Name: Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Apprenez à analyser les petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées par microinjection de plasmides. Cette méthode permet d'étudier les effets primaires des protéines avec une visualisation par microscopie confocale.

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Ce travail a été financé par une subvention des National Institutes of Health (GM070736) à H. Fölsch. SF Ang a été soutenue par un prix A * STAR bourses d&#39;études supérieures, et RS Kang a été soutenue par la base cellulaire et moléculaire du programme de formation des maladies (GM8061)

1. L'isolement de l'ADN plasmidique <ol><li> Utilisez une endotoxine de Sigma-Aldrich kit maxiprep pour préparer l'ADN endotoxines libres selon le protocole du fabricant. Ce kit fonctionne pour nous, car elle élimine de manière fiable toute endotoxines des préparations d'ADN. Endotoxines qui sont injectés avec de l'ADN dans les noyaux des cellules entraîne la mort cellulaire. </li><li> Ajouter 100 ul de phénol / chlorofom / alcool isoamylique (25:24:1) à l'ADN isolé, vortex et spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube et ajouter 100 ul de chloroforme / alcool isoamylique (24:1), vortex et spin comme ci-dessus. Transférer la phase aqueuse supérieure contenant l'ADN à un nouveau tube. Cette étape est nécessaire pour éliminer toute protéine de l'ADN, ce qui empêche le colmatage de l'aiguille de microinjection. </li><li> Précipiter l'ADN par addition d'acétate de Na (pH 6,0) à une concentration finale de 300 mm et 2 X vol d'éthanol 100%. Incuber à -20 ° C la nuit. Spin ADN pendant 20 min à 13000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf, se laver une fois avec 70% d'éthanol, et remettre en suspension dans 300 ul sans endotoxine de l'eau (Sigma-Aldrich). </li><li> Déterminer la concentration d'ADN. Une concentration de l'ADN typique varie de 1 à 5 ug / ul. </li></ol> 2. Culture de cellules MDCK <ol><li> Fractionner les cellules MDCK. Compter les cellules et les graines de 4 X 10 5 cellules sur des filtres clairs Transwell de 12 mm (0,4 um taille des pores, Corning Costar, 3460). Pour une expérience de contrôle contenant une injection maquette et deux différentes protéines Rab mutant dont vous avez besoin pour ensemencer trois filtres. </li><li> Cellules MDCK culture dans un milieu MEM avec 2 mM de L-glutamine, 0,1 mg / ml de pénicilline / streptomycine et 7% (vol / vol) de sérum bovin foetal (= milieux de croissance MEM) à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Changement des médias dans la chambre basolatérale chaque jour. Ceci facilite le processus de polarisation, parce qu'elle imite la situation des cellules épithéliales chez l'animal. </li><li> 2 jours après l'ensemencement vérifier dans un microscope si les cellules se multiplient en monocouche fermée. Si vous ne pouvez pas détecter tous les trous dans la monocouche, effectuez votre expérience au jour 3. S'il ya encore des trous, effectuer votre expérience sur 4 jours. </li></ol> 3. Procédure microinjection et post-injection incubations <ol><li> Le jour de l'expérience de préparer 5 ml de milieu MEM de croissance et 50 mM d'HEPES dans un plateau 60 x 15 mm pour chaque filtre et le placer dans un incubateur à 39 ° C. En outre, mis en place un puits d'une plaque 12 puits avec les médias 1 ml de croissance MEM et 50 mM d'HEPES et 0,1 mg / ml de cycloheximide par filtre, et le placer dans un incubateur 31 ° C. </li><li> Allumez votre microscope microinjection et mis son stade chauffé à 39 ° C. Nous utilisons un microscope inversé (Axiovert 200, Carl Zeiss, Inc) avec une scène chauffée, 10X et 32X objectifs, et une FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Enfin, ouvrez le réservoir d'azote qui alimente la table de l'air à l'azote. </li><li> Diluer l'ADN avec de l'eau filtrée (utiliser filtre de 0,2 um) à une concentration finale de 0,2 mg / ml dans un volume total de 10 - 100 pi. Par la suite, le spin de l'ADN dans microcentrifugeuse Eppendorf à 13000 rpm pendant 30 min. Retirer la partie supérieure et le placer dans un nouveau tube. Cette étape assure que lorsque vous chargez votre ADN dilué dans l'aiguille de microinjection vous pouvez exactement la charge "propre" ADN. Votre ADN est maintenant prêt pour la microinjection. </li><li> Préparez vos cellules en prenant la sortie de son premier filtre boîte de culture. Avec une lame chirurgicale (Lame Plume