Name: Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Apprenez à utiliser les récipients HYPERStack de Corning en système fermé pour la culture cellulaire adhérente à haut rendement. Cette méthode améliore l'efficacité de récolte cellulaire grâce à des matériaux perméables aux gaz.

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Les auteurs tiennent à remercier Lonza Walkersville pour leur aide à la connaissance du système fermé, conception du sac, prêt de scellants sac et soudeurs, ainsi que la création du sac pour schémas HyperStack.

1. Navire HyperStack - Gaz de fond la technologie des matériaux perméables <ol><li> Le navire est un navire HyperStack multicouche pour la culture système fermé de cellules qui s'appuie sur les échanges gazeux à travers un film 76.2micron perméables aux gaz de polymères pour le métabolisme cellulaire. </li><li> Le navire HyperStack diffère de plus traditionnel des récipients de culture cellulaire en ce qu'elle n'a pas un "espace libre" au-dessus des cellules à l'intérieur du navire. Plutôt que de contenant cette "headspace" pour l'échange de gaz dans la cuve, les produits perméables aux gaz ont des espaces d'air (appelée «la trachée" espaces) sous chaque chambre de culture qui est ouvert à l'atmosphère. </li><li> Cet espace permet aux cellules trachéales croissante dans chaque compartiment de culture cellulaire du navire d'avoir un échange de gaz équivalent. </li><li> Le film de gaz perméable permet les échanges gazeux de se produire tout en préservant un environnement stérile. Toutes les manipulations des fluides pour chacune des couches multiples se produisent à travers un port d'entrée unique. </li></ol> 2. Résumé HyperStack Component navire <ol><li> Le Stackette est le compartiment des cellules individuelles de la culture qui est constitué de la plaque supérieure et le film perméable au gaz. Les cellules sont cultivées dans ce compartiment. </li><li> Le collecteur de liquide relie chacune des 12 couches stackette ensemble au sein d'un module HyperStack. Les modules sont connectés avec des tubes pour former des vaisseaux dans les couches multiples de 12. Le collecteur permet à l'utilisateur de faire une manipulation fluide à l'ensemble du navire. </li><li> Le collecteur d'air relie également les couches stackette ensemble, mais elle sert à déplacer l'air à partir du navire lorsque des ajouts d'huile se produisent. Il contient une ligne de remplissage à utiliser pendant le remplissage. </li><li> L'espace trachéale est l'espace en plein air entre chaque couche stackette, permettant les échanges gazeux de se produire à travers le cinéma perméables aux gaz de chaque couches. </li><li> Le tube de manipulation liquide est reliée au collecteur de liquide et est utilisé pour faire toutes les manipulations fermée fluide du système. Ce composant peut être personnalisée. </li><li> Le tube d'évent est relié au collecteur d'air, contient un filtre à air, et est utilisée pour libérer l'excès d'air tout en préservant la stérilité. </li><li> Le tube Chase a un filtre et la pince et sont reliés à la tubulure de manipulation de liquides et sont utilisées pour évacuer le liquide de la tubulure de manipulation de liquides après remplissage de la cuve. </li><li> Le Manipulateur Stack Corning ou CSM est un dispositif de manutention pour faciliter le chargement des navires dans les positions correctes pendant l'utilisation. </li><li> Le coin de remplissage est en acier inoxydable d'aider utilisé lorsque remplissage manuel des vaisseaux HyperStack. </li></ol> 3. Résultats Diffusion du gaz à travers du film de gaz perméable utilisée dans les récipients HyperStack <ol><li> Dans les systèmes traditionnels de la croissance cellulaire avec headspace ventilé, de l'oxygène dans les médias est appauvri une moyenne de 50% sur 3 jours de culture. (Figure 1) </li><li> Dans le système de la croissance des cellules mêmes, le gradient d'oxygène dans une hauteur de 3mm de médias est presque 50% supérieur à la presse à la jonction headspace que c'est à la couche de cellules. (Figure 2) </li><li> La diffusion de l'oxygène à travers le film de gaz 76.2micron polystyrène perméable est égale à la diffusion à travers des médias 2.6mm. Le film perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack permet l'échange de gaz se produire à la couche de cellules. </li><li> Le% d'oxygène dans l'espace trachéal des vaisseaux HyperStack reste constant que les cellules se développent au point de confluence. (Figure 3) </li></ol> 4. Préparation sac médias <ol><li> Le navire HyperStack-couche 12 prend 1.3L de médias et de l'HyperStack-36 navires couche prend 3.9L de médias. </li><li> Avant d'inoculer vos médias ensachées, si le sérum doit être utilisé, tube à souder le sac de sérum dans le sac des médias et bien mélanger. </li><li> Pince off environ 300 mL de médias dans le sac de l'aide de colliers grand sac. Cela permettra d'assurer toutes les cellules inoculées sont utilisés pendant le remplissage et aucun n'est restant dans le sac des médias. Placez les médias sac sur le stand de sac. </li></ol> 5. Médias inoculation <ol><li> Remplir une seringue avec des tubes attachés avec une suspension cellulaire. Tube à souder 3 / 16 "tube d'une seringue contenant la