Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Cette procédure permet d’évaluer les effets des petits ECA GTP sur le trafic de membranes polarisées. Tout d’abord, co-injecter des plasmides d’ADN codant pour le petit GTP ACE et les protéines rapporteures dans les noyaux cellulaires des cellules polarisées. Ensuite, exprimez l’ADN à des températures qui arrêteront les protéines rapporteures dans le réticulum endoplasmique ou le TGN pendant que le petit GTPA s’accumule dans le cytosol et poursuivez la protéine rapporteure jusqu’à la surface de la cellule en présence de cyclo-heide pour empêcher la synthèse ultérieure des protéines.

Enfin, marquez la protéine rapporteure à la surface de la cellule pour l’analyse par immunofluorescence. Les résultats obtenus à partir de ce test permettent de visualiser le changement de localisation de surface par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le trans transfect est que pendant les courts temps de surexpression obtenus avec la micro-injection, les effets secondaires sont minimes, ce qui nous permet d’étudier les effets primaires des protéines d’intérêt.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la polarité cellulaire, telles que la taille de la gtpa qui régule le trafic de la membrane polarisée. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les différentes étapes nécessaires à la réussite d’une micro-injection sont difficiles à expliquer sans aide visuelle. Isolez l’ADN plasmatique libre d’endotoxine avec le kit de préparation maxi sans endotoxine Sigma Aldrich selon le protocole du fabricant. Pour cette expérience, utilisez trois filtres transparents de 12 millimètres de pores de 0,4 micromètre pour la culture.

Les cellules placent quatre fois 10 des cinquièmes cellules MDCK sur chaque filtre. Après deux jours, examinez la culture au microscope pour vérifier que les cellules se développent en une monocouche fermée. Pour la micro-injection.

Le jour de la micro-injection, préparez des plaques de 360 par 15 millimètres de substrat de croissance MM de cinq litres plus des heis de 15 millimètres et placez-les dans un incubateur à 39 degrés Celsius. De plus, préparez trois plaques de 12 puits de milieu de croissance MEM d’un millilitre plus 50 heis millimolaires et 0,1 milligramme par millilitre de cycloheximide et placez-les dans un incubateur à 31 degrés Celsius. Allumez le microscope à micro-injection, configuré comme ce microscope inversé avec des objectifs 10 x et 32 x platine chauffés, et un jet femto einor.

Réglez la scène chauffée à 39 degrés Celsius. Ouvrez également l’alimentation du réservoir d’azote gazeux à la table d’air. Diluez maintenant l’ADN avec de l’eau filtrée à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre.

Ensuite, faites tourner l’ADN dans une micro-centrifugeuse einor à 13 000 tr/min pendant 30 minutes. Retirez la partie supérieure et placez-la dans un nouveau tube. Ensuite, préparez les cellules MDCK en sortant le premier filtre de sa boîte de culture avec la lame chirurgicale, découpez le filtre du porte-filtre et placez-le dans la plaque préparée de 60 x 15 millimètres contenant cinq millilitres de média de croissance MEM réchauffé à 39 degrés Celsius plus 50 grains d’altitude millimolaire.

Pour alourdir le filtre dans la plaque de culture, placez la lame chirurgicale au centre du filtre, puis transférez la plaque de culture sur la platine chauffée du microscope. Chargez deux à trois microlitres d’ADN dilué dans une aiguille de micro-injection. Tournez le couvercle de protection de l’aiguille et laissez-la tomber sur le sol.

Pour positionner l’aiguille dans le support, appuyez sur la touche menu de l’injecteur et assurez-vous que la valve est fermée. Vissez l’aiguille dans son support. Attention à ne pas visser l’aiguille trop serrée.

Comme cela peut entraîner une casse, appuyez à nouveau sur la touche menu. Ainsi, la pression de compensation appliquée empêchera le support d’être aspiré dans l’aiguille pendant la procédure de micro-injection. Enfin, appuyez sur le joystick pour effacer les retours stockés afin d’abaisser l’aiguille sur les cellules.

Utilisez l’objectif 10 x et amenez l’aiguille dans le faisceau lumineux au-dessus du liquide. Concentrez-vous maintenant sur les cellules. Faites à nouveau la mise au point en tournant la molette de mise au point de 180 degrés vers le haut et trouvez l’aiguille.

Déplacez lentement l’aiguille pour qu’elle soit nette. Ensuite, retirez-le à nouveau de la mise au point. Travailler à ramener les cellules au point.