chirurgical, acier inoxydable, n ° 11), découper le filtre du porte-filtre et le placer dans 5 ml, 39 ° C au chaud milieux de croissance MEM et 50 mM HEPES (60 x 15 mm Plaque). Courbez le filtre dans la plaque de culture avec la lame chirurgicale que vous avez utilisé pour le découper. Placez-le sur le filtre tel que le trou de la lame chirurgicale entoure le milieu du filtre. Placez votre plaque de culture sur la scène chauffée du microscope. </li><li> Charge 2-3 ul de votre ADN dilué (dans le cas des plasmides cet encodage VSVGts045-GFP = contrôle d'injection maquette) dans une aiguille de microinjection (Femtotip II, Eppendorf, 930 000 043), tournez le couvercle de protection de l'aiguille et le laisser tomber sur le plancher . Maintenant que l'aiguille est prête à être vissée dans son support. Pour ce faire, appuyez sur la touche menu de votre InjectMan et s'assurer que le robinet est fermé. Vissez l'aiguille dans son support, méfiez-vous de ne pas visser l'aiguille trop serré car cela pourrait conduire à la rupture. Maintenant, appuyez sur la touche menu, l'application P c sera empêcher les médias d'être aspirée dans l'aiguille lors de la procédure microinjeciton. Enfin, appuyez sur le joystick pour effacer homing stockées. </li><li> Pour abaisser l'aiguille sur les cellules, utilisez l'objectif 10X et amener l'aiguille dans le faisceau de lumière au-dessus du liquide. Maintenant se concentrer sur les cellules, mettre l'accent à nouveau en tournant la molette de mise en place de 180 °, et de trouver l'aiguille. Par la suite, se déplacer lentement l'aiguille dans le foyer, puis sortir de concentrer à nouveau (travailler à amener les cellules en se concentrer à nouveau), ramener l'aiguille dans desUC à nouveau. Répétez jusqu'à ce que l'aiguille touche la surface du support, à quel point tout ce que vous allez voir est un halo. Lorsque vous atteignez un point où les cellules sont en discussion, mais l'aiguille est encore floue (c'est à dire hors du plan focal) modification de l'objectif 32X et fine des paramètres grossiers. </li><li> Régler la limite de z-en touchant la membrane apicale avec la pointe de l'aiguille et en soustrayant environ 10 um que les noyaux sont la pose d'environ 10 um sous la membrane apicale. </li><li> Après avoir défini le z-limite, trouver la pression d'injection de droite. Départ à 95 PSI. Si la pression est trop élevé, vos cellules vont exploser. Si votre tension est trop basse, vous verrez un point blanc qui reste, mais rien ne se passe. Avec une injection réussie, vous verrez un changement de phase sans changer la taille des cellules. Pour l'injection, amener l'aiguille de quelques microns de la plan focal aussi vite que possible. Visez avec l'aiguille au-dessus du noyau (ie au milieu d'une cellule individuelle) et appuyez sur le bouton d'injection de votre joystick, mais ne pas maintenir le bouton enfoncé. </li><li> Injecter 100 à 500 cellules dans le trou de votre lame chirurgicale qui se trouve sur vos cellules. Lorsque vous avez terminé, placez vos cellules avec la boîte de culture et d'une lame chirurgicale dans un incubateur à 39 ° C, et incuber pendant 2 h. Pendant ce temps, VSVGts045-GFP est exprimée et sécrétée dans le RE. Cependant, à 39 ° C, VSVGts045-GFP ne peut pas se replier correctement et donc ne peuvent pas quitter la salle d'urgence. En attendant, la petite GTPase d'intérêt va s'accumuler dans le cytosol des expériences de co-injection. </li><li> Après 2 h, placez vos cellules dans 1 ml de croissance des médias MEM et 50 mM d'HEPES et 0,1 mg / ml de cycloheximide dans une plaque de 12 puits et incuber pendant 2 h à 31 ° C. Durant cette période, chasse, VSVGts045-GFP se replier correctement, laisser la salle d'urgence et est livré à la surface cellulaire. </li><li> Répétez les étapes 03.01 à 03.10 pour les filtres à deux (injecter des plasmides codant pour la GFP et VSVGts045-par exemple-V5 taggés Rab13T22N) et trois (injecter des plasmides codant VSVGts045-GFP et par exemple V5-taggés Rab13Q67L). Chaque injection durera environ 20 - 60 min. Cependant, il est absolument crucial pour traiter tous les filtres de la même façon tout au long du incubations changement de température et une coloration de surface jusqu'à ce que vous fixer les cellules. Après fixation, vous pouvez effectuer le reste de votre protocole de coloration pour tous les filtres dans le même temps. </li></ol> 4. Coloration de surface pour analyse par immunofluorescence Remarque, afin