suspension cellulaire dans le sac des médias. </li><li> Injecter la suspension cellulaire dans le sac avec les médias et bien mélanger. </li></ol> 6. Remplissez la procédure <ol><li> Tube à souder le sac inoculé des médias à 3 / 8 "tube de manipulation de liquides. Navire HyperStack (en utilisant stérile se connecte ou se connecte polyvalent (PPM), vous pouvez aussi attacher le sac des médias à la cuve). </li><li> Fermer les pinces sur la manipulation des liquides et des tubes sur la chasse HyperStack. </li><li> Placer le récipient HyperStack couche 36 dans le CSM dans la position de la charge; accrocher le tube d'évent filtre dans la pince de fixation sur le CSM. Serrez le couvercle et placez le CSM à la position de remplissage. En mettant le bateau dans la bonne position de remplir, le filtre à air est maintenant dans la position la plus élevée pour empêcher mouillage pendant le fonctionnement de remplissage. L'angle de 10 ° permet equilibrtion du liquide dans les couches lors du remplissage. Le navire couche HyperStack-12 placé sur le côté sur le coin de remplissage est dans la position correcte pour le remplissage. </li><li> Air pur de la ligne de remplissage par le positionnement du sac au même niveau que le navire HyperStack (non plus). Garder la bride du tube chasse fermée; ouvrir la pince de manipulation de liquides du tube et la pince sac de médias pour permettre au fluide d'entrer dans le navire. </li><li> Utilisation du support sac, soulever le sac des médias pour aider à l'écoulement de suspension de cellules dans le vaisseau. </li><li> Remplissez la cuve jusqu'à ce que l'ensemble des milieux inoculés entre dans le bateau, le 300 ml de support doit toujours rester dans la partie supérieure du sac médias. Retirer le collier du sac des médias de continuer à remplir la cuve. Comme liquide s'approche du collecteur d'air supérieur, de ralentir le taux de remplissage en abaissant le sac des médias afin d'éviter de trop remplir. Porter lentement le niveau du liquide à la ligne de remplissage et de serrer le tube de manipulation de liquides. </li></ol> 7. Procédure d'isolement de l'écluse de liquide dans les couches <ol><li> Amener le navire HyperStack dans le CSM à la position de l'isolement afin que les deux ensembles de collecteurs sont dans la position la plus élevée et inférieure du sac des médias en dessous de la hauteur du récipient. Le navire HyperStack-12 couche peut être soulevé dans la position d'isolement en plaçant une main sur le côté du navire et en utilisant l'autre pour soulever le coin de remplissage. </li><li> Avec le filtre course tenue à une position verticale, ouvrez la bride du tube chasse. Ce sera vide ou chasser les médias dans le tube de manipulation de liquides dans le sac des médias. Une fois que le tube est vide, fermer la pince sur le tube sac de médias. </li><li> Garder le filtre du tube chasse dans une position verticale, ouvrir la pince sur le tube de manipulation liquides sur l'HyperStack pour permettre à tout le liquide restant d'entrer et de s'équilibrer dans la cuve. Attendre 1-2 minutes pour que cela se produise. </li><li> Faire tourner le bateau HyperStack dans le CSM afin que les collecteurs sont sur la gauche. Abaissez le navire à la position de la charge sur le CSM. Rocking l'HYPEStack-12 navires couche légèrement vers la gauche, permettre l'enlèvement de la cale de remplissage. Fermer les pinces sur les deux tubes de la chasse et la manipulation de liquides. </li><li> Le sac des médias peuvent maintenant être retiré de la cuve ou il peut rester attaché pour une utilisation ultérieure dans la procédure de récolte. Pour stocker le sac attaché médias, rouler le sac vide et tout support restant dans le sac, et les placer sous les bandes de retenue dans le plateau de stockage du navire HyperStack. </li><li> Déplacer le navire HyperStack à l'incubateur. Lors de la prise en charge des navires doivent être prises pour empêcher le liquide de pénétrer dans le filtre d'aération. Ceci est accompli par la fin de basculement multiple de la HyperStack légèrement vers le haut. </li></ol> 8. Protocole de récolte <ol><li> Pour commencer la procédure de récolte, tube à souder la solution la dissociation cellulaire et sacs étancher ensemble pour former l'ensemble de sac de récolte. S'assurer que tous les colliers de tuyau sont fermées. (Utilisez bande dessinée pour montrer) </li><li> Retirer des navires HyperStack de l'incubateur, la libération du sac des médias sous les bandes de soutènement, et accrocher sur le stand sac. Placer le récipient dans le CSM dans la position de la charge et serrer le couvercle pour sécuriser le bateau. Accrocher le tuyau d'aération dans la pince de fixation et déplacer le CSM à la position de remplissage. </li><li> S'assurer que le sac des médias sur le stand sac est suspendu inférieur au HyperStack; ouvrir la pince sur le tube sac de médias et de tubes du navire de manipulation de liquides pour permettre aux médias de couler dans le sac attaché. </li><li> Une fois que le navire est d'environ ¾ vide, modifier les paramètres du CSM à la position finale vides. Lorsque le navire HyperStack et tubes de manipulation de liquides sont vides, soulevez le tube pour chasser les médias après la pince sur le tube sac