Comptage des cellules souches humaines
22 août 2007
La connaissance du nombre exact de cellules viables est nécessaire pour de nombreuses manipulations culture de tissus. Ce protocole décrit comment différencier entre les cellules vivantes et mortes et de quantifier les cellules en utilisant un hématimètre. Bien qu'il décrit compter humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs), il peut être utilisé pour d'autres types cellulaires.
Maintenant, je vais vous montrer comment compter les cellules précurseurs neurologiques humaines et vous compteriez vos cellules lorsque vous voulez les mettre pour l’immunochimie ou lorsque vous voulez faire une transfection avec une machine à facteur nucléaire. J’utilise un hémocytomètre à contraste de phase qui a une grille de bord et nous utilisons également un colorant appelé trip and blue. Et le colorant est utile en ce sens qu’il peut différencier les cellules vivantes des cellules mortes.
Les cellules mortes ou mourantes absorbent ce colorant et apparaissent bleues. Lorsque vous regardez les cellules de l’hémomètre, le cytomètre et les cellules vivantes sont capables d’exclure ce colorant et ils, ils, ils n’apparaissent pas bleus. Ainsi, vous pouvez déterminer la viabilité de vos cellules pour préparer une solution de voyage et de bleu et de milieu.
Je vais ajouter 20 microlitres de piège et de solution bleue dans ce tube épi de 0,5 mil. Et puis je vais ajouter 25 microlitres de support. Donc, de cette façon, en ce moment, j’ai 45 microlitres d’un bac de piège bleu et d’une solution de média, de sorte que lorsque j’ajoute cinq microlitres de suspension cellulaire, je vais avoir une dilution de un à 10
.Et donc maintenant je vais, je vais ajouter cinq microlitres de suspension cellulaire. Tout d’abord, je vais m’assurer que les cellules sont bien remises en suspension par vortex de doigts. Alors maintenant, je veux m’assurer que cette solution est bien mélangée.
Je vais donc monter et descendre le lit plusieurs fois. Et enfin, je vais charger environ 12 microlitres de cette suspension cellulaire dans un hémocytomètre. Il a, il a deux ports et vous pouvez, vous pouvez utiliser l’un ou l’autre.
Il suffit donc d’introduire la solution au niveau de cet orifice et le liquide va être aspiré par une capillarité. Et maintenant, je suis prêt à compter. Voici un aperçu de l’hémocytomètre à 10 x et nous avons ici un quadrant qui contient 16 carrés.
Et comme vous pouvez le voir, on peut observer ici des cellules vivantes et mortes. Ici, nous avons des cellules vivantes comme celle-ci et celle-ci et cela. Et nous avons aussi des cellules mortes comme celle-ci.
Si vous remarquez, la cellule morte apparaît en bleu foncé, tandis que les cellules vivantes sont entourées d’une sorte de grêle. Alors maintenant, je vais compter toutes les cellules vivantes. Je vais donc aller de gauche à droite et de haut en bas.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Nous avons donc trois six cellules au total dans ce quadrant. Ainsi, lorsque je vois des cellules qui se trouvent à la limite du quadrant, comme le long de cette ligne ici, pour être cohérent, je compte les cellules qui se trouvent sur la bordure gauche et sur la bordure supérieure.
Et je compte systématiquement les cellules sur ces bords pour tous les quadrants sur l’hémocytomètre. Nous allons maintenant calculer le nombre de cellules que nous avons par microlitre. Et pour ce faire, je vais prendre la moyenne des cellules par quadrant, qui est de 38, et la multiplier par 10, ce qui est un facteur déterminé par les dimensions de la chambre.
Et nous allons également multiplier par 10, qui est notre facteur de dilution dans ce cas. Et à la fin, nous allons obtenir le nombre de cellules par microlitre. Dans ce cas, nous avons donc 3 800 cellules par microlitre.
Et comme nous avons suspendu notre palette de cellules dans 500 microlitres de solution, vous pouvez calculer le nombre total de cellules dont vous disposez. Et nous sommes prêts.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour compter les cellules souches/precursrices neuronales humaines (hNSPCs) à l’aide d’un hémacytomètre. Il souligne l’importance de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes dans diverses applications de culture tissulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Culture de tissus
Contexte
- Le décompte des cellules viables est essentiel pour les manipulations de culture tissulaire.
