Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

L’objectif général de cette procédure est de démontrer l’utilisation correcte du système fermé des navires de pile Corning Hypers. Pour ce faire, on inocule d’abord et on remplit les récipients de milieu par la méthode d’alimentation par gravité. Ensuite, la suspension cellulaire est isolée dans chacune des couches et les cellules sont incubées.

Après l’incubation, le milieu usagé est retiré. La dernière étape de la procédure consiste à récolter les cellules des vaisseaux de l’hyper empilement. En fin de compte, des résultats de diffusion de gaz sont obtenus pour montrer la capacité des cellules à accéder à l’oxygène pendant la croissance à la co-fluidité lorsque le système fermé hypers stack est utilisé.

Le principal avantage du vaisseau hypers stack avec un matériau perméable aux gaz est qu’il offre une surface accrue pour la croissance cellulaire. En éliminant l’espace libre dans le vaisseau, mon collègue p pardo va maintenant faire la démonstration d’un protocole de système fermé pour l’utilisation du vaisseau hypers stack. Le vaisseau hypers stack est composé d’une stat, qui est le compartiment de culture cellulaire individuel composé de la plaque supérieure et d’un film perméable aux gaz.

Les cellules sont cultivées à l’intérieur de ce compartiment. Le collecteur de liquide relie chacune des couches de l’ette ensemble au sein d’un module. Les modules sont reliés par des tubes pour former des récipients en multiples de 12 couches.

Le collecteur permet à l’utilisateur d’effectuer une manipulation fluide sur l’ensemble du récipient. Le collecteur d’air relie également les couches de stats entre elles, mais il est utilisé pour déplacer l’air du récipient lorsque des ajouts de fluide se produisent et contient une ligne de remplissage à utiliser pendant le remplissage entre chacune. La couche de stats est un espace à l’air libre appelé espace trachéal, permettant aux échanges gazeux de se produire à travers le film perméable aux gaz de chaque couche.

Le tube de manipulation des liquides est connecté au collecteur de liquide et constitue un composant personnalisable utilisé pour effectuer toutes les manipulations de fluides en système fermé afin de libérer l’excès d’air tout en maintenant la stérilité. Le tube d’aération est utilisé. Le tube de ventilation est relié au collecteur d’air et contient un filtre à air.

Le tube de chasse et le filtre sont reliés au tube de manipulation des liquides, qui sont utilisés pour évacuer le fluide du tube de manipulation des liquides après le remplissage du récipient. Le manipulateur Corning Stack ou CSM est également utilisé dans ce protocole, qui est un dispositif de manipulation permettant de placer les récipients dans les bonnes positions pendant l’utilisation. Dans cette démonstration, la culture cellulaire en système fermé est démontrée pour un récipient perméable au gaz à 36 couches.

Cependant, à l’aide d’un CSM, les détails pour effectuer cette procédure sur un récipient à 12 couches à l’aide d’une cale de remplissage peuvent être trouvés dans le protocole écrit ci-joint. Commencez par préparer 3,9 litres de milieu en sac avant d’inoculer le tube de milieu. Mouillez le sac de sérum dans le sac de milieu et mélangez soigneusement pour obtenir la concentration sérique souhaitée.

Clamp environ 300 millilitres de fluide dans le sac à l’aide de grandes pinces à sac. Cela permettra de s’assurer que toutes les cellules inoculées sont utilisées pendant le remplissage et qu’il n’en reste aucune dans le sac de milieu. Placez le support sur un support de sac pour inoculer le support.

Remplissez une seringue fixée à la tubulure avec une suspension cellulaire. Fixez la seringue contenant la suspension cellulaire au sac de support par soudage du tube. Trois tubes de plus de 16 pouces de la seringue au sac.

Injectez la suspension cellulaire dans le sac de média et mélangez bien. Le sac de milieu inoculé peut être fixé aux trois tubes de manipulation des liquides de plus de huit pouces du récipient par soudage de tube ou à l’aide de connecteurs polyvalents. Aujourd’hui, nous allons utiliser le soudage de tubes.

Fermez les colliers de manipulation des liquides et les tubes de chasse de la cuve. Placez le récipient à 36 couches dans un CSM en position de chargement. Accrochez le tube du filtre d’aération dans la pince de maintien du CSM.

Serrez le couvercle et déplacez le CSM en position de remplissage pour placer le filtre à air dans la position la plus haute afin d’éviter l’humidité pendant le remplissage. L’angle de 10 degrés permet également d’équilibrer le liquide par rapport aux couches lors du remplissage d’air clair à partir de la ligne de remplissage. En positionnant le sac de média au même niveau que le récipient, en maintenant le collier de serrage du tube de poursuite fermé.

Ouvrez le collier du tube de manipulation des liquides et le collier du sac de média pour permettre au fluide de pénétrer dans le récipient. À l’aide du support de sac, soulevez le sac de média pour aider la suspension cellulaire à s’écouler dans le récipient. Remplissez le récipient jusqu’à ce que tout le milieu inoculé pénètre dans le récipient.

La partie supérieure du sac de support doit encore contenir 300 millilitres de support. Retirez la pince du sac de support pour continuer à remplir le récipient lorsque le liquide s’approche du collecteur d’air supérieur. Ralentissez le taux de remplissage en abaissant le sac de média pour éviter un remplissage excessif.

Amenez lentement le niveau de liquide jusqu’à la ligne de remplissage et agglomérez le tube de manipulation du liquide. Amenez la cuve dans le CSM en position d’isolation en plaçant les deux ensembles de collecteurs dans la position la plus haute. Abaissez le sac de support en dessous de la hauteur du récipient.

