Analyse de l’expression des protéines basée sur des réseaux de protéines en phase inverse : une procédure de quantification simultanée de l’expression de plusieurs protéines à partir d’un lysat cellulaire

Un échantillon de tumeur contient une population hétérogène de protéines. À l’aide du lysat tumoral, plusieurs de ces protéines peuvent être analysées en parallèle pour identifier la protéine d’intérêt. Cette technique à haut débit est appelée Reverse Phase Protein Arrays ou RPPA.

Pour effectuer une RPPA, commencez par prendre une lame de verre d’immunodosage recouverte de nitrocellulose. Repérez un ensemble de protéines de lysat tumoral sur la lame. Incuber pour permettre la capture des protéines sur la nitrocellulose. Par la suite, traitez la lame avec un tampon bloquant qui bloque les sites de liaison d’anticorps non spécifiques sur les protéines.

Retirez l’excès de solution de blocage. Maintenant, montez la lame recouverte de protéines dans un support et fermez-la hermétiquement. Cela crée des puits temporaires sur la surface du toboggan. Ensuite, chargez les puits avec une solution d’anticorps primaires. Ces anticorps reconnaissent les épitopes présents sur la cible correspondante à partir d’un mélange de protéines sur le réseau.

Enfin, ajoutez des anticorps secondaires marqués par fluorescence. Ces anticorps se fixent aux anticorps primaires pré-liés formant un complexe. Lave