Analyse de l’expression des protéines basée sur des réseaux de protéines en phase inverse : une procédure de quantification simultanée de l’expression de plusieurs protéines à partir d’un lysat cellulaire

Un échantillon de tumeur contient une population hétérogène de protéines. À l’aide du lysat tumoral, plusieurs de ces protéines peuvent être analysées en parallèle pour identifier la protéine d’intérêt. Cette technique à haut débit est appelée Reverse Phase Protein Arrays ou RPPA.

Pour effectuer une RPPA, commencez par prendre une lame de verre d’immunodosage recouverte de nitrocellulose. Repérez un ensemble de protéines de lysat tumoral sur la lame. Incuber pour permettre la capture des protéines sur la nitrocellulose. Par la suite, traitez la lame avec un tampon bloquant qui bloque les sites de liaison d’anticorps non spécifiques sur les protéines.

Retirez l’excès de solution de blocage. Maintenant, montez la lame recouverte de protéines dans un support et fermez-la hermétiquement. Cela crée des puits temporaires sur la surface du toboggan. Ensuite, chargez les puits avec une solution d’anticorps primaires. Ces anticorps reconnaissent les épitopes présents sur la cible correspondante à partir d’un mélange de protéines sur le réseau.

Enfin, ajoutez des anticorps secondaires marqués par fluorescence. Ces anticorps se fixent aux anticorps primaires pré-liés formant un complexe. Lavez la lame pour éliminer tous les anticorps secondaires non liés. Détachez la glissière du support et laissez-la sécher à l’air.

Numérisez la lame à l’aide d’un scanner fluorescent. Les protéines cibles marquées par des anticorps deviennent fluorescentes à une longueur d’onde spécifique et apparaissent sous forme de taches colorées sur la surface de la lame.

Avant l’impression RPPA, une série de cinq dilutions doubles est effectuée à partir de chaque échantillon. L’un des aspects les plus chronophages de cette procédure est de faire des centaines de dilutions. Le succès peut être assuré en revérifiant avant d’imprimer les diapositives.

Un observateur robotique MicroGrid II est ensuite utilisé pour repérer les lysats de protéines sur des lames de verre recouvertes de nitrocellulose. Chaque échantillon est repéré en trois exemplaires, ce qui donne un total de 15 points par échantillon. Les lames utilisées dans cette expérience contiennent deux coussinets sur lesquels les échantillons sont repérés. Chaque tampon a été repéré avec des échantillons identiques, dans ce cas, 100 échantillons. Les autres formats disponibles incluent des diapositives de 1, 8 et 16 pads. Plus le nombre de tampons est élevé, plus le nombre d’échantillons pouvant être repérés sur chacun d’eux est petit.

Pour commencer la procédure de détection des protéines, les lames humides dans un tampon de blocage en excès et incuber à température ambiante pendant 1 heure sur une plate-forme à bascule. Préparez 800 microlitres d’anticorps primaires dans un tampon de blocage aux concentrations souhaitées et conservez-les sur de la glace. Après l’incubation d’une heure dans un tampon de blocage, montez les lames dans le clip à puce à cadre unique ou le support de diapositives à quatre baies FastFrame de manière à ce qu’un joint étanche soit formé entre la lame et la chambre d’incubation.

Retirez le tampon résiduel des puits et ajoutez 600 microlitres d’anticorps primaires dans les puits respectifs. Placez les lames et la chambre dans une boîte humide scellée et incubez sur une plate-forme à bascule pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain matin, retirez les lames de la chambre froide. Retirez soigneusement les anticorps primaires de chaque puits. Ajoutez 600 microlitres de PBS-Tween20 ou PBS-T à 0,1 % et lavez les lames sur une plate-forme à bascule à température ambiante pendant 5 minutes.

Remplacez le PBS-T par du PBS-T frais. De cette façon, lavez les lames un total de trois fois. Retirez le tampon des puits et ajoutez 600 microlitres d’anticorps secondaires marqués par fluorescence à la dilution appropriée dans les puits respectifs. Incuber avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant 45 minutes en secouant doucement. Il est important de protéger la membrane de la lumière jusqu’au moment où elle est scannée. Après 45 minutes, retirez les anticorps secondaires des puits et lavez-les brièvement trois fois dans 600 microlitres de PBS-T à température ambiante.

Retirez les lames du support, transférez-les dans un récipient approprié et lavez-les en excès de PBS-T pendant 15 minutes, en gardant la membrane dans l’obscurité. Retirez le PBS-T et lavez la membrane avec du PBS à température ambiante pendant 15 minutes pour éliminer les résidus de Tween20, en gardant à nouveau la membrane dans l’obscurité. Faites sécher les Fastslides dans un four à 50 degrés Celsius pendant 10 minutes. Enfin, scannez les lames à 680 nanomètres et/ou 800 nanomètres, en fonction des anticorps secondaires utilisés.

• Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) – High throughput technique for analyzing tumor lysates.
• Lysate Proteins – The proteins obtained from a tumor sample.
• Odyssey Blocking Buffer - Blocks non-specific antibody binding sites on proteins.
• Protein Array Protocol – The method used for performing RPPA.
• Analysis of Protein Expression – Helps identify protein of interest in RPPA.

• Introduce RPPA – A high throughput technique used in analysis of tumor proteins (e.g., RPPA).
• Key Concepts – RPPA uses nitrocellulose-coated slides, lysate proteins and antibodies (e.g., Odyssey Blocking Buffer).
• Underlying Mechanisms – Proteins are attached to antibodies and fluoresce when scanned.
• Connect to Experiment – Enables parallel analysis of multiple proteins in tumor sample.

• What is Reverse Phase Protein Arrays and how is it used to analyze tumor proteins?
• What role does Odyssey Blocking Buffer play in RPPA?
• How does protein-antibody fluorescence help in identifying proteins of interest?

• Practical Applications – RPPA can be used in cancer research (e.g., protein array analysis).
• Industry Impact – Helping improve disease diagnosis and prognosis (e.g., healthcare).
• Societal Importance – Aids in the advancement of personalized medicine (e.g., precision diagnostics).
• Link to Scientific Advancements – Opens new avenues in molecular biology and protein function study.