui forme le caly soutenu, ou qui est l’application du calice. Et donc, ce que nous faisons, c’est commencer à parcourir la tranche. Ainsi, par exemple, nous avons un calice qui est un peu profond de la surface et il n’y a pas grand-chose sur quoi se réparer, alors nous continuons à balayer à travers nous.

C’est donc un calice ici que nous recherchons. Ce que j’ai fait, c’est deux marques sur l’écran, c’est là où la pipette va aller. Et vous pouvez voir qu’il y a le morceau de calice que je vais aller après que la pipette va descendre.

Je vais appliquer une pression positive pour qu’elle pousse contre le calice, puis je vais relâcher la pression positive. Le calice va alors pousser contre la pipette, et à ce moment-là, j’applique une aspiration très douce et j’essaie d’aspirer et de pousser la membrane ou de faire en sorte que la membrane se scelle sur la pointe de la pipette. D’accord, j’ai soulagé la pression positive.

Et maintenant, je vais appliquer l’aspiration. Donc, ici, nous sommes pros, nous appliquons une impulsion de cinq millivolts, ou en fait une impulsion de quatre millivolts. D’accord, c’est tout. D’accord.

Maintenant, nous abaissons le potentiel de membrane moins 80, annulons le boom transitoire rapide. Maintenant, nous allons passer à la cellule entière. Je vais appliquer une légère aspiration et essayer de vendre en gros.

Ces transitoires de charge indiquent qu’il est, que la pipette et la cellule sont maintenant continues qu’il a un, un enregistrement en gros. C’est un autre beau coup. Donc, le rouge plus clair il y avait la trace de capacité, et vous pouvez voir qu’il y a un saut soudain Et puis il a diminué.

D’accord, je viens de vous montrer les techniques de base pour obtenir des enregistrements à partir d’un terminal présynaptique maintenu par un calice. Je vous ai montré comment produire les tranches qui contiennent le noyau médial du corps trapézoïdal. C’est là que vous trouverez les calices qui se sont tenus.

Et je vous ai montré les techniques pour regarder à travers les tranches. Vous allez parcourir chacune des tranches, à la recherche de la tranche qui a le plus grand nombre de caly qui se trouvent à la surface. Vous allez ensuite chercher la plus grande membrane caly que vous pouvez trouver et y fixer l’enregistrement.

Et je vous ai également montré les techniques d’enregistrement par patch clamp, et ce sont des techniques d’enregistrement standard par patch clamp.