Modélisation du cancer de la prostate dans des modèles murins génétiquement modifiés : une technique d’édition de gènes localisée médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules du lobe antérieur de la prostate de souris

Commençons avec un modèle de souris knock-in CRISPR/Cas9 anesthésié et préparé portant un génome conçu pour exprimer les endonucléases Cas9 et les protéines fluorescentes vertes, ou GFP, par un fort promoteur en amont. Une cassette flox-STOP ou LSL insérée immédiatement en aval du promoteur bloque la transcription Cas9 et GFP dans des conditions normales.

Incisez la paroi abdominale de la souris pour exposer son lobe antérieur de la prostate attaché à la vésicule séminale. Injectez la suspension adénovirale souhaitée dans le lobe antérieur pour faciliter l’administration ciblée du génome viral dans les cellules. Replacez le lobe de la prostate dans la cavité abdominale et suturez l’incision.

Dans les cellules infectées par le virus, le génome viral exprime les enzymes Cre recombinase et les ARN-guides ciblant le gène à muter. Les enzymes Cre reconnaissent la cassette LSL et excisent le bloqueur de transcription floxé. Cette étape permet au promoteur de piloter l’expression des endonucléases et des GFP de Cas9.

Par la suite, les endonucléases Cas9 forment des complexes avec des ARN-guides codés par le virus qui dirigent ces complexes vers la séquence cible dans le gène à muter. Cette localisation permet à l’endonucléase Cas9 de cliver l’ADN génomique au sein du gène cible, entraînant une altération génétique.

Une altération oncogénique fait que les cellules mutées deviennent cancéreuses. La co-expression des protéines rapporteures de la GFP au sein des cellules mutées facilite l’identification et le suivi de la progression du cancer.

Pour administrer le virus à la prostate, après avoir anesthésié une souris mâle de 8 semaines selon le protocole textuel, examinez la profondeur de l’anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, le retrait de la pédale et les réflexes palpébraux. Lorsqu’une perte de réflexes est observée, rasez le bas-ventre de l’animal. À l’aide d’un coton-tige stérile, couvrez soigneusement les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la cécité causée par la xérophtalmie. Ensuite, utilisez 70 % d’éthanol et 10 % de povidone iodée pour essuyer l’abdomen rasé afin de désinfecter la zone chirurgicale.

Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision cutanée verticale d’environ 1 centimètre au niveau de la ligne médiane abdominale basse. Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, soulevez le péritoine pour éviter d’endommager les organes qui se trouvent en dessous, et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire soigneusement une incision de 8 millimètres ou moins à travers le péritoine. Écartez doucement le tissu adipeux pour découvrir la vésicule séminale. Ensuite, à l’aide d’une pince annelée, soulevez soigneusement la vésicule séminale jusqu’à ce que la prostate antérieure puisse être identifiée.

Maintenant, à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 millilitre et d’une aiguille de 30 G x 8 millimètres, injectez un volume total de 30 microlitres de solution virale dans l’épithélium antérieur de la prostate. Minimisez les fuites et assurez-vous que le liquide est absorbé dans le tissu, formant une petite bulle. Ensuite, replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale.

Pour s’assurer que le liquide est absorbé dans le tissu en une petite bulle et sans fuite, assurez-vous d’injecter parallèlement à la vésicule séminale et en suivant la forme du lobe antérieur de la prostate.

À l’aide d’une aiguille à pointe conique et d’un cercle de 13 millimètres, 3/8, suturez le péritoine avec deux à trois points de suture simples interrompus de suture résorbable 6-0. Ensuite, en soulevant la peau à l’aide d’une pince pour éviter d’endommager le péritoine, agrafez la peau à l’aide de trois clips stériles de 4,8 x 6,5 millimètres.

Pour une meilleure récupération après la chirurgie, utilisez une seringue stérile de 1 millilitre et une aiguille de 27 G x 1/2 pouce pour administrer l’antidote d’anesthésie à une dose de 0,1 millilitre par gramme de poids corporel par injection intrapéritonéale. Ensuite, remettez soigneusement l’animal dans sa cage.