Le repiquage des cellules souches humaines

Bonjour, je m’appelle Steve. Je travaille dans le laboratoire du Dr Flanagan au département de pathologie de l’UC, Irvine. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment diviser les cellules précurseurs neurales humaines.

Cette technique consiste à coder un nouveau flacon avec une solution de fibronectine humaine, à soulever les cellules avec un tampon de dissociation cellulaire, puis à neutraliser le tampon de dissociation cellulaire avec une solution sérique à 10 %, à centrifusionner la suspension cellulaire et à suspendre les cellules dans un milieu frais et à transférer la suspension cellulaire dans un nouveau flacon. Dans notre laboratoire, nous cultivons des cellules précurseurs neuronales humaines en changeant la moitié de leurs milieux tous les deux jours, et nous les faisons passer environ une fois par semaine en divisant un à deux. Lorsque je passe des cellules, je peux les compter si je veux les échanger contre une expérience d’immunochimie, ou si je veux faire une transfection avec un effecteur nucléaire.

Il est important d’utiliser un tampon de dissociation cellulaire lors de l’emballage des cellules, car il n’est d’abord pas enzymatique, contrairement à la trypsine, et il est beaucoup plus doux pour les cellules. Bonjour, nous sommes dans la salle de culture tissulaire maintenant, et avant de vous montrer à quoi ressemble un flacon confluent de cellules précurseurs humaines, je vais d’abord préparer la culture tissulaire. Tout d’abord, je vais éteindre la lumière UV et allumer la lumière et le flux d’air.

Ensuite, je vais désinfecter la hotte avec de l’éthanol à 70 % en vaporisant une serviette en papier et en essuyant la cagoule. Il est important de vaporiser une serviette en papier avec de l’éthanol à 70 % et non directement l’intérieur de la hotte, car pulvériser la cagoule avec de l’éthanol à 70 % pourrait endommager le filtre HEPA, ce qui est très cher. Ensuite, je vais vaporiser tous les réactifs et instruments.

Et enfin, je vais vaporiser les tuyaux d’aspirateur, et nous sommes prêts. Jetons un coup d’œil à ces cellules. Ces cellules ont donc l’air confluentes à environ 80 %.

Il s’agit de cellules précurseurs neurales humaines isolées de fœtus humains, et nous les cultivons dans des flacons T 25. Nous les séparons environ toutes les semaines, un à deux. Je suis prêt à passer mes cellules maintenant.

Et d’abord, je vais apporter une nouvelle fiole T 25 que j’ai enduite pendant quatre heures de fibronectine humaine de BD biosciences. J’ai donc retiré la solution de fibronectine. Je vais rincer ce ballon avec BBS avant de déplacer les cellules dans le ballon.

Et maintenant, je vais sortir les cellules de l’incubateur à 37 degrés. Les voilà. Maintenant, je vais retirer la solution de lavage PBS de la nouvelle fiole qui était recouverte de fibronectine humaine.

Et je vais ajouter deux millilitres de vieux milieux conditionnés dans le nouveau flacon. Alors maintenant, je dois rincer mes cellules avec du PBS avant de pouvoir le retirer de la surface. Donc, d’abord, je vais retirer le milieu restant, ajouter environ deux mils de PBS tout de suite sans mouiller les cellules se dessécher.

Je vais attendre environ deux minutes avant de supprimer le PBS et de mettre en vente un tampon de dissociation afin de retirer les ventes de la surface de la flak. Maintenant, je vais supprimer le PBS, et encore une fois, je vais essayer d’ajouter immédiatement un tampon de dissociation cellulaire afin que les cellules ne se dessèchent pas. Je vais donc ajouter 1,5 mils de tampon de dissociation cellulaire.

Et contrairement au PBS, je vais l’ajouter directement sur les cellules et je vais essayer de couvrir autant de surface que possible. Je déplace donc le ballon d’un côté à l’autre pendant que j’ajoute lentement ce tampon sur les cellules. Et je vais attendre environ cinq minutes pour que les cellules commencent à se détacher de la surface.

Et je vais laisser le flacon à température ambiante dans la hotte. Comme vous pouvez le voir ici, les cellules commencent d’abord à s’arrondir, puis elles commencent à se détacher de la surface et vous pouvez en fait voir certaines, certaines cellules flottent déjà. Et si vous tapotez largement la fiole sur le côté, cela les aidera à se détacher.

Cela fait donc cinq minutes, et comme vous pouvez le voir, la solution est devenue vraiment dense avec des cellules qui se sont détachées de la surface. Et maintenant, je vais neutraliser l’effet du tampon de dissociation cellulaire en ajoutant 4,5 mils de milieu contenant du sérum. Je vais donc utiliser du sérum de veau fœtal inactivé à 10 % de chaleur dans un milieu D-M-E-M-F 12, et je vais l’ajouter directement sur la surface du ballon pour m’assurer qu’il ne reste pas de cellules attachées.

Et je vais le faire, et je vais doucement pipeter de haut en bas pour déloger toutes les cellules restantes. Ensuite, je vais transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 mil. Et je vais le faire tourner à mille tr/min pendant une minute.

Donc, les cellules ont fini de tourner et nous avons ici une belle palette de cellules. Je vais retirer le sérum médium très, très soigneusement sans essayer de déranger la palette. Et puis je vais remettre la palette en suspension dans quatre mils de, du support.

Je vais donc essayer de remettre en suspension la pastille pour qu’il n’y ait, qu’il n’y ait, qu’il n’y ait plus d’amas de cellules pour que la solution devienne homogène et contient, ne contienne pas d’amas d’amas Et puisque je fais une division un à deux, je vais prendre deux des quatre moulins et les transférer dans le nouveau flacon qui contient déjà deux mil de milieu de conditionnement. Et enfin, je vais étiqueter le flacon avec le type de cellule, le numéro de passage et la date.

Voici un aperçu des cellules que nous avons traversées il y a une demi-heure. Et comme vous pouvez le voir, la plupart d’entre eux se sont attachés à la surface et ont commencé à envoyer des processus. C’est tout les amis.

Et maintenant, je suis prêt à compter.