de médias passé, puis fermez la fois la pince sur le tube de manipulation de liquides et de la pince sur le tube sac de médias passé. </li><li> Remplacer le sac passé médias avec l'ensemble de sac de récolte par soudage de tubes et augmenter la hauteur de l'assemblée sac de dissociation cellulaire dessus de la hauteur de l'HyperStack l'aide du support sac. </li><li> Placez le CSM dans la position d'équilibration. Ouvrir le tube solution de dissociation cellulaire pince et le transfert de la solution dans la HyperStack. Lorsque le transfert est terminé, fermer les pinces sur le tube de manipulation de liquides et de la tuyauterie solution de dissociation cellulaire. </li><li> Apportez CSM à la position de chargement. En tenant le levier de positionnement horizontale ouverte, secouez légèrement le côté bateau à côté en utilisant la roue, la distribution de la solution sur les couches de cellules. Le navire peut parfois être retourné à la position d'équilibration au cours bascule à maintenir une répartition égale de la solution. Il peut ne pas être visuellement évident que les couches sont complètement couché, mais la solution de dissociation sera également répartie sur toute la surface des cellules. Une fois la solution a été convenablement réparties, relâchez le levier sur le CSM pour verrouiller le HyperStack en position de chargement. Laissez le HyperStack dans cette positionpendant le temps nécessaire dissociation pour vos cellules. </li><li> Une fois que les cellules se sont détachées; utilisant la turbidité comme un guide, déplacez le CSM à la position de l'équilibration. Il faut prendre soin de ne pas trop assimiler les cellules. Ouvrir la pince sac de trempe et le liquide de manipulation HyperStack pince tube pour permettre aux médias d'entrer étancher le navire. Fermez la pince sur le tube HyperStack la manipulation de liquides lorsque le transfert est terminé. </li><li> Retour au CSM de la position de charge et maintenir le levier de positionnement horizontal au rock le côté bateau à côté. </li><li> Utilisation du support sac, abaisser la position de l'assemblée sac de récolte en dessous du niveau de l'HyperStack. Réglez le CSM à la position vide, ouvrez le tube de manutention des navires de liquide pince et transférer la solution de cellules dans le sac étancher. Retour au CSM de la position de chargement et de déconnecter l'ensemble de sac de récolte de la cuve en utilisant un scellant le tube. La solution la cellule est prête pour la transformation. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <ul><li> La récolte de temps doit être optimisé lors de la conversion d'une surface de polystyrène standard à la surface de polystyrène perméable au gaz. Les cellules ont tendance à libérer plus rapidement sur le produit HyperStack. </li><li> Pour visualiser les cellules sous un microscope le tube d'aération et de manipulation de liquide doit être serré au large. Placer le récipient HyperStack tête en bas, avec les collecteurs pointant vers le bas, sur la platine du microscope. </li><li> Mesures de prévention peuvent être prises pour éviter de mouiller les filtres lors de l'utilisation qui sera amener à cesser de fonctionner. En ne plus remplir la cuve HyperStack et en gardant l'évent et le tube chasse élevés lorsque les pinces sont ouvertes, aucune humidification devrait se produire. </li><li> La pression des pinces fermées sur le tube provoque de rester fermée après les pinces sont ouvertes. Pincer le tuyau dans la direction opposée de l'ouvrir. </li><li> Temps d'écoulement des médias entrant et sortant du navire HyperStack via l'alimentation par gravité est basé sur la différence de hauteur entre le support de haut niveau des médias dans la cuve HyperStack et le niveau supérieur des médias dans le récipient médias. La plus grande distance, plus le débit. Le débit maximal est limité par la notation des filtres pour 1.5L/min. </li><li> Maintenir bon volume de remplissage de la cuve HyperStack permettra d'éviter la formation de bulles d'air dans les chambres à la croissance cellulaire. Les bulles d'air peuvent se produire en raison de l'échantillonnage ou en incubation dans un environnement unhumidified due à la perte d'eau par évaporation. Le montant et la fréquence d'échantillonnage ainsi que les conditions d'incubation va déterminer si le liquide supplémentaires devraient être ajoutés par l'utilisateur final. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Appauvrissement en oxygène des médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre la diminution en mg / L d'oxygène au niveau des cellules sur 3 jours. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Gradient d'oxygène dans les médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre l'mg / L d'oxygène est plus grande au média à l'intersection headspace qu'à la couche de cellules. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Pourcentage d'oxygène dans l'espace trachéale de l'HyperStack pendant la croissance cellulaire. La figure montre que plus de 96 heures, le pourcentage d'oxygène entre les couches, qui fournit chaque fond films perméables aux gaz, reste constante. Ceci démontre la capacité des cellules à l'accès d'oxygène pendant la croissance jusqu'à la confluence.