d'éviter le blanchiment du signal GFP de VSVGts045-GFP, protéger les spécimens de la lumière en couvrant avec du papier d'aluminium pendant toutes les procédures ultérieures. <ol><li> Si vous souhaitez effectuer une coloration de surface, placez vos cellules dans une boîte de culture sur une plaque de métal sur la glace et lave-toi les cellules 1X avec PBS glacé 2 + (PBS [0,2 g / litre de KCl, 0,2 g / litre de KH 2 PO 4, 8 g / litre de NaCl et 2,17 g / litre de Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] et 0,1 g / litre de CaCl 2 et 0,1 g / litre de MgCl 2 x 6 H 2 O). Par la suite, placer 30 pl d'un anticorps qui reconnaît l'ectodomaine de vos protéines, dans ce cas, l'anticorps monoclonal de souris TK1 (IgG 1, obtenu à partir de la fin des années Kreis Thomas), sur du parafilm nettoyage placé sur la plaque de métal sur la glace. Placez le filtre avec vos cellules à l'envers sur la goutte et ajouter quelques gouttes d'anticorps sur la face arrière du filtre. Incuber pendant 1 h sur la glace. </li><li> Cellules de lieu dans une plaque de 12 puits, laver 3x avec PBS glacé 2 + (ou RT chaude PBS 2 + sans coloration de surface avant), et fixer avec du paraformaldéhyde 3% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS 2 + et de laisser en PBS 2 + pendant 5 min. </li><li> Incuber les cellules dans un tampon bloquant perméabilisation / (BPB) (2% [poids / vol] BSA, 0,4% [p / v] saponine dans le PBS 2 +) avec 10% [vol / vol] du sérum de chèvre. Incuber 1 h à température ambiante. </li><li> Diluer anticorps primaires pour détecter la GTPase Rab exprimé, dans cet exemple anti-V5 (monoclonal de souris d'anticorps IgG 2a, Invitrogen), 1:200 dans BPB. Spin anticorps dilué dans une microcentrifugeuse Eppendorf pendant 10 min à 13000 rpm. Placer 30 ul de la solution d'anticorps sur du parafilm propres placés dans une chambre humide. Placez les cellules sur le filtre à l'envers sur la baisse des anticorps et incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Remettre les cellules (côté droit) dans une plaque de 12 puits et laver 5 fois en 30 min avec BPB à la température ambiante. </li><li> Diluer appropriée anticorps secondaire, dans ce cas, de chèvre anti-souris IgG 1 Alexa 594-étiquetées (pour VSVG détection sur la surface, Invitrogen), et Cy5-anticorps secondaires marqués à reconnaître vos GTPase Rab, dans cette chèvre par exemple IgG anti-souris 2a Cy5-étiquetées (Jackson ImmunoResearch), 1:200 dans BPB et de spin comme ci-dessus. Placer 30 ul de solution d'anticorps sur des parafilm propre dans une chambre humide et les cellules de lieu à l'envers du filtre vers le bas sur la baisse des anticorps. Incuber 1 h à température ambiante. </li><li> Répétez l'étape 4.6. </li><li> Tremper les cellules sur le filtre en 3X eau déminéralisée et le lieu rSide Up ight sur microslides. Ajouter 10-15 ul montage (10% [poids / vol] DABCO, 50% [poids / volume] du glycérol dans l'eau distillée) sur le dessus des cellules. Placez 18X18 mm couvercle en verre micro sur le dessus et en utilisant des tissus du visage appuyez doucement sur le couvercle en verre sur le micro-cellules. Sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Analyser les échantillons avec un microscope confocal. Nous avons utilisé un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss, Inc qui a été équipé d'une lentille à immersion d'eau 63X. </li><li> Pour la préparation des figures, ajuster et de combiner des images en utilisant des programmes comme Adobe Photoshop et Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Pour des exemples sur la façon dont la co-expression des petites GTPases interfère avec le tri VSVG veuillez vous reporter aux articles publiés soit pour missorting apicale 3, 4 ou l'inhibition de 7 de livraison de surface. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dans l'injection maquette, c'est à dire une injection de seulement le plasmide codant pour la GFP-VSVGts045, la protéine est livré à la surface basolatérale de bien-polarisée des cellules MDCK en juger par la coloration de surface (en rouge, la figure 1 A). Notez que tous les VSVGts045-GFP est livré à la membrane basolatérale pendant la poursuite à 31 ° C comme en témoigne le signal intracellulaire vaste pour les protéines totales (en vert, les figures 1 A et B). Dans les cellules qui ne sont pas bien polarisée VSVGts045-GFP sera livré aussi à la membrane apicale (figure 1 B). Si vos échantillons de contrôle ressemble à la cellule de la figure 1 B, vous ne pouvez pas faire confiance à vos données et à répéter l'expérience avec une meilleure polarisation des cellules. Barres d'échelle sont de 5 um.