Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 2:30 min • April 30th, 2023
La microdissection par capture laser permet d’obtenir une seule cellule cible à partir d’un mélange de cellules préparé sur une lame de verre. Commencez par prendre une lame de verre appropriée recouverte d’une membrane biochimiquement inerte perméable aux UV sur sa surface. Exposez la lame à la lumière UV pour la rendre plus hydrophile et permettre une meilleure adhérence cellulaire.
Assemblez la lame dans un appareil de cytocentrifugation. Ajoutez la suspension cellulaire sur l’orifice de l’entonnoir de l’appareil. Cytocentrifugeuse pour permettre à la force centrifuge de se concentrer et de déposer une monocouche de cellules sur une petite surface sur la lame de verre. Laissez la diapositive sécher à l’air.
Placez la lame, côté échantillon vers le haut, sous un microscope à microdissection laser. Définissez la région entourant la cellule d’intérêt. Maintenant, concentrez le faisceau laser pour disséquer la région contenant la cellule cible ainsi que le revêtement de la membrane. Ensuite, défocalisez le faisceau laser et pulsez-le pour générer une pression. Cette énergie catapulte la région microdissquée dans le capuchon inversé d’un tube de collecte pré-assemblé contenant un tampon placé au-dessus de la lame.
Récupérez le tube et fermez son bouchon. Faites tourner le tube pour amener le tampon contenant la cellule cible unique au fond du tube. Réfrigérer le tube jusqu’à une analyse plus approfondie.
Pour la microdissection laser, cytocentrifugez la totalité des 300 microlitres de suspension cellulaire sur une lame recouverte d’une membrane à 300 x g pendant 5 minutes. Ensuite, placez la lame recouverte d’une membrane sur un microscope capable de microdissection laser. Ensuite, placez une pipette de 4,5 microlitres de mélange maître de lyse cellulaire dans le capuchon du tube PCR de 0,2 millilitre.
Placez le capuchon au-dessus de l’échantillon et prélevez une seule cellule par microdissection laser. Immédiatement après, vérifiez la présence de cellules isolées dans le capuchon de PCR. Retirez le tube PCR du microscope de microdissection laser et fermez le tube. Récupérez tout le liquide au fond du tube avec une courte rotation.