Le navire HyperStack perméables aux gaz de technologie est couvert sous le brevet américain #: 7745209. Les auteurs sont des employés de Corning Life Sciences, Inc qui produit l&#39;instrument utilisé dans cet article.

Navire HyperStack a cultivé avec succès d&#39;ingénierie, des cellules primaires et des souches. Ajouts de liquide dans la cuve ont été menées via des connexions sac aseptique par alimentation par gravité et par pompage à partir d&#39;un contenant stérile médias. Le navire prévoit une augmentation supérieure à la croissance dans la zone de 2.5X contre un produit de plaques empilées le même encombrement volumétrique. Le HyperStack-12 a 6000 secteur de croissance cm 2, la HyperStack-36 a 18000 secteur de croissance cm 2, et le HyperStack-120 a 60 000 cm 2 de surface de croissance. En augmentant la surface, les utilisateurs sont capables de produire plus de cellules provenant de la même population cellulaire ou un lot et de réduire la variabilité. Ils sont également capables d&#39;économiser de l&#39;espace et / ou de travail en utilisant moins de bateaux pour atteindre la sortie même cellule, ou d&#39;augmenter la production de cellules sans ajout de personnes, des suites de salle blanche, ou les incubateurs. Le système est produit avec des méthodes d&#39;assemblage des particules faibles et sans l&#39;utilisation d&#39;adhésifs. C&#39;est un système fermé qui est prémonté avec des ensembles de tubes et les filtres, triple ensachés et fournis stériles.