Mettez l’aiguille au point à nouveau. Répétez l’opération jusqu’à ce que l’aiguille touche la surface du support, à quel point un halo est observé. Continuez à atteindre le point où les cellules sont nettes, mais l’aiguille est toujours floue hors du plan focal.

Passez maintenant à l’objectif 32 x et trouvez les paramètres du parcours. Fixez la limite Z en touchant la membrane apicale avec la pointe de l’aiguille et en soustrayant environ 10 micromètres. Comme les noyaux se trouvent à environ 10 micromètres sous la membrane apicale.

Maintenant, sortez l’aiguille de quelques microns du plan focal aussi vite que possible. Visez avec l’aiguille au-dessus du noyau et appuyez et relâchez le bouton d’injection du joystick. Commencez à 95 PSI pour trouver la bonne pression d’injection.

Si la pression est trop élevée, les cellules explosent. Si la pression est trop faible, un point blanc persiste, mais rien d’autre ne se passe. Effectuez une injection réussie impliquant un changement de phase sans changement de taille de cellule.

Injectez 100 à 500 cellules dans le trou de la lame chirurgicale qui repose sur les cellules. Ensuite, placez les cellules avec la boîte de culture et la lame chirurgicale dans un incubateur à 39 degrés Celsius et incubez pendant deux heures. Enfin, transférez les cellules dans la plaque préparée à 12 puits d’un millilitre, MEM plus 50 millimolaires de 0,1 milligramme par millilitre, cyclo heide et incubez pendant deux heures à 31 degrés Celsius.

Afin d’éviter le blanchiment du signal GFP exprimé, protégez les échantillons de la lumière en les recouvrant d’une feuille d’aluminium pendant toutes les procédures ultérieures de coloration de surface. Placez les cellules dans une boîte de culture sur une plaque métallique sur de la glace et lavez-les. Une fois avec du PBS plus plus glacé, positionnez un morceau propre de paraforme sur la plaque métallique sur une pipette à glace de 30 gouttes microlitres d’un anticorps qui reconnaît le domaine ecto de la protéine d’intérêt.

Placez maintenant le filtre contenant les cellules à l’envers sur la goutte et ajoutez quelques gouttes d’anticorps à l’arrière du filtre. Incuber pendant une heure sur glace. Lavez les cellules trois fois avec du PBS plus plus glacé et fixez avec de l’aldéhyde paraforme à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Procédez au lavage des cellules une fois avec PBS plus plus et équilibrez avec PBS plus plus pendant cinq minutes. Maintenant, incubez les cellules dans un tampon perméable de blocage. Incuber une heure à température ambiante, diluer les anticorps primaires de un à 200 dans du BPB pour détecter la centrifugeuse RAB GTP ACE exprimée pendant 10 minutes à 13 000 tr/min pipette, 30 microlitres de la solution d’anticorps sur un param propre placé dans une chambre humide.

Placez les cellules du filtre à l’envers sur les gouttes d’anticorps et incubez pendant une heure. À température ambiante, remettez les cellules à l’endroit en 12. Bien plaquer et laver cinq fois en 30 minutes avec du BPB à température ambiante après l’incubation avec les anticorps secondaires appropriés, y compris une étape de lavage.

Trempez trois fois les cellules du filtre dans de l’eau déminéralisée et placez-les à l’endroit sur des micro-lames à 10 microlitres de montage Placez un verre micro recouvert de 18 x 18 millimètres sur le dessus et, à l’aide de mouchoirs en papier, appuyez doucement sur la glissière de couverture sur les cellules. Enfin, sceller avec du vernis à ongles dans l’injection simulée de seulement le plasmide codant pour V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La protéine est délivrée à la surface basolatérale des cellules MDCK bien polarisées, comme en témoigne la coloration de la surface rouge dans les cellules qui ne sont pas bien polarisées.

Une partie de la protéine de fusion GFP sera délivrée à la membrane apicale. Si les échantillons de contrôle ressemblent à cela, les données ne sont pas fiables et l’expérience doit être répétée avec des cellules mieux polarisées. Notez que toute la fusion exprimée à la GFP n’est pas délivrée à la membrane basolatérale pendant la chasse de 31 degrés Celsius, comme en témoigne le signal vert intracellulaire étendu pour la protéine totale Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ 10 à 12 heures après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic membranaire pour explorer les protéines régulatrices dans les cellules épithéliales polarisées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer des protéines dans des cellules épithéliales polarisées à l’aide de la technique de micro-injection.