Name: Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Découvrez les techniques d'enregistrement patch clamp présynaptique au calice de Held chez le rat. Cette méthode permet d'étudier la transmission synaptique et la libération de neurotransmetteurs en neurophysiologie.

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Installation Patch Clamp: Optique: L&#39;optique est très important de trouver une cellule bien, et d&#39;établir la position de celui-ci. Essayez d&#39;obtenir une image claire des cellules: des arêtes vives, douces prospectifs cellule. Analyser le champ entier de chercher des bonnes MNTB cellules principales avec calice. Tournez-vaisselle pour chercher calices sous différents angles. Dans un premier temps, il est OK pour la pratique sur le ballon en forme de borne. Choisissez la cellule à la surface de la tranche, ou dans la couche 2 ème cellule. Cibler le premier 1 / 3 de la cellule avec pipette Identifier les calices: Recherchez une double membrane (voir Figure 1), et tournez le plat tranche pour la voir sous des angles différents pour aider à confirmer qu&#39;il est un calice. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Figure 1" width="298" height="159" /> Figure 1 Profondeur de Calyx: Calyx devrait être sur la surface ou en tant que proche de la surface que possible. Surface disponible pour patcher: Utilisez le bouton mise au point fine sur la loupe pour déterminer comment &quot;de large / profondeur&quot; le calice est. Par exemple, ~ 10% d&#39;un tour complet sur ​​la mise au point fine vous donnera plus de surface suffisante pour patch sur. Etanchéité sur une cellule présynaptique: Pour se rendre à la cellule attachée, pour trouver un «petit» de déformation sur la surface de la cellule due à la pression pos (~ 0.15psi) dans la pipette, utilisez manipulateur d&#39;exécuter la pipette haut, le bas et à travers, et même dans la surface du terminal presyn pour obtenir une bonne déformation, puis relâchez la pression et appliquer le vide, si et tant que nécessaire. PULSE, le programme d&#39;acquisition de données: Besoin d&#39;augmenter la taille du tampon avant la première utilisation, et chaque fois que nécessaire par la capacité d&#39;échantillonnage. Besoin de charger les macros modifiés à chaque fois. Potentiel jonction liquide: Solution d&#39;enregistrement Presyn est-11mV (11mV négatif). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs comp pour presyn: 10 msec, 65% (plus de compensation possible, peut-w / out oscillations) Avant l&#39;enregistrement de capacité: détente Courant de test (10 mV, 10 msec saut) pour voir si la détente est monoexponentielle, à savoir si presyn terme peut être modélisé par un seul compartiment. Filtres: Situé à 30 kHz et 10 kHz (filtre de Bessel 1 et 2, respectivement) pendant la mesure de relaxation, pour s&#39;assurer une composante rapide n&#39;est pas raté. Pendant les enregistrements mini, Xinsheng utilisé 10 kHz et 5 kHz. LGW m&#39;a demandé d&#39;utiliser seulement le filtre 1 fixé à 30 kHz pour s&#39;assurer que nous pouvons mesurer temps de montée de mini. Nommage des fichiers: 7 chiffres 000mmxx, où mm est le mois (ou mois et année) et xx est le nombre de cellules. Nettoyage Lignes Solution: Lignes nettoyé à la fin d&#39;expérience avec 20 ml de HCl 0,1 M suivie par 200 ml ddH2O. Solutions externes sont recyclés, la vitesse de la pompe est de 20-30 min. (Solution de retour de la chambre de bain reflue dans l&#39;éprouvette graduée). Mettre en place trois lignes sortantes pour assurer aspiration suffisante. Solution pipette d&#39;enregistrement présynaptiques: ~ 310 milli osmolaire Solution Presyn doit être ~ 310 mOsm pour empêcher l&#39;accès R-augmenter durant l&#39;expérimentation. Presyn pipette solution est différente de la pipette postsyn solution (Presyn a ATP &amp; GTP par ex.). TTX-TEA Solution (pour isoler les courants Ca): <ul><li> Essayez d&#39;appliquer après le scellement, ou même le rapiéçage, sur la cellule, comme TEA dans des blocs de solution de K-canaux et dépolarise la cellule. Ce n&#39;est pas bon pour la cellule. Pour la même raison, il ne serait pas possible de réutiliser la tranche après TTX est appliquée. </li><li> Comparez la réponse première et la dernière de la cellule, ou une tranche pour vérifier tout effet d&#39;une dépolarisation prolongée. </li><li> TTX est utilisé à 1 uM au lieu de 0,5 uM donc l&#39;effet est plus rapide. Besoin d&#39;attendre moins de temps après avoir changé de solutions. </li></ul> Tranches de coupe Paramètres Vibratome: <ul><li> 70Hz vibrations latérales </li><li> Amplitude: 1,0 mm </li><li> Vitesse avant 0,01 à 0,02 mm / s tout en réduisant les tranches avec calice, 0,1 contraire épaisseur: 180 um (~ 150um dans les animaux plus âgés) </li></ul> Tranches incuber à 37 º C pendant 1 heure (temps de coupe comprend), c&#39;est à dire, laisser dans le bain à 15-20 minutes après la coupe. Pipettes: Presyn: 03/05 au 04/05 MQ au premier abord, de 3,0 à 3,5 MQ où se sentir plus confiants Utilisez manuel Extracteur pour définir les paramètres. Utilisez la fonction de retard parce que le verre est épais (retards de 200 ou 1 travail) Verre de type: borosilicaté, paroi standard, pas de filament Diamètre extérieur: 2,0 mm Le diamètre intérieur 1,16 mm Longueur: 7,5 cm

