Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l'aide postnatale à base de virus recombinaison Cre

L’objectif global de cette procédure est de manipuler la fonction des gènes pendant la période postnatale du développement du cerveau. Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner et préparer les virus appropriés, les charger dans la seringue et préparer le matériel d’injection. Ensuite, le virus est injecté dans le cerveau des bébés souris nouveau-nés, et l’étape finale consiste à sacrifier les animaux et à imager les régions injectées.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un marquage différentiel des cellules de contrôle et d’inactivation par microscopie d’immunofluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont la période de développement postnatal est génétiquement régulée. Pour l’injection, une solution virale adéno-associée disponible dans le commerce peut être utilisée à plein titre, généralement de 10 à 12 copies du génome par millilitre pour manipuler un grand nombre de cellules.

Si vous souhaitez un marquage clairsemé ou un étiquetage, commencez par une dilution de un à 10. Après avoir décongelé le virus sur de la glace, transférez immédiatement le volume de pré-dilution dans un tube PCR stérile de 250 microlitres. Gardez la dilution sur de la glace. Maintenant.

Préparez la pompe d’injection en sélectionnant une seringue appropriée et en la connectant à une aiguille de chargement. Ensuite, aspirez doucement la solution virale jusqu’à ce qu’une très petite bulle d’air apparaisse dans la seringue et un colorant de chargement inerte peut être utilisé pour faciliter cette étape. Fixez maintenant la seringue à la pompe à l’aide d’un dispositif de retenue.

Fixez ensuite doucement le tube de connexion entre la seringue et le porte-aiguille. Assurez-vous que l’aiguille d’injection est en contact direct avec le tube de connexion à l’intérieur du porte-aiguille. Maintenant, déplacez lentement la solution à travers le tube de connexion jusqu’à ce qu’une petite goutte de solution soit visible à l’extrémité de l’aiguille.

Fixez soigneusement le piston à côté du bloc de poussoir à l’aide d’un support sur la pompe. Réglez le taux d’injection à huit microlitres par minute et réglez le volume d’injection entre un et deux microlitres. Ajustez ensuite le réglage du diamètre de la seringue de la pompe pour qu’il corresponde au diamètre de la seringue que vous utilisez.

Enfin, pour protéger les chiots pendant la phase de récupération, réglez la plaque chauffante à 38 degrés Celsius et couvrez-la d’une serviette en papier. À l’aide d’un protocole approuvé par l’IACUC, préparez des bébés souris P zéro ou P un pour l’injection en les soumettant à une anesthésie froide. Humidifiez quelques serviettes en papier avec de l’eau et placez-les sur de la glace.

Placez ensuite quatre ou cinq chiots sur la serviette en papier bien séparés. Pliez les essuie-tout sur les chiots, placez délicatement une petite quantité de glace pilée sur les essuie-tout et incubez les chiots pendant environ cinq minutes. Les chiots peuvent être maintenus en toute sécurité sur la glace jusqu’à 15 minutes et ont encore une bonne récupération.

Positionnez maintenant un chiot anesthésié sur un bloc de montage pour un meilleur accès au site d’injection. Le cortex, par exemple, est plus facilement accessible en posant l’animal à plat sur le ventre. Le chiot peut être fixé en place à l’aide d’un pansement, stabiliser manuellement la tête du chiot et serrer la peau pour l’empêcher de bouger.

Ensuite, naviguez dans les repères anatomiques du crâne comme la suture lambda, et sélectionnez un point d’injection reproductible avec l’autre main, insérez doucement l’aiguille à travers le crâne. Ne poussez pas fort si l’aiguille ne pénètre pas facilement dans le crâne. Au lieu de cela, repositionnez l’aiguille et réessayez doucement.

La profondeur d’injection varie légèrement entre les animaux et les souches pour le cortex, une profondeur d’un demi-millimètre à un millimètre fonctionne généralement. Maintenant, injectez la solution virale en demandant à un collègue d’activer la pompe pour minimiser les mouvements de la main. Idéalement, une pédale pourrait être utilisée pour démarrer la pompe après l’injection.

Gardez l’aiguille en place pendant quelques secondes, puis gardez la tête du chiot immobile en douceur. Faites glisser l’aiguille vers l’extérieur. Maintenant, laissez le chiot récupérer pendant cinq à 10 minutes sur la plaque chauffante couverte.

Pendant ce temps, continuez à injecter d’autres chiots. Lorsque les chiots ont tous retrouvé leur couleur rose et bougent tous, frottez-les doucement avec une partie de leur litière d’origine. Ce n’est qu’alors qu’ils pourront être rendus à leur mère.

Sinon, ils pourraient être traités comme des chiots inconnus, que la mère tuerait très probablement une fois que les chiots ont été rendus à leur mère. Nettoyez la configuration d’injection en chargeant complètement la seringue avec de l’acétone ou de l’éthanol à 70 %. Si des composants sensibles à l’acétone tels que sano, acurate, adhésifs sont utilisés, rincez la solution à travers le dispositif d’injection plusieurs fois en utilisant une solution fraîche à chaque fois.

Cela éliminera toute solution virale restante et précipitera l’évaporation des solvants. Après avoir rincé l’installation, désinfectez la zone de travail de l’eau de Javel pour la laisser prête pour le prochain expérimentateur. Mentor. Une technique réussie produit une infection neuronale robuste au site d’injection.

Les injections dans des régions spécifiques telles que le cortex et le colliculus supérieur génèrent généralement des infections locales avec une propagation minimale aux régions adjacentes. L’utilisation d’une solution virale à titre élevé rend l’infection des zones adjacentes telles que l’hippocampe plus probable, l’injection avec une solution virale à faible titre. Entraîne une infection clairsemée généralement près du site d’injection, comme l’injection cérébelleuse sur la ligne médiane, le nombre de cellules infectées doit être corrélé à un titre de la solution virale injectée.

Par exemple, l’injection d’un mélange de solutions à titre élevé de deux virus R AAV huit exprimant différentes protéines fluorescentes dans le cervelet infecte de nombreuses cellules kinji qui sont marquées de manière différentielle. À l’inverse, l’injection d’une solution virale à faible titre peut entraîner une infection clairsemée pour aider à visualiser les cellules individuelles. Les neurones marqués par fluorescence peuvent être observés directement dans les tissus vivants fraîchement coupés, ou ils peuvent être soumis à une immuno-marquage.

Cela améliore les signaux fluorescents endogènes pour l’acquisition ultérieure d’images par microscopie fluorescente à champ large ou confocale. Enfin, RAAV eight est capable d’infecter une variété de types de neurones dans le cortex avec un fort marquage des processus fins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes si elle est exécutée correctement.