- Les cellules vivantes peuvent exclure certains colorants, contrairement aux cellules mortes.
- Le compteur de cellules (hémacytomètre) est un outil standard pour le décompte cellulaire.
- Le colorant bleu de trypan est couramment utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour compter les cellules souches neurales humaines (hNSPCs).
- Distinguer efficacement les cellules vivantes des cellules mortes.
- Aider les chercheurs à se préparer pour des expériences ultérieures telles que l'immunochimie ou la transfection.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un hémacytomètre en contraste de phase.
- Application du colorant bleu de Trippan pour distinguer la viabilité cellulaire.
- Comptage des cellules au microscope.
- Préparation d'une solution de bleu de Trippan et de milieu de culture.
Résultats principaux
- Différenciation réussie entre cellules vivantes et mortes.
- Quantification précise des CSPN humaines.
- Démonstration de l'efficacité du colorant bleu de Trippan.
- Validation de l'hémacytomètre comme méthode de comptage fiable.
Conclusions
- Le protocole offre une approche simple du comptage cellulaire.
- Il s'applique à divers types cellulaires autres que les hNSPC.
- La compréhension de la viabilité cellulaire est essentielle pour la réussite des expériences de culture tissulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La quantification précise de cellules souches/précurseurs neuronales humaines viables (hNSPCs) est essentielle pour des protocoles de culture tissulaire reproductibles dans le domaine de la découverte de médicaments en neurosciences. Ce protocole permet une évaluation fiable de la viabilité cellulaire et une mesure précise de la concentration, facilitant un semis expérimental reproductible pour des applications ultérieures telles que l'immunocytochimie et la transfection. En standardisant la discrimination entre cellules vivantes et mortes à l’aide du bleu de Trypan et du comptage sur hémacytomètre, cette méthode améliore la fiabilité prédictive des validations précoces de cibles et du développement d’essais.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet un ensemencement précis des hNSPC pour des études sur l'engagement ciblé et la modulation des voies.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité des tests cellulaires en assurant une quantité constante de cellules viables en entrée.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des données quantitatives et reproductibles sur la concentration cellulaire, essentielles pour la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet la préparation à grande échelle de suspensions cellulaires destinées à des formats de criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Maintient une cohérence des entrées cellulaires au cours des étapes de transition de la découverte à la préclinique.
- Valeur opérationnelle : Facilite la collaboration pluridisciplinaire grâce à des pratiques standardisées de comptage cellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant une préparation cellulaire fiable depuis la validation de la cible jusqu'à l'optimisation des tests et les essais précliniques d'efficacité.
- Biologie de la découverte : Assure une administration précise des cellules pour les expériences de validation ciblée impliquant des hNSPC.
- Écrantage : Fournit des quantités cellulaires standardisées et quantifiables nécessaires à la reproductibilité des tests.
- Analytique : Produit des résultats sur la concentration de cellules viables et le nombre total de cellules, utilisés pour normaliser les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité dans la manipulation des cellules entre les modèles de découverte in vitro et les modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité transférable et peu complexe, applicable à plusieurs types cellulaires et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive en minimisant la variabilité des paramètres expérimentaux cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires et équipes.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus pertinentes d'aller/arrêt grâce à des bases d'essai fiables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque en assurant la qualité des données lors du criblage précoce de l'efficacité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en technique de culture tissulaire et en microscopie.
- Dépend de la disponibilité d'un hématimètre et d'un nettoyage adéquat afin d'éviter toute contamination.
- Exige une formation cohérente de l'opérateur pour assurer une sélection impartiale des cadrans et l'application rigoureuse des règles de comptage aux frontières.
- Limité par le débit du comptage manuel ; non adapté à l'automatisation à haut débit sans adaptation.
- Fonctionne selon une dilution et un mélange corrects afin de garantir un échantillonnage représentatif de la suspension cellulaire.