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Les étapes les plus critiques pour une expérience réussie de microinjection sont la qualité et la pureté de l&#39;ADN et la polarité de vos cellules. Sans cellules polarisées, votre commande d&#39;injection aura déjà mistargeted VSVG et l&#39;expérience ne peut pas être utilisé. Si l&#39;ADN est de mauvaise qualité, l&#39;ADN peut obstruer l&#39;aiguille d&#39;injection entraînant peu ou pas d&#39;expression de la protéine désirée du tout. Aussi, il est conseillé d&#39;utiliser des plasmides d&#39;expression qui sont co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscope à platine chauffante </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Afin personnalisé </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipulateur </td><td> Eppendorf </td><td> Afin personnalisé </td></tr><tr><td> Femtotips II (aiguilles microinjection) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader astuces </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Clair 12 mm transwell filtre prend en charge </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxines-libres Bluetooth plasmide maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyse de la fonction des petites gtpases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Les cellules épithéliales polarisent leur membrane plasmatique dans biochimiquement et fonctionnellement distinctes domaines apical et basolatéral où le domaine apical face à la «libre» des surfaces et la membrane basolatérale est en contact avec le substrat et les cellules voisines. Les deux domaines membranaires sont séparés par des jonctions serrées, qui forment une barrière de diffusion. Apicale-basolatérale polarisation peut être récapitulé avec succès dans la culture lorsque les cellules épithéliales rénales canines telles que Madin-Darby (MDCK) sont ensemencées à haute densité sur des filtres de polycarbonate et cultivées pendant plusieurs jours 1 2. Création et maintien de la polarité cellulaire est régulée par un ensemble de petites GTPases de la superfamille Ras, comme RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 et Rab13 3 4 5 6 7. Comme tous ces protéines GTPases cycle entre une inactifs PIB lié état et un actif lié au GTP Etat. Des mutations spécifiques dans les régions de fixation du nucléotide interférer avec ce vélo 8. Par exemple, Rab13T22N est définitivement verrouillée dans le PIB-forme et donc surnommé «dominant négatif», alors que Rab13Q67L ne peut plus hydrolyser le GTP et est donc bloqué dans un état ​​«dominante active» 7. Afin d&#39;analyser leur fonction dans les cellules à la fois dominante et dominante négative allèles active de GTPases sont habituellement exprimés à des niveaux élevés d&#39;interférer avec la fonction des protéines endogènes 9. Une manière élégante d&#39;atteindre des niveaux élevés de la surexpression dans un court laps de temps est d&#39;introduire les plasmides codant pour les protéines pertinentes directement dans les noyaux des cellules polarisées cultivées sur filtre prend en charge en utilisant la technique de microinjection. Ceci est souvent combiné avec la co-injection de plasmides qui codent les récepteurs journaliste de la membrane plasmique qui sont spécifiquement triés sur le domaine apical ou basolatéral. Une cargaison fréquemment utilisés pour analyser les cargaisons de tri pour le domaine basolatéral est un allèle thermosensible de la glycoprotéine du virus de stomatite vésiculaire (VSVGts045) 10. Cette protéine ne peut pas se replier correctement à 39 ° C et sera donc retenue dans le réticulum endoplasmique (RE), alors que la protéine de régulation d&#39;intérêt est assemblé dans le cytosol. Le passage à 31 ° C permettra alors de plier VSVGts045 correctement, laisser la salle d&#39;urgence et de voyage à la membrane plasmique 11. Cette chasse est généralement effectuée en présence de cycloheximide pour empêcher la synthèse des protéines supplémentaires menant à l&#39;assainissement de résultats. Ici nous décrivons en détail la procédure de micro-injection des plasmides dans les cellules polarisées et incubations ultérieures, y compris les changements de température qui permettent une analyse complète des protéines de régulation impliqués dans le tri basolatérale.

