Le repiquage des cellules souches humaines

Bonjour, je suis Steve. Je travaille dans le laboratoire du Dr Flanagan, au département de pathologie de l'université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment diviser des cellules souches neuronales humaines.

Cette technique consiste à revêtir un nouveau flacon avec une solution de fibronectine humaine, à détacher les cellules à l’aide d’un tampon de dissociation cellulaire, puis à neutraliser le tampon de dissociation cellulaire avec une solution contenant 10 % de sérum, à centrifuger la suspension cellulaire et à resuspendre les cellules dans un milieu frais, avant de transférer la suspension cellulaire dans un nouveau flacon. Dans notre laboratoire, nous cultivons des cellules souches neurales humaines en renouvelant la moitié du milieu tous les deux jours, et nous les repiquons environ une fois par semaine en les divisant par un à deux. Lorsque je repique les cellules, je peux les compter si je prévois de les utiliser pour une expérience d’immunochimie, ou si je souhaite effectuer une transfection avec un effecteur nucléaire.

Il est important d'utiliser un tampon de dissociation cellulaire lors de l'encapsidation des cellules, car tout d'abord, il est non enzymatique, contrairement à la trypsine, et il est beaucoup plus doux pour les cellules. Bonjour, nous sommes actuellement en salle de culture tissulaire. Avant de vous montrer à quoi ressemble un flacon confluant de cellules précurseurs humaines, je vais d'abord préparer la culture tissulaire. Tout d'abord, je vais éteindre la lampe à rayons ultraviolets et allumer la lumière ainsi que le flux d'air.

Ensuite, je vais désinfecter le flux laminaire avec de l'éthanol à 70 % en vaporisant une serviette en papier et en essuyant le flux laminaire. Il est important de vaporiser la serviette en papier avec de l'éthanol à 70 % et non l'intérieur du flux laminaire directement, car la pulvérisation d'éthanol à 70 % à l'intérieur du flux laminaire pourrait endommager le filtre HEPA, qui est très coûteux. Ensuite, je vais pulvériser tous les réactifs et instruments.

Et enfin, je vais pulvériser les tuyaux du vide, et nous serons prêts. Examinons ces cellules. Ces cellules présentent une confluence d’environ 80 %.

Il s'agit de cellules souches neurales humaines isolées à partir de fœtus humains, que nous cultivons dans des flacons T 25. Nous les repiquons environ toutes les semaines, au ratio d'une à deux. Je suis prêt à repiquer mes cellules maintenant.

Et tout d'abord, je vais prendre un nouveau flacon T 25 que j'ai enrobé pendant quatre heures avec de la fibronectine humaine provenant de BD biosciences. J'ai donc retiré la solution de fibronectine. Je vais rincer ce flacon avec du BBS avant de transférer les cellules dans le flacon.

Et maintenant, je vais sortir les cellules de l’incubateur à 37 degrés. Les voilà. Maintenant, je vais retirer la solution de lavage au PBS du nouveau flacon qui a été enrobé de fibronectine humaine.

Et je vais ajouter deux millilitres de milieu conditionné ancien dans le nouveau flacon. Maintenant, je dois rincer mes cellules avec du PBS avant de pouvoir les détacher de la surface. Tout d'abord, je vais éliminer le milieu restant, puis ajouter environ deux millilitres de PBS immédiatement, sans laisser les cellules sécher.

Je vais attendre environ deux minutes avant de retirer le PBS et d'ajouter le tampon de dissociation pour détacher les cellules de la surface du flacon. Maintenant, je vais retirer le PBS, et encore une fois, j'ajouterai immédiatement le tampon de dissociation cellulaire afin que les cellules ne s'assèchent pas. J'ajoute donc 1,5 mL de tampon de dissociation cellulaire.

Et contrairement au PBS, je vais l'ajouter directement sur les cellules et je vais essayer de couvrir la plus grande surface possible. Je déplace donc le flacon de côté à côté tandis que j'ajoute lentement ce tampon sur les cellules. J'attends maintenant environ cinq minutes pour que les cellules commencent à se détacher de la surface.

Et je vais laisser le flacon à température ambiante dans la hotte. Comme vous pouvez le voir ici, les cellules commencent d'abord à s'arrondir, puis elles se détachent de la surface, et vous pouvez effectivement en voir certaines, quelques cellules déjà en suspension. Et si vous tapez légèrement sur le côté du flacon, cela va les aider à se détacher.

Donc, cela fait cinq minutes, et comme vous pouvez le constater, la solution est devenue très dense en cellules qui se sont détachées de la surface. Je vais maintenant neutraliser l'effet du tampon de dissociation cellulaire en ajoutant 4,5 mils de milieu contenant du sérum. J'utiliserai du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur à 10 % dans un milieu D-M-E-M-F 12, que j'ajouterai directement sur la surface du flacon afin de s'assurer qu'aucune cellule ne reste attachée.

Et je vais, et je vais pipeter doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour détacher toutes les cellules restantes. Ensuite, je vais transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Et je vais l'effectuer une centrifugation à 1 000 tr/min pendant une minute.

Ainsi, les cellules ont terminé la centrifugation et nous avons ici un beau culot cellulaire. Je vais retirer le milieu contenant du sérum très, très prudemment, sans chercher à perturber le culot. Ensuite, je vais resuspendre le culot dans quatre millilitres de ce milieu.

Je vais donc essayer de resuspendre le culot afin qu’il ne reste aucun agrégat cellulaire, de sorte que la solution devienne homogène et ne contienne aucun grumeau. Étant donné que je réalise un partage 1:2, je vais prélever deux des quatre millilitres et les transférer dans le nouveau flacon qui contient déjà deux mL de milieu conditionné. Enfin, je vais étiqueter le flacon avec le type cellulaire, le numéro de passage et la date.

Voici un aperçu des cellules que nous avons repiquées il y a une demi-heure. Comme vous pouvez le constater, elles se sont en majorité fixées à la surface et ont commencé à émettre des prolongements. C'est tout pour aujourd'hui.

Et maintenant, je suis prêt à compter.