Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae

L’objectif général de cette procédure est d’initier les étudiants de premier cycle en sciences à la technologie des microréseaux en examinant les différences d’expression dans les levures soumises à un stress oxydatif. Pour ce faire, on isole d’abord l’ARN total des cultures de levure traitées au peroxyde d’hydrogène et des témoins non traités. La deuxième étape de la procédure consiste à générer et à purifier l’ADNC à partir de ces échantillons d’ARN.

L’ARNC est ensuite utilisé pour préparer l’ARNcr marqué à la biotine par transcription in vitro. La dernière étape de la procédure est la fragmentation des ARNC marqués à la biotine pour l’hybridation avec les puces génétiques de levure AFI. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les différences d’expression dans les deux échantillons de levure et, grâce à la bioinformatique, démontrent la puissance de l’analyse des microréseaux aux étudiants de premier cycle.

L’équipe de sensibilisation du Vermont Genetics Network a eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsqu’elle a été chargée de fournir la technologie des microrayons aux étudiants en sciences de tout l’État du Vermont afin d’améliorer leur enseignement des sciences. À ce jour, cette méthode a été dispensée dans plusieurs sites de huit collèges de baccalauréat à travers l’État. Ainsi, le principal avantage de l’utilisation des microrayons dans les modules d’enseignement, c’est qu’il nous donne la possibilité d’enseigner des techniques générales de biologie moléculaire qui sont utilisées tous les jours dans le laboratoire à un groupe d’individus.

Et nous pouvons également l’utiliser pour enseigner aux élèves et aux enseignants et à nos groupes. En fait, nous avons des étudiants et des professeurs qui travaillent ensemble sur le même projet. Ils apprennent certaines techniques qui demandent beaucoup de finesse, comme la manipulation de l’ARN, qui n’est pas une tâche facile.

Ils apprennent à précipiter l’ADN à l’aide de réactifs de visualisation. Ils ont l’occasion d’utiliser les techniques qu’ils vont rencontrer dans leurs études supérieures ou dans les laboratoires de biologie moléculaire de tous les jours. Bien que cette méthode soit adaptée pour mieux comprendre le stress oxydatif et la levure, elle est certainement applicable à d’autres organismes modèles et à d’autres systèmes biologiques que vous voudrez peut-être examiner.

L’expression des gènes change, qu’ils soient associés à des changements de développement, à des toxines environnementales, à des états pathologiques spécifiques et à bien d’autres encore. Pour examiner les différences d’expression chez les levures soumises à un stress oxydatif, l’ARN total est d’abord extrait de deux cultures de levure par lyse enzymatique. Une culture a été exposée à un stress oxydatif par un traitement d’une heure avec du peroxyde d’hydrogène de 0,5 millimolaire dans une solution saline tamponnée de Hank, tandis que l’autre culture a été traitée avec uniquement HBSS comme témoin.

Commencez par étiqueter deux microtubes à centrifuger de 1,7 millilitre avec les informations d’identification appropriées. Transférez 1,5 millilitre de la culture de levure appropriée dans chaque tube. Centrifugez les tubes à 5 000 G pendant deux minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, à l’aide d’une micro-pipette, retirez et jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Vérifiez que la pastille est suffisamment grosse avant de poursuivre la procédure. Si la pastille est trop petite, ajoutez 1,5 millilitre de culture dans le même tube contenant la pastille, puis centrifugez-la pour obtenir une pastille plus grosse.

Jetez le surnageant à l’aide d’une micro-pipette, en retirant autant de liquide que possible de la pastille de levure. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon SG et 30 microlitres de solution de lise dans le vortex de granulés de levure pour mélanger. Incuber les deux tubes pendant 30 minutes à température ambiante pendant l’incubation.

Tournez doucement chaque tube toutes les 10 minutes pour générer des plats. L’une des étapes les plus critiques lorsque vous faites un placage Sphero de levure est de vous assurer que vous avez réellement créé un plaste Sphero à cent pour cent après le traitement. Cela signifie que toutes les enzymes lytiques ne sont pas égales.

Vous devez donc vous assurer qu’une bonne enzyme lytique vous donne un bon placage de sphero, ce qui signifie que vous devez prélever ces échantillons, les mettre sur une lame de microscope et vérifier au microscope en ajoutant 0,1 % de SDS pour vous assurer que vous avez bien une formation de protoplastes. Pour observer le placage complet du sphérocle, pipetez 10 microlitres de l’échantillon de levure sur une lame de microscope tout en examinant l’échantillon au microscope à un microlitre de 0,1 % SDS pour faire gonfler les cellules de levure et former des sphères ou des sphéroïdes parfaits. Il est important d’observer que les cellules bourgeonnantes forment également des sphéroïdes S.