Cet article détaille les procédures impliquées dans la surexpression et l&#39;analyse des petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.

Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Les cellules épithéliales polarisent leur membrane plasmique en domaines apical et basolatéral, biochimiquement et fonctionnellement distincts, où le domaine apical est orienté vers ...

Cette procédure évalue les effets des petites GTP-ACÉ sur le trafic membranaire polarisé. Dans un premier temps, co-injectez des plasmides d'ADN codant pour la petite GTP-ACÉ et les protéines rapporteuses dans les noyaux cellulaires de cellules polarisées. Ensuite, exprimez l'ADN à des températures permettant d'arrêter les protéines rapporteuses dans le réticulum endoplasmique ou dans le TGN, tandis que la petite GTPA s'accumule dans le cytosol, puis poursuivez le trajet de la protéine rapporteuse jusqu'à la surface cellulaire en présence de cycloheximide afin d'empêcher toute nouvelle synthèse protéique.Enfin, marquer la protéine rapporteur à la surface cellulaire pour une analyse en immunofluorescence. Les résultats obtenus grâce à ce dosage permettent de visualiser le changement de localisation à la surface par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la transfection, est qu'au cours des courtes périodes d'expression surexprimée obtenues par micro-injection, les effets secondaires sont minimes, ce qui nous permet d'étudier les effets primaires des protéines d'intérêt.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la polarité cellulaire, comme la manière dont la petite GTPase régule le trafic membranaire polarisé. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes individuelles nécessaires à une microinjection réussie sont difficiles à expliquer sans support visuel. Isolez l'ADN plasmidique exempt d'endotoxines à l'aide du kit maxi prep exempt d'endotoxines de Sigma Aldrich, conformément au protocole du fabricant. Pour cette expérience, utilisez trois filtres transwell clairs de 12 millimètres et de 0,4 micromètre de taille de pore pour la culture.Les cellules sont ensemencées à raison de quatre fois dix puissance cinq cellules MDCK sur chaque filtre. Après deux jours, examiner la culture au microscope afin de vérifier que les cellules forment une monocouche continue. Pour la microinjection.Le jour de la microinjection, préparez des boîtes de 360 par 15 millimètres contenant cinq litres de milieu de croissance MM supplémenté de 15 millimètres de heis, et placez-les dans une étuve à 39 degrés Celsius. En outre, préparez trois plaques de 12 puits contenant un millilitre de milieu de croissance MEM supplémenté de 50 millimolaire de heis et de 0,1 milligramme par millilitre de cycloheximide, puis placez-les dans une étuve à 31 degrés Celsius. Allumez le microscope de microinjection, configuré avec ce microscope inversé équipé d'une platine chauffante, d'objectifs 10 x et 32 x, et d'un Einor FemtoJet.Régler la platine chauffante à 39 degrés Celsius. Ouvrir également l'alimentation en gaz azote vers la table à air. Diluer maintenant l'ADN avec de l'eau filtrée jusqu'à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre.Ensuite, centrifuger l'ADN dans une microcentrifugeuse einor à 13 000 tr/min pendant 30 minutes. Retirer la partie supérieure et la placer dans un nouveau tube. Préparer ensuite les cellules MDCK en retirant le premier filtre de sa boîte de culture à l’aide de la lame chirurgicale, découper le filtre du support et le placer dans la plaque préparée de 60 par 15 millimètres contenant cinq millilitres de milieu de croissance MEM réchauffé à 39 degrés Celsius, supplémenté de 50 millimolaire de heis.Pour maintenir le filtre en place dans la plaque de culture, placer la lame chirurgicale au centre du filtre, puis transférer la plaque de culture sur le plateau chauffant du microscope. Charger deux à trois microlitres de l'ADN dilué dans une micropipette d'injection. Tourner le couvercle de protection de la micropipette et le laisser tomber au sol.Pour positionner l'aiguille dans le porte-aiguille, appuyez sur la touche menu de l'injecteur et assurez-vous que la vanne est fermée. Vissez l'aiguille dans son support. Attention à ne pas visser l'aiguille trop fermement.