<table><tbody><tr><td>Support de milieu de 1,5 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350 ml de milieu + 150 ml de sérum (si requis)</td></tr><tr><td>Support de milieu de 4,0 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600 ml de milieu + 400 ml de sérum (si requis)</td></tr><tr><td>Récipient HYPERStack-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Récipient HYPERStack-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Cale de remplissage</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Manutentionneur de piles</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d'échantillonnage HyQtainer, sous-ensemble</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>Éteigneur de milieu en sachet de 600 ml (IMDM avec 10 % de FCS)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation cellulaire en sachet de 600 ml</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

fermé protocole culture cell system utilisant des navires hyperstack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Grand volume de culture de cellules adhérentes est actuellement standardisées sur les produits plaques empilées croissance cellulaire lorsqu&#39;ils ne sont pas des perles microporteur un choix optimal. Vaisseaux HyperStack permettent échelle du système fermé à partir des produits actuels plaques empilées et offre&gt; 2.5X plus de cellules dans le bilan volumétrique même. Les navires HyperStack fonction via matériau perméable au gaz qui permet l&#39;échange de gaz de se produire, éliminant ainsi le besoin d&#39;espace libre interne au sein d&#39;un navire. L&#39;élimination de l&#39;espace libre permet le compartiment où la croissance des cellules se produit à minimiser afin de réduire l&#39;espace, permettant ainsi de plusieurs couches de surface de croissance des cellules dans l&#39;empreinte volumétrique même. Pour de nombreuses applications telles que la thérapie cellulaire ou la production de vaccins, un système fermé est nécessaire pour la croissance cellulaire et la récolte. Le navire HyperStack permet l&#39;ajout de cellules et de réactifs et la suppression via un tube à partir de sacs médias ou d&#39;autres méthodes. Ce protocole sera d&#39;expliquer la technologie derrière le matériel perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack, les résultats de diffusion des gaz pour satisfaire les besoins métaboliques des cellules, fermées protocoles du système de la croissance cellulaire, et les méthodes de récolte différentes.

Une introduction à la technologie, le protocole et la manutention des navires HyperStack Corning et accessoires utilisés pour le rendement élevé de culture de cellules adhérentes. Le protocole va montrer comment utiliser le système fermé des navires pour la récolte de cellules augmente plus les produits actuels plaques empilées.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

La culture de cellules adhérentes à grand volume est actuellement standardisée sur des produits de croissance cellulaire à plaques empilées lorsque les billes de microporteurs ne constituent pas un choix optimal.