Si un placage sphero partiel est observé, un traitement prolongé avec de la lise est recommandé. Une fois que le placage sphero complet a été confirmé, à 350 microlitres de tampon BRLT dans chaque tube, ajoutez 250 microlitres d’éthanol à 100 %. Assurez-vous que le tube est bien fermé en maintenant le couvercle fermé et agitez vigoureusement pendant une minute.

Cette procédure va époux les plateaux Sphero. Après cela, utilisez des colonnes de spin R et Z faciles pour collecter et nettoyer l’ARN des deux cultures. Enfin, évaluez la qualité de l’ARN extrait à l’aide de 1,2 % de gel d’aros préfabriqué pour l’électrophorèse afin de préparer de la biotine marquée CRNA.

L’ARN total extrait des cellules de levure est d’abord utilisé pour synthétiser CD NA par transcription inverse. Après la génération de CD NA, préparez des tubes de gel à verrouillage de phase pour une utilisation dans les tubes de gel à verrouillage de phase de la centrifugeuse de précipitation CD NA à pleine vitesse pendant une minute pour s’assurer que le gel se trouve au fond du tube. Ne pas utiliser de tubes à verrouillage de phase vortex pour précipiter la pipette CD NA 162 microlitres de la couche inférieure d’un mélange de phénylchloroforme tamponné au pH 8,0, d’alcool isoamylique ou de PCI et ajouter au contenu de 162 microlitres du deuxième brin, tube de réaction de synthèse CD NA, des volumes égaux de mélanges aqueux et organiques sont nécessaires pour cette étape.

Agitez pendant cinq secondes pour mélanger le contenu. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette, transférez tout le mélange CD N-A-P-C-I dans le tube de gel à verrouillage de phase. Ne vortex pas la centrifugeuse à tube de gel à verrouillage de phase à pleine vitesse pendant deux minutes.

Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette, vous transférerez la couche supérieure du tube de gel à verrouillage de phase vers un tube de 1,7 millilitre nouvellement étiqueté. Essayez de collecter autant de couche que possible. Ajoutez ce qui suit au micro-tube de centrifugation de 1,7 millilitre, 405 microlitres d’éthanol à 100 %, 80 microlitres d’acétate d’ammonium et un microlitre de vortex de peinture à granulés.

Placez brièvement le tube dans la centrifugeuse avec la charnière du tube vers l’extérieur et centrifugez à pleine vitesse pendant 20 minutes. À température ambiante, une fois la centrifugation terminée, retirez délicatement le tube de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas déranger la pastille CD NA. Le granulé doit être rose à cause de la peinture à granulés et avoir environ la taille d’un grain de sel.

Et sur le côté du tube sous la charnière, placez la pastille CD NA sur de la glace et procédez immédiatement au nettoyage de la pastille. Pour commencer la procédure de nettoyage de la pastille CD NA, utilisez une micro-pipette P 1000 pour retirer soigneusement tout le surnageant du tube. Attention à ne pas déranger le granulé.

C’est votre échantillon à 500 microlitres de froid, 80 % d’éthanol dans le tube. Fermez doucement le tube et retournez-le lentement plusieurs fois. Surveillez de très près votre granule pour vous assurer qu’elle ne se détache pas du côté du tube.

Si le granulé se détache, vous pouvez le ramener au fond du tube en replaçant le tube dans le support et en laissant le granulé se déposer au fond ou en centrifugeant le tube à pleine vitesse pendant 15 secondes. Ensuite, utilisez une micro-pipette P 1000 pour retirer soigneusement l’éthanol sans déranger la pastille. Inclinez le tube pour permettre l’évacuation d’autant de liquide que possible.

Ajoutez un nouvel Eloqua de froid, 80 % d’éthanol, bouchez le tube et retournez-le lentement plusieurs fois. Après avoir retiré tout l’éthanol possible à l’aide d’une micro pipette P 1000. Centrifugez le tube à pleine vitesse pendant cinq secondes.

Utilisez ensuite une micro pipette P 10 pour prélever les derniers microlitres d’éthanol sans déranger la pastille. Placez le tube ouvert dans une boîte de séchage pendant 10 à 20 minutes pour évaporer l’éthanol restant. Le granulé se perd facilement une fois sec, alors veillez à manipuler le tube en douceur et à fermer le bouchon.

Une fois le séchage terminé, visualisez la pastille séchée pour confirmer qu’elle est présente dans le tube. Enfin, remettez en suspension la pastille séchée dans 22 microlitres d’eau sans ARN et placez le tube sur de la glace. Cet ADNC est ensuite utilisé pour préparer des ARNc marqués à la biotine par transcription in vitro à l’aide du kit Enzo BioArray.

