Modélisation du cancer de la prostate dans des modèles murins génétiquement modifiés : une technique d’édition de gènes localisée médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules du lobe antérieur de la prostate de souris

Commençons avec un modèle de souris knock-in CRISPR/Cas9 anesthésié et préparé portant un génome conçu pour exprimer les endonucléases Cas9 et les protéines fluorescentes vertes, ou GFP, par un fort promoteur en amont. Une cassette flox-STOP ou LSL insérée immédiatement en aval du promoteur bloque la transcription Cas9 et GFP dans des conditions normales.

Incisez la paroi abdominale de la souris pour exposer son lobe antérieur de la prostate attaché à la vésicule séminale. Injectez la suspension adénovirale souhaitée dans le lobe antérieur pour faciliter l’administration ciblée du génome viral dans les cellules. Replacez le lobe de la prostate dans la cavité abdominale et suturez l’incision.

Dans les cellules infectées par le virus, le génome viral exprime les enzymes Cre recombinase et les ARN-guides ciblant le gène à muter. Les enzymes Cre reconnaissent la cassette LSL et excisent le bloqueur de transcription floxé. Cette étape permet au promoteur de piloter l’expression des endonucléases et des GFP de Cas9.

Par la suite, les endonucléases Cas9 forment des complexes avec des ARN-guides codés par le virus qui dirigent ces complexes vers la séquence cible dans le gène à muter. Cette localisation permet à l’endonucléase Cas9 de cliver l’ADN génomique au sein du gène cible, entraînant une altération génétique.

Une altération oncogénique fait que les cellules mutées deviennent cancéreuses. La co-expression des protéines rapporteures de la GFP au sein des cellules mutées facilite l’identification et le suivi de la progression du cancer.

Pour administrer le virus à la prostate, après avoir anesthésié une souris mâle de 8 semaines selon le protocole textuel, examinez la profondeur de l’anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, le retrait de la pédale et les réflexes palpébraux. Lorsqu’une perte de réflexes est observée, rasez le bas-ventre de l’animal. À l’aide d’un coton-tige stérile, couvrez soigneusement les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la cécité causée par la xérophtalmie. Ensuite, utilisez 70 % d’éthanol et 10 % de povidone iodée pour essuyer l’abdomen rasé afin de désinfecter la zone chirurgicale.

Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision cutanée verticale d’environ 1 centimètre au niveau de la ligne médiane abdominale basse. Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, soulevez le péritoine pour éviter d’endommager les organes qui se trouvent en dessous, et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire soigneusement une incision de 8 millimètres ou moins à travers le péritoine. Écartez doucement le tissu adipeux pour découvrir la vésicule séminale. Ensuite, à l’aide d’une pince annelée, soulevez soigneusement la vésicule séminale jusqu’à ce que la prostate antérieure puisse être identifiée.

Maintenant, à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 millilitre et d’une aiguille de 30 G x 8 millimètres, injectez un volume total de 30 microlitres de solution virale dans l’épithélium antérieur de la prostate. Minimisez les fuites et assurez-vous que le liquide est absorbé dans le tissu, formant une petite bulle. Ensuite, replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale.

Pour s’assurer que le liquide est absorbé dans le tissu en une petite bulle et sans fuite, assurez-vous d’injecter parallèlement à la vésicule séminale et en suivant la forme du lobe antérieur de la prostate.

À l’aide d’une aiguille à pointe conique et d’un cercle de 13 millimètres, 3/8, suturez le péritoine avec deux à trois points de suture simples interrompus de suture résorbable 6-0. Ensuite, en soulevant la peau à l’aide d’une pince pour éviter d’endommager le péritoine, agrafez la peau à l’aide de trois clips stériles de 4,8 x 6,5 millimètres.

Pour une meilleure récupération après la chirurgie, utilisez une seringue stérile de 1 millilitre et une aiguille de 27 G x 1/2 pouce pour administrer l’antidote d’anesthésie à une dose de 0,1 millilitre par gramme de poids corporel par injection intrapéritonéale. Ensuite, remettez soigneusement l’animal dans sa cage.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.