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation correcte en système fermé des vaisseaux empilés Corning Hypers. Cela est réalisé en premier lieu en inoculant les vaisseaux et en les remplissant de milieu par la méthode d'alimentation par gravité. Ensuite, la suspension cellulaire est isolée dans chacune des couches et les cellules sont incubées.Après l'incubation, le milieu utilisé est éliminé. La dernière étape de la procédure consiste à récolter les cellules à partir des vaisseaux en empilement hypers. En fin de compte, les résultats de diffusion des gaz sont obtenus afin de démontrer la capacité des cellules à accéder à l'oxygène pendant leur croissance jusqu'à confluence lorsque le système fermé en empilement hypers est utilisé.Le principal avantage du récipient Hypers Stack doté d'un matériau perméable aux gaz est qu'il offre une surface accrue pour la croissance cellulaire. En éliminant l'espace de tête dans le récipient, mon collègue p pardo va maintenant démontrer un protocole en système clos pour l'utilisation du récipient Hypers Stack. Le récipient Hypers Stack est composé d'un étage, qui est le compartiment individuel de culture cellulaire constitué de la plaque supérieure et du film perméable aux gaz.Les cellules sont cultivées dans ce compartiment. Le collecteur liquide relie chacune des couches entre elles au sein d'un module. Les modules sont reliés par des tubes afin de former des vaisseaux constitués de multiples de 12 couches.L'ensemble permet à l'utilisateur d'effectuer une seule manipulation des fluides sur l'ensemble du récipient. L'ensemble pneumatique relie également les couches stat entre elles, mais sert à déplacer l'air du récipient lors des ajouts de liquide et comporte une ligne de remplissage utilisée pendant le remplissage entre chaque couche. La couche stat est un espace ouvert à l'air appelé espace trachéal, permettant les échanges gazeux à travers la membrane perméable aux gaz de chaque couche.Le tube de manipulation des liquides est relié au collecteur de liquide et constitue un composant personnalisable utilisé pour effectuer toutes les manipulations de fluides en système fermé afin d'éliminer l'excès d'air tout en maintenant la stérilité. Le tube de ventilation est utilisé. Le tube de ventilation est relié au collecteur d'air et contient un filtre à air.Connecté au tube de manipulation des liquides, on trouve le tube de rinçage et le filtre, qui servent à évacuer le liquide du tube de manipulation après le remplissage du récipient. Également utilisé dans ce protocole, le manipulateur Corning Stack, ou CSM, est un dispositif de manipulation qui facilite le positionnement correct des récipients pendant leur utilisation. Dans cette démonstration, la culture cellulaire en système clos est illustrée pour un récipient perméable aux gaz comportant 36 couches.À l'aide d'un CSM, toutefois, les détails pour effectuer cette procédure sur un récipient de 12 couches en utilisant un coin de remplissage sont disponibles dans le protocole écrit joint. Commencez par préparer 3,9 litres de milieu en sachet avant d'ensemencer le tube de milieu. Faites communiquer le sachet de sérum avec le sachet de milieu et mélangez soigneusement afin d'obtenir la concentration souhaitée de sérum.Pincez environ 300 millilitres de milieu dans le sac à l’aide de pinces larges pour sac. Cela garantit que toutes les cellules inoculées seront utilisées lors du remplissage, et qu’aucune ne restera dans le sac de milieu. Placez le sac de milieu sur un support pour inoculer le milieu.Remplissez une seringue reliée à un tube avec la suspension cellulaire. Fixez la seringue contenant la suspension cellulaire au sac de milieu par soudure de tube. Trois pouces et seize du tube de la seringue au sac.Injectez la suspension cellulaire dans le sac de milieu et mélangez soigneusement. Le sac de milieu inoculé peut être raccordé au tube de transfert de liquide de trois huitièmes de pouce du récipient par soudage de tube ou à l’aide de raccords polyvalents. Aujourd’hui, nous utiliserons le soudage de tube.Fermer les pinces sur les tubes de manipulation du liquide et de suivi du récipient. Placer le récipient à 36 couches dans un CSM en position de chargement. Raccorder le tube du filtre de ventilation à la pince de maintien sur le CSM.Serrer le couvercle et déplacer le CSM en position de remplissage afin de placer le filtre à air en position la plus élevée pour éviter tout mouillage pendant l'opération de remplissage. L'angle de 10 degrés permet également l'équilibration du liquide entre les couches pendant le remplissage, en évacuant l'air de la ligne de remplissage. En positionnant le sac de milieu au même niveau que le récipient tout en maintenant la pince du tube de rinçage fermée.Ouvrir la pince du tube de manipulation des liquides et la pince du sac de milieu pour permettre au fluide d'entrer dans le récipient. À l'aide du support pour sac, soulever le sac de milieu afin d'aider la suspension cellulaire à s'écouler dans le récipient. Remplir le récipient jusqu'à ce que tout le milieu inoculé soit entré dans le récipient.La partie supérieure du sac de milieu doit encore contenir 300 millilitres de milieu. Retirer la pince du sac de milieu pour continuer à remplir le récipient lorsque le liquide atteint le collecteur d'air supérieur. Ralentir le débit de remplissage en abaissant le sac de milieu afin d'éviter un trop-plein.Amenez lentement le niveau de liquide jusqu'à la ligne de remplissage et pincez le tube de manipulation du liquide. Placez le récipient dans le CSM en position d'isolement en mettant les deux jeux de collecteurs en position haute. Abaissez le sac de milieu en dessous de la hauteur du récipient.Avec le filtre de transfert maintenu en position