Une fois que l’ARNC marqué à la biotine a été nettoyé et quantifié, il est fragmenté pour la préparation de la cible. Une fois que l’ARNC a été généré, nous utilisons la méthodologie standard de transcription in vitro afin de générer de l’ARNC biotinylé. L’ARNC doit subir une fragmentation avant de pouvoir être appliqué à la puce à microrayons.

Pour commencer cette procédure, transférez une quantité équivalente à cinq microgrammes de CRNA dans un tube PCR étiqueté de 0,5 millilitre. Ajoutez suffisamment d’eau libre d’ARN pour porter le volume total à 16 microlitres, puis ajoutez quatre microlitres de cinq tampons de fragmentation dans le tube. Le volume total dans le tube doit être de 20 microlitres.

Faites tourbillonner le tube et centrifugez pendant 10 secondes. Ensuite, incubez le tube à 94 degrés Celsius pendant 30 minutes. Dans un thermocycleur, placez le tube sur de la glace après l’incubation.

L’ARNc fragmenté et non fragmenté de chaque échantillon est ensuite évalué par électrophorèse à l’aide d’un gel AROS préfabriqué à 1,2 %. Lorsque la course est terminée, le gel est visualisé sur un transluminateur et une image est acquise. Le produit de synthèse final est hybridé aux puces génétiques de la levure attrique et les résultats représentatifs de l’analyse des microréseaux sont présentés ici.

Cette première figure est un exemple d’image numérisée d’une puce génétique de levure atrics générée par le logiciel d’exploitation de la puce génétique atrics. Il s’agit d’un nuage de points 2D de tous les transcrits génétiques, soit environ 6 700 gènes, comparant les données de contrôle et les données de levure traitée. Chaque point représente un seul gène.

Les gènes colorés en violet indiquent des gènes qui sont exprimés de manière différentielle alors que les gènes colorés en rouge ne le sont pas. Dans cet exemple, la plupart des gènes exprimés de manière différentielle sont ceux impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, comme l’indiquent leurs descriptions. Cet organigramme de la base de données pour la visualisation des annotations et la découverte intégrée illustre les gènes exprimés de manière différentielle dans une voie biologique affectée.

Les gènes indiqués par une étoile rouge indiquent les gènes régulés à la baisse dans la voie miotique. Enfin, les résultats représentatifs d’un graphique volcanique généré à l’aide du logiciel de sifpeur de gènes geo species sont présentés ici. Les échantillons témoins et traités ont été comparés à une valeur seuil de 0,05 et à une valeur limite de changement d’expression de 1,5

Nous avons choisi d’utiliser de la levure parce qu’elle est facile à cultiver rapidement, mais nous avons également réalisé que la partie la plus critique du travail avec la levure est en fait de créer un placage de sphero décent. L’une des choses que nous ne voulons pas faire dans les microréseaux est de faire une digestion incomplète et de ne faire que des cellules sphero plast qui sont dans une phase G un ou G deux M. Ensuite, vous faites une expérience sur des levures qui sont dans une certaine phase de réplication.

Un autre point compliqué que nous essayons de faire comprendre dans cet exercice est que le fait de granuler CD NA dont les gens parlent tous les jours, mais ce n’est pas nécessairement facile. Et ce que nous avons fait dans notre module, c’est que nous avons utilisé des tubes spécialisés et des réactifs de visualisation. Nous pouvons donc en fait faire tourner l’ADN et vous pouvez visualiser l’appel, ce qui facilite la tâche des élèves et des enseignants.

Ainsi, il peut être utilisé dans toutes les phases du travail sur l’ADN et l’ARN après son développement. Ce module a vraiment ouvert la voie aux professeurs des instituts de baccalauréat pour explorer, en examinant peut-être d’autres organismes modèles ou d’autres régimes de traitement qui pourraient être compatibles avec les programmes existants ou peut-être leurs propres intérêts de recherche. Et pour vous donner un exemple de certaines des modifications qui ont été apportées, il y avait un site qui avait examiné les effets du traitement herbicide sur la levure ou un autre qui s’était penché sur le traitement LAMP IDE chez la levure, tandis qu’un autre site s’était penché sur les changements de développement dans une lignée cellulaire de mammifère qui les intéressait particulièrement.

Enfin, un autre site s’était penché sur l’impact des sources lumineuses différentielles sur les arabidopsis ou les plantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place une expérience de microrayons avec des étudiants en sciences de premier cycle, y compris l’isolement de l’ARN total de la levure, la génération d’ADNC et la fragmentation de l’ARNC marqué à la biotine. Des expériences pratiques avec des technologies de haut niveau contribuent à renforcer l’enseignement des sciences de premier cycle.