Étant donné que cela pourrait entraîner une rupture, appuyez à nouveau sur la touche du menu. Ainsi, la pression de compensation appliquée empêchera le milieu d'être aspiré dans l'aiguille pendant la procédure de microinjection. Enfin, actionnez le joystick pour effacer le positionnement mémorisé et abaisser l'aiguille sur les cellules.Utilisez l'objectif 10 x et amenez l'aiguille dans le faisceau lumineux au-dessus du liquide. Mettez maintenant au point sur les cellules. Remontez à nouveau en tournant la molette de mise au point de 180 degrés vers le haut et repérez l'aiguille.Déplacez lentement l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit nette. Ensuite, retirez-la à nouveau du plan de netteté. Travaillez ensuite à remettre les cellules au point. Ramenez l’aiguille au point de netteté. Répétez jusqu’à ce que l’aiguille touche la surface du milieu, moment où un halo est observé. Continuez jusqu’à ce que les cellules soient au point, mais que l’aiguille reste floue en dehors du plan focal.Passer maintenant à l'objectif 32 x et trouver les réglages grossiers. Définir la limite Z en touchant la membrane apicale avec l'extrémité de l'aiguille et en soustrayant environ 10 micromètres, les noyaux étant situés à environ 10 micromètres sous la membrane apicale.Maintenant, sortez l’aiguille de quelques microns du plan focal aussi rapidement que possible. Visez avec l’aiguille au-dessus du noyau et appuyez brièvement sur le bouton d’injection du joystick. Commencez à 95 PSI pour trouver la pression d’injection appropriée.Si la pression est trop élevée, les cellules éclatent. Si la pression est trop faible, un point blanc persiste, mais rien d'autre ne se produit. Réalisez une injection réussie impliquant un changement de phase sans modification de la taille de la cellule.Injectez de 100 à 500 cellules dans le trou de la lame chirurgicale qui repose sur les cellules. Ensuite, placez les cellules avec la boîte de culture et la lame chirurgicale dans un incubateur à 39 degrés Celsius et incubez pendant deux heures. Enfin, transférez les cellules dans la plaque de 12 puits préparée contenant un millilitre de milieu MEM additionné de 50 millimolaire de cycloheptadécan, 0,1 milligramme par millilitre, et incubez pendant deux heures à 31 degrés Celsius.Afin d'éviter la décoloration du signal GFP exprimé, protégez les échantillons de la lumière en les recouvrant de papier d'aluminium pendant toutes les étapes ultérieures de marquage de surface. Placez les cellules dans une boîte de culture sur une plaque métallique posée sur de la glace et rincez-les. Une fois avec du PBS glacé plus plus, positionnez un morceau propre de paraforme sur la plaque métallique sur glace et déposez à l'aide d'une pipette des gouttes de 30 microlitres d'un anticorps reconnaissant le domaine ecto de la protéine d'intérêt.Placez maintenant le filtre contenant les cellules à l’envers sur la goutte et ajoutez quelques gouttes d’anticorps sur la face arrière du filtre. Incubez une heure sur de la glace. Lavez les cellules trois fois avec du PBS glacé plus plus et fixez avec du paraformaldéhyde à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante.Procédez au lavage des cellules une fois avec du PBS plus plus et équilibrez dans du PBS plus plus pendant cinq minutes. Incubez ensuite les cellules dans un tampon de blocage perméabilisant. Incubez une heure à température ambiante, diluez les anticorps primaires au 1/200 dans du BPB pour détecter la RAB GTPase exprimée, centrifugez pendant 10 minutes à 13 000 tr/min, puis pipetez 30 microlitres de la solution d'anticorps sur un parafilm propre placé dans une chambre humide.Placer les cellules sur le filtre à l’envers sur les gouttes d’anticorps et incuber pendant une heure. À température ambiante, remettre les cellules à l’endroit dans une plaque de 12 puits et laver cinq fois sur 30 minutes avec du BPB à température ambiante après incubation avec les anticorps secondaires appropriés, en incluant une étape de lavage.Immergez les cellules sur le filtre trois fois dans de l'eau déionisée et placez-les à l'endroit sur des lames microscopiques avec 10 microlitres de milieu de montage. Déposez un verre de couverture micro de 18 sur 18 millimètres par-dessus et, à l'aide de mouchoirs en papier, appuyez doucement sur le verre de couverture pour le fixer aux cellules. Enfin, scellez avec du vernis à ongles lors de l'injection factice contenant uniquement le plasmide codant pour V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La protéine est acheminée vers la surface basolatérale de cellules MDCK bien polarisées, comme en témoigne la coloration rouge de surface observée dans les cellules qui ne sont pas bien polarisées.Une partie de la protéine de fusion GFP sera acheminée vers la membrane apicale. Si les échantillons témoins présentent cet aspect, les données ne sont pas fiables et l'expérience doit être répétée avec des cellules mieux polarisées. Notez que toute la protéine de fusion exprimée en GFP n'est pas acheminée vers la membrane basolatérale pendant la phase de poursuite à 31 degrés Celsius, comme en témoigne le signal vert intracellulaire étendu pour la protéine totale. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ 10 à 12 heures après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic membranaire pour explorer les protéines régulatrices dans les cellules épithéliales polarisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer des protéines dans des cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.

