Isolement de la microglie par immunomarquage Tri cellulaire couplé : une méthode d’immunomarquage pour isoler la microglie des cellules cérébrales du poisson-zèbre à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence

Dans des conditions pathologiques, les microglies activées - des macrophages cérébraux spécialisés - aident à éliminer les agents pathogènes et les débris cellulaires. Ces microglies expriment des récepteurs uniques qui les différencient des autres macrophages.

Pour isoler la microglie, commencez par une culture de cellules cérébrales dérivée d’un poisson-zèbre transgénique, exprimant des molécules fluorescentes spécifiques dans différents types de cellules.

La culture contient un mélange de neurones exprimant la fluorescence rouge, de macrophages exprimant la fluorescence verte et de microglies non fluorescentes.

Maintenant, ajoutez un réactif bloquant et incubez la culture avec une agitation intermittente. Le réactif bloquant se lie aux sites non spécifiques des cellules et réduit le signal de fond.

Ensuite, ajoutez des anticorps primaires et incuberez. Ces anticorps se lient à des récepteurs spécifiques exprimés à la surface de la microglie.

Centrifugez la culture et retirez le surnageant contenant des anticorps non liés. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais.

Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent et incuberez. Ces anticorps se lient aux anticorps primaires et confèrent une couleur rouge au complexe microglie-anticorps.

Centrifugez la culture et retirez les anticorps non liés. Remettez le granulé en suspension dans un milieu frais.

Filtrez les cellules pour éliminer tous les débris.

À l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS, triez la population de cellules microgliales en fonction de leur taille et de leur fluorescence.

La microglie isolée peut être utilisée pour d’autres applications.

Pour immunocolorer la microglie, utilisez 0,3 millilitre de média A plus 2 % de NGS pour remettre en suspension la pastille cellulaire. Ensuite, répartissez les cellules entre trois tubes de 1,5 millilitre : un pour les cellules non colorées pour mesurer l’autofluorescence, un pour mesurer la liaison non spécifique d’un anticorps secondaire à la microglie et un troisième comme test.

À tous les tubes, ajoutez 1 % d’endotoxines à faible teneur en enzymes, sans azoture (LEAF) pour bloquer les interactions CD16/CD32 avec le domaine Fc des immunoglobulines. Ensuite, incubez les cellules pendant 10 minutes avec une légère agitation toutes les 5 minutes.

Ensuite, dans le troisième tube, ajoutez l’anticorps 4C4 et incubez-le pendant 30 minutes avec une légère agitation toutes les 10 minutes. Ensuite, faites tourner les tubes à 300 x g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir jeté le surnageant, lavez une fois la pastille avec 0,5 millilitre de média A plus 2 % NGS avant de faire tourner à nouveau les tubes. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 0,5 millilitre de substrat A plus 2 % de NGS, puis ajoutez 1 % de LEAF et incubez les cellules pendant 10 minutes en agitant doucement toutes les 5 minutes.

Aux tubes 2 et 3, ajoutez des anticorps secondaires et placez les tubes dans l’obscurité. Après avoir essoré les tubes et jeté le surnageant, utilisez 0,5 millilitre de média A plus 2 % de NGS pour laver les échantillons deux fois, puis remettez en suspension les pastilles de cellule avec 1 millilitre de média A plus 2 % de NGS.

Faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de 35 microns et transférez-la dans des tubes FACS froids de 5 millimètres sur de la glace à l’abri de la lumière. Enfin, effectuez le tri FACS et l’extraction de l’ARN selon le protocole texte.

• Microglia - Specialized brain macrophages that help eliminate pathogens and cell debris.
• 30 um cell strainer - A device used to filter cells for purification.
• Microglia Isolation – The process of separating microglia cells from other cells.
• Microglia Antibodies - Bind to receptors on microglia surfaces to identify them.
• Activated Microglia - Microglia which are 'activated' to help fight pathogens in pathological conditions.

• Microglia play a vital role in eliminating pathogens and cell debris under certain conditions (e.g., microglia).
• The science of isolating these microglia involves using fluorescent molecules and specific markers (e.g., microglia isolation).
• 30 um cell strainers allow for the filtering of brain cells (e.g., 30 um cell strainer).
• The process also involves blocking reagents, primary antibodies, and fluorescent-dye conjugated secondary antibodies to visually identify microglia.

• How does the microglia function in pathological conditions?
• What makes microglia distinct from other types of macrophages?
• What is the process to successfully isolate microglia?

• Microglia isolation has practical implications in neuroscience research (e.g., neuroscience).
• It can influence the medical industry by aiding in the understanding of neurodegenerative diseases (e.g., healthcare).
• This procedure has broader societal importance by contributing to advancements in treating brain ailments (e.g., disease control).
• Your understanding of Microglia isolation can contribute to innovation in the field of cellular biology.