Avec le filtre de chasse maintenu en position verticale, ouvrez le collier de serrage du tube de poursuite. Cela videra ou chassera le support dans le tube de manipulation du liquide dans le sac de support. Une fois que la tubulure est vide, fermez la pince sur la tubulure du sac de support.

Maintenir le filtre du tube de chasse en position verticale. Ouvrez la pince sur le tube de manipulation des liquides de la cuve pour permettre à tout liquide restant d’entrer et de s’équilibrer dans la cuve. Attendez une à deux minutes pour que cela se produise.

Ensuite, tournez le récipient dans le CSM de manière à ce que les collecteurs soient à gauche. Abaissez le récipient en position de charge sur le CSM. Fermez les pinces sur le tube de poursuite et de manipulation des liquides.

Le sac de milieu peut maintenant être retiré du récipient ou il peut rester attaché pour être utilisé plus tard dans la procédure de récolte. Pour ranger le sac de support attaché, roulez-le et placez-le sous les bandes de retenue dans le plateau de rangement du récipient. Enfin, déplacez le récipient dans l’incubateur Lorsque vous transportez le récipient, veillez à empêcher tout liquide de pénétrer dans le filtre de ventilation.

Ceci est accompli en inclinant légèrement l’extrémité du collecteur vers le haut. Pour commencer la procédure de récolte, soudez les cellules Solution d’association et les sacs de trempe ensemble Pour former l’ensemble du sac de récolte, assurez-vous que toutes les pinces de tube sont fermées. Retirez le récipient de l’incubateur et placez-le dans le CSM en position de chargement.

Dégagez le sac de support de dessous les bandes de retenue et accrochez-le au sac. Tenez-vous ensuite, serrez le couvercle pour sécuriser le récipient. Accrochez le tube d’aération dans la pince de maintien et déplacez le CSM en position de remplissage.

Assurez-vous que le sac de support sur le support de sac est suspendu plus bas que le récipient. Ouvrez la pince sur le tube du sac de support et le tube de manipulation des liquides du récipient pour permettre au fluide de s’écouler dans le sac attaché. Une fois que le navire est vide aux trois quarts environ, modifiez les paramètres du CSM sur la position vide finale.

Lorsque le récipient et le tube de manipulation des liquides sont vides, soulevez le tube pour chasser le support au-delà de la pince du tube du sac de support usé. Fermez ensuite la pince sur le tube de manipulation des liquides et la pince sur le tube du sac de support usagé. Remplacez le sac de média usagé par l’ensemble du sac de récolte par soudage de tube.

Élevez la hauteur du sac de dissociation cellulaire au-dessus de la hauteur du récipient à l’aide du support de sac. Placez le CSM en position de remplissage. Ouvrez le collier de serrage du tube de la solution de dissociation cellulaire et le collier du sac de récolte et transférez la solution dans le récipient.

Lorsque le transfert est terminé, fermez les colliers de la tubulure de manipulation des liquides et de la tubulure de la solution de dissociation cellulaire. Ensuite, amenez le CSM en position de chargement tout en maintenant le levier de positionnement horizontal ouvert. Balancez doucement le récipient d’un côté à l’autre à l’aide de la roue, en répartissant la solution sur les couches cellulaires.

Le récipient peut parfois être remis en position de remplissage pendant le balancement pour maintenir une distribution égale de la solution. Une fois que la solution a été correctement distribuée, relâchez le levier sur le CSM pour verrouiller la position de remplissage. Laissez le vaisseau dans cette position pendant le temps de dissociation requis pour les cellules.

Utilisez la turbidité comme guide pour déterminer le détachement des cellules. Une fois détaché, déplacez le CSM en position de chargement. Ouvrez la pince du sac de trempe et la pince du tube de manipulation des liquides pour permettre au fluide de trempe de pénétrer dans la cuve.

Fermez la pince sur le tube de manipulation des liquides. Une fois le transfert terminé, remettez le CSM en position de charge et maintenez le levier de positionnement horizontal pour faire basculer le navire d’un côté à l’autre. À l’aide du support de sac, abaissez la position de l’ensemble de sac de récolte au-dessous du niveau du récipient.

Réglez le CSM en position vide. Ouvrez le tube de manipulation des liquides de la cuve et transférez la solution cellulaire dans le sac de trempe. Remettez le CSM en position de chargement et déconnectez l’ensemble du sac de récolte de la cuve à l’aide d’une scelleuse de tubes.

Aujourd’hui, la solution cellulaire est prête à être traitée dans les systèmes de croissance cellulaire traditionnels. Avec Headspace, l’oxygène dans les médias s’épuise en moyenne de 50 % sur trois jours. En culture, cette figure montre la diminution en milligrammes par litre d’oxygène au niveau des cellules au fil du temps dans le même système de croissance, le gradient d’oxygène à travers une hauteur de milieu de trois millimètres est presque 50 % plus important à la jonction milieu-espace de tête qu’il ne l’est à la couche cellulaire.

Le pourcentage d’oxygène dans l’espace trachéal de l’hyperpile pendant la croissance cellulaire est indiqué. La figure montre que sur 96 heures, le pourcentage d’oxygène entre les couches qui alimente chaque fond de film perméable aux gaz reste constant. Cela démontre la capacité des cellules à accéder à l’oxygène pendant la croissance pour co-fluidité.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de remplir et de récolter le récipient de pile Corning Hypers dans le système fermé.