verticale, ouvrez la pince du tube de transfert. Cela permettra de faire revenir le milieu contenu dans le tube de manipulation des liquides vers le sac de milieu. Une fois le tube vide, fermez la pince sur le tube du sac de milieu.Conserver le filtre du tube de récupération en position verticale. Ouvrir le collier sur le tube de transfert du liquide du récipient afin de permettre à tout liquide restant d'entrer et de s'équilibrer dans le récipient. Attendre une à deux minutes pour que cela se produise.Ensuite, tournez le récipient dans le module de support clinostat (CSM) de manière à ce que les collecteurs se trouvent à gauche. Abaissez le récipient jusqu'à la position de chargement sur le CSM. Fermez les pinces sur les tubulures de transfert et de manipulation des liquides.Le sac de milieu peut maintenant être retiré du récipient, ou il peut rester attaché pour une utilisation ultérieure lors de la procédure de récolte. Pour ranger le sac de milieu attaché, roulez-le et placez-le sous les bandes de maintien dans le plateau de rangement du récipient. Enfin, déplacez le récipient dans l’incubateur. Lorsque vous transportez le récipient, veillez à ce qu’aucun liquide n’entre dans le filtre du vent d’aération.Cela s'effectue en inclinant légèrement l'extrémité du collecteur vers le haut. Pour commencer la procédure de récolte, soudez le tube, la solution d'association des cellules et les poches de trempe ensemble afin de former l'ensemble de poche de récolte, et assurez-vous que toutes les pinces de tubulure soient fermées. Retirez le récipient de l'incubateur et placez-le dans le SMC en position de chargement.Détachez le sac de milieu des bandes de retenue et accrochez-le au sac. Ensuite, placez-vous debout, serrez le couvercle pour fixer le récipient. Accrochez le tube de ventilation dans la pince de maintien et déplacez le CSM en position de remplissage.S'assurer que le sac de milieu sur le support est suspendu plus bas que le récipient. Ouvrir le collier de serrage sur le tube du sac de milieu et sur le tube de manipulation du liquide du récipient afin de permettre au milieu de s'écouler dans le sac raccordé. Une fois que le récipient est environ aux trois quarts vide, modifier les paramètres du CSM pour passer à la position finale vide.Lorsque le récipient et le tube de transfert du liquide sont vides, soulevez le tube afin de faire avancer le milieu au-delà du pinçon sur le tube du sac de milieu usagé. Fermez ensuite le pinçon situé sur le tube de transfert du liquide et celui situé sur le tube du sac de milieu usagé. Remplacez le sac de milieu usagé par l'ensemble du sac de récolte par soudure de tubes.Élevez la hauteur de l'ensemble du sac de dissociation cellulaire au-dessus de celle du récipient à l'aide du support pour sac. Placez le CSM en position de remplissage. Ouvrez la pince du tube de solution de dissociation cellulaire et la pince de l'ensemble du sac de récolte, puis transférez la solution dans le récipient.Lorsque le transfert est terminé, fermez les pinces sur les tubulures de manipulation des liquides et sur celles de la solution de dissociation cellulaire. Ensuite, amenez le CSM en position de chargement tout en maintenant le levier de positionnement horizontal ouvert. Balancez doucement le récipient d’un côté à l’autre à l’aide de la roue, en répartissant la solution sur les couches cellulaires.Le récipient peut parfois être ramené en position de remplissage pendant le basculement afin de maintenir une répartition uniforme de la solution. Une fois que la solution est correctement répartie, relâchez le levier du CSM pour verrouiller la position de remplissage. Laissez le récipient dans cette position pendant la durée de dissociation requise pour les cellules.Utilisez la turbidité comme indicateur pour déterminer le détachement des cellules. Une fois détachées, déplacez le CSM en position de chargement. Ouvrez le collier du sac de trempage et le collier du tube de transfert de liquide pour permettre au milieu de trempe d'entrer dans le récipient.Fermez le collier sur le tube de manipulation des liquides. Une fois le transfert terminé, remettez le CSM en position de chargement et maintenez le levier de positionnement horizontal pour balancer le récipient d’un côté à l’autre. À l’aide du support de poche, abaissez la poche de récolte en dessous du niveau du récipient.Régler le CSM sur la position vide. Ouvrir la pince du tube de manipulation des liquides du récipient et transférer la solution cellulaire dans le sac de trempage. Ramener le CSM en position de chargement et déconnecter l'ensemble du sac de récolte du récipient à l'aide d'un scelleur de tube.La solution cellulaire est désormais prête à être traitée dans des systèmes classiques de culture cellulaire. Avec Headspace, l'oxygène présent dans le milieu est appauvri en moyenne de 50 % sur une période de trois jours. En culture, ce graphique illustre la diminution, exprimée en milligrammes par litre, de la concentration en oxygène au niveau des cellules en fonction du temps dans le même système de culture ; le gradient d'oxygène sur une hauteur de milieu de trois millimètres est presque 50 % plus élevé au niveau de l'interface milieu-Headspace qu'au niveau de la couche cellulaire.Le pourcentage d'oxygène dans l'espace trachéal de l'empilement hypers pendant la croissance cellulaire est indiqué. La figure montre qu'au cours de 96 heures, le pourcentage d'oxygène entre les couches, qui alimente chaque fond en film perméable aux gaz, reste constant. Cela démontre la capacité des cellules à accéder à l'oxygène pendant leur croissance jusqu'à la confluence.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment remplir et récolter le flacon Corning Hypers stack en système fermé.

