Comptage des cellules souches humaines

Maintenant, je vais vous montrer comment compter les cellules précurseurs neurologiques humaines et vous compteriez vos cellules lorsque vous voulez les mettre pour l’immunochimie ou lorsque vous voulez faire une transfection avec une machine à facteur nucléaire. J’utilise un hémocytomètre à contraste de phase qui a une grille de bord et nous utilisons également un colorant appelé trip and blue. Et le colorant est utile en ce sens qu’il peut différencier les cellules vivantes des cellules mortes.

Les cellules mortes ou mourantes absorbent ce colorant et apparaissent bleues. Lorsque vous regardez les cellules de l’hémomètre, le cytomètre et les cellules vivantes sont capables d’exclure ce colorant et ils, ils, ils n’apparaissent pas bleus. Ainsi, vous pouvez déterminer la viabilité de vos cellules pour préparer une solution de voyage et de bleu et de milieu.

Je vais ajouter 20 microlitres de piège et de solution bleue dans ce tube épi de 0,5 mil. Et puis je vais ajouter 25 microlitres de support. Donc, de cette façon, en ce moment, j’ai 45 microlitres d’un bac de piège bleu et d’une solution de média, de sorte que lorsque j’ajoute cinq microlitres de suspension cellulaire, je vais avoir une dilution de un à 10

Et donc maintenant je vais, je vais ajouter cinq microlitres de suspension cellulaire. Tout d’abord, je vais m’assurer que les cellules sont bien remises en suspension par vortex de doigts. Alors maintenant, je veux m’assurer que cette solution est bien mélangée.

Je vais donc monter et descendre le lit plusieurs fois. Et enfin, je vais charger environ 12 microlitres de cette suspension cellulaire dans un hémocytomètre. Il a, il a deux ports et vous pouvez, vous pouvez utiliser l’un ou l’autre.

Il suffit donc d’introduire la solution au niveau de cet orifice et le liquide va être aspiré par une capillarité. Et maintenant, je suis prêt à compter. Voici un aperçu de l’hémocytomètre à 10 x et nous avons ici un quadrant qui contient 16 carrés.

Et comme vous pouvez le voir, on peut observer ici des cellules vivantes et mortes. Ici, nous avons des cellules vivantes comme celle-ci et celle-ci et cela. Et nous avons aussi des cellules mortes comme celle-ci.

Si vous remarquez, la cellule morte apparaît en bleu foncé, tandis que les cellules vivantes sont entourées d’une sorte de grêle. Alors maintenant, je vais compter toutes les cellules vivantes. Je vais donc aller de gauche à droite et de haut en bas.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Nous avons donc trois six cellules au total dans ce quadrant. Ainsi, lorsque je vois des cellules qui se trouvent à la limite du quadrant, comme le long de cette ligne ici, pour être cohérent, je compte les cellules qui se trouvent sur la bordure gauche et sur la bordure supérieure.

Et je compte systématiquement les cellules sur ces bords pour tous les quadrants sur l’hémocytomètre. Nous allons maintenant calculer le nombre de cellules que nous avons par microlitre. Et pour ce faire, je vais prendre la moyenne des cellules par quadrant, qui est de 38, et la multiplier par 10, ce qui est un facteur déterminé par les dimensions de la chambre.

Et nous allons également multiplier par 10, qui est notre facteur de dilution dans ce cas. Et à la fin, nous allons obtenir le nombre de cellules par microlitre. Dans ce cas, nous avons donc 3 800 cellules par microlitre.

Et comme nous avons suspendu notre palette de cellules dans 500 microlitres de solution, vous pouvez calculer le nombre total de cellules dont vous disposez. Et nous sommes prêts.