méthodes pour les enregistrements patch clamp capacité du calice

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Nous démontrons les techniques de base pour l&#39;enregistrement de patch-clamp présynaptique au calice de Held, un terminal de mammifères nerveuses du système nerveux central. Enregistrements électrique de la borne présynaptique permettent la mesure des potentiels d&#39;action, les courants des canaux calciques, la fusion des vésicules (exocytose) et l&#39;absorption de la membrane ultérieures (endocytose). La fusion des vésicules contenant des neurotransmetteurs entraîne la membrane de la vésicule d&#39;être ajouté à la membrane cellulaire du calice. Cette augmentation de la quantité de membrane cellulaire est mesurée par une augmentation de la capacité. La réduction subséquente de la capacité d&#39;endocytose indique, le processus d&#39;absorption de la membrane ou le retrait de la membrane du calice. Endocytose, est nécessaire pour maintenir la structure du calice et il est également nécessaire de former des vésicules qui sera rempli avec les neurotransmetteurs pour les événements futurs exocytose. Capacité d&#39;enregistrements au calice de Held ont permis de mesurer directement et rapidement la libération vésiculaire et l&#39;endocytose ultérieure dans un terminal nerveuses du système nerveux central des mammifères. En outre, l&#39;activité correspondante postsynaptique peut être mesurée simultanément en utilisant des enregistrements appariés. Ainsi, une image complète de l&#39;activité présynaptique et postsynaptique électrique à une synapse du système nerveux central est réalisable à l&#39;aide de cette préparation. Ici, les méthodes pour la préparation de tranche, les caractéristiques morphologiques pour l&#39;identification des calices de Held, les techniques de patch base de serrage, et des exemples d&#39;enregistrements capacité à mesurer l&#39;exocytose et l&#39;endocytose sont présentés.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

Nous démontrons les techniques de base de l'enregistrement par patch-clamp présynaptique au niveau du calyx de Held, une terminaison nerveuse du système nerveux central des mammifères. ...

Bonjour, je m'appelle Ken Paradiso. Je travaille pour Ling Gang Wu au sein du programme intramural de l'Institut national des troubles neurologiques et de l'AVC, situé sur le campus de Bethesda aux NIH. Je vais vous montrer les techniques utilisées pour l'enregistrement présynaptique en configuration whole-cell par la méthode du patch-clamp.Pour préparer le tissu cérébral, nous retirons le cerveau du rat. Nous plaçons le cerveau dans cette solution, qui doit être glacée et pauvre en calcium, et nous la saturons en carbogène afin de garantir un apport constant en oxygène au cerveau. Elle doit également être maintenue à basse température pour minimiser la DA, c’est-à-dire réduire au minimum le degré de dommages.Le cerveau se trouverait donc maintenant dans cette solution. On l'en sortirait, on le découperait de manière appropriée afin de pouvoir le placer sur le bloc, puis on le monterait sur le bloc avec du Sano correlate ou de la colle forte, mais on remplirait alors la chambre avec une solution froide, pauvre en calcium, on la bornerait d'air, on la placerait sur le vibrotrancheur, puis on découperait des tranches d'une épaisseur de 180 à 190 micromètres, avec une fréquence de lam

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Biology

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Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Courant ionique des canaux BK est enregistrée en utilisant des techniques de patch-clamp. Canaux BK sont exprimés...

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

Nous fournissons un protocole étape par étape pour la cellule entière d'enregistrement de patch-clamp de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) des courants dans les zones périphériques mononucléées du sang de cellules dérivées de lymphocytes T humains.

Cellules entières d&#39;enregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l'électrophysiologie et d'imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d'étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l'aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Ce protocole décrit une technique appelée électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, qui est une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones de Mauthner et d’autres cellules réticulospinales dans les embryons de poisson-zèbre.

Électrophysiologie par patch clamp de cellules entières : une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones

Nous avons mis au point une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte pour enregistrer et contrôler l'activité électrique via correctif enregistrement de serrage des neurones et d'autres cellules Mauthner réticulospinales dans embryons de poissons zèbres. Ainsi, nous sommes en mesure d'enregistrer les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs, l'activité des canaux voltage-dépendants et des potentiels d'action des neurones clés dans un embryon en développement.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Après l’exocytose, la membrane plasmique fusionnée est récupérée par un processus connu sous le nom d’endocytose. Ce mécanisme reforme les nouvelles vésicules synaptiques pour le prochain cycle de libération. Les événements endocytaires individuels sont capturés et analysés à l’aide des enregistrements de capacité attachés aux cellules dans les cellules de chromaffine surrénale de souris.

Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.

Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières

Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.

Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Découvrez les techniques d'enregistrement patch clamp présynaptique au calice de Held chez le rat. Cette méthode permet d'étudier la transmission synaptique et la libération de neurotransmetteurs en neurophysiologie.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

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