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Injection directe intranucléaire d'ADNc est une technique de transfection efficaces pour les cellules post-mitotiques. Cette méthode fournit des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues dans un ou plusieurs des constructions d'ADNc et la fonction des protéines permet d'être étudiée dans un environnement physiologiquement pertinents avec une variété de dosages seule cellule.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules...

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Procédé pour spatio-temporel de commande de l'activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l'irradiation permet l'activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de...

Modification génétique et la recombinaison des cultures d&#39;organes salivaires Gland

Cette présentation démontre une méthode dans laquelle l’électroporation de cellules adhérentes et cultivées est utilisée pour l’étude de la communication intercellulaire et jonctionnelle, tandis que les cellules se développent sur une lame recouverte d’oxyde d’indium-étain conducteur et transparent.

Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

Ce protocole compare les affinités relatives des partenaires de liaison pour les GTPases de la famille Rho, y compris Rac1. In vivo, les protéines de liaison à Rac1 sont en compétition pour une seule interface de liaison, dont la conformation est dictée par un nucléotide lié. Le nucléotide est à la fois important et difficile à contrôler expérimentalement, en raison du taux d’hydrolyse élevé.

En comparant l&#39;affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

Nous décrivons une méthode pour les expériences de déplétion-sauvetage qui préserve l’intégrité cellulaire et l’homéostasie des protéines. L’adénoflexion permet des analyses fonctionnelles de protéines dans des processus biologiques qui reposent sur une dynamique basée sur l’actine finement ajustée, telle que la division cellulaire mitotique et la myogenèse, au niveau de la cellule unique.

Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la prénylation et la guanosine-5'-triphosphate (GTP)-chargement de la Rho GTPase. Ce protocole comprend deux méthodes détaillées, à savoir fractionnement membrane et une GTPase-immuno assay. Le protocole peut être utilisé pour mesurer la prénylation et la GTP chargement de différentes autres petites GTPases.

Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

Apprenez à analyser les petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées par microinjection de plasmides. Cette méthode permet d'étudier les effets primaires des protéines avec une visualisation par microscopie confocale.

Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

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