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Système de pile à rotation culture qui permet aux cellules épithéliales de croître dans des conditions physiologiques résultant en 3-D formation d'agrégats cellulaires est décrite. Les agrégats généré...

La culture et les applications de rotation bioréacteur de la paroi vasculaire dérivé de modèles 3D de cellules épithéliales

Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.

Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

Ce protocole décrit un procédé pour la perméabilisation temporaire de cellules adhérentes au moyen d'un jet de gaz inerte. Cette technique facilite le transfert de matériel génétique et de biomolécules dans des cellules de mammifères adhérentes par l'utilisation des forces mécaniques pour rompre la membrane de plasma.

Perméabilisation des cellules adhérant à l&#39;aide d&#39;un gaz inerte Jet

Voici un protocole pour cultiver des cellules souches pluripotentes (CSP) et des cellules souches neurales (CSN) dans un système de culture cellulaire fermé qui permet une stérilité et une reproductibilité maximales, remplaçant l’enceinte de biosécurité et l’incubateur traditionnels. Cet équipement est conforme aux directives de bonnes pratiques de fabrication clinique (cGMP) et de bonnes pratiques de laboratoire clinique (cGLP).

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la culture de cellules uniques avec une plateforme microfluidique, qui utilise un nouveau concept de conception de micropuits pour permettre l’isolement de cellules uniques à haute efficacité et la culture clonale à long terme.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Nous présentons un modèle microfluidique de cancer sur puce, la technologie « Accélérateur d'évolution », qui fournit une plate-forme contrôlable pour des études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à une cellule unique niveau. Cette technologie devrait servir de modèle in vitro pour la recherche fondamentale ou le développement de médicaments précliniques.

Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel

Ici, nous présentons un protocole pour récolter les cellules adhérentes des flacons multicouches de manière semi-automatisée fermée à l’aide d’un système de centrifugation à contre-courant. Ce protocole peut être appliqué pour récolter à la fois des cellules adhérentes et des cellules en suspension à partir d’autres plates-formes d’expansion cellulaire avec peu de modifications aux étapes existantes.

Traitement des cellules souches mésenchymateuses humaines pour des applications cliniques à l’aide d’un flux de travail semi-automatisé fermé

Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser la fabrication à grande échelle de cellules adhérentes grâce à un système entièrement fermé basé sur des microporteurs solubles de qualité GMP. La culture de cellules souches mésenchymateuses humaines, de cellules HEK293T et de cellules Vero a été validée et a répondu à la fois aux exigences quantitatives et aux critères de qualité de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique.

Production de cellules à grande échelle à base de microporteurs poreux solubles de qualité GMP

Apprenez à utiliser les récipients HYPERStack de Corning en système fermé pour la culture cellulaire adhérente à haut rendement. Cette méthode améliore l'efficacité de récolte cellulaire grâce à des matériaux perméables aux gaz.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

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