Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:27 min • July 8th, 2025
Le système tétracycline-On ou Tet-On est un système d’expression génique conditionnel qui active l’expression du gène d’intérêt en présence de tétracycline ou de son analogue, la doxycycline.
Commençons par une souris génétiquement modifiée avec un génome modifié contenant un gène codant pour la protéine activatrice transcriptionnelle contrôlée par la tétracycline inverse, ou rtTA, pilotée par un promoteur spécifique du foie dans les cellules hépatiques ou les hépatocytes. De plus, la souris contient un gène d’intérêt sous le contrôle de séquences d’opérateurs tétracyclines ou de tetO situées en amont et fusionnées sélectivement à un promoteur minimal. Le tetO et le promoteur sont appelés l’élément sensible à la tétracycline, ou TRE.
La rtTA exprimée - une protéine de fusion comprenant le répresseur tet, tetR et le domaine de transactivation de la protéine virale VP16 - forme des dimères, qui sont inactifs et ne peuvent pas se lier à la séquence tetO du TRE, empêchant l’activation de l’expression du gène cible.
Préparez une solution contenant de la doxycycline et du saccharose. L’ajout de saccharose augmente l’appétence. Après le filtrage, fournissez la solution de doxycycline-saccharose comme eau de boisson à la souris. La doxycycline administrée s’accumule dans le foie.
Dans les hépatocytes, la doxycycline se lie à la rtTA, provoquant un changement de conformation et une affinité accrue pour le site de liaison à l’ADN tetO. Le domaine de liaison à l’ADN tetR de rtTA lié à la doxycycline se lie à la séquence tetO de l’élément TRE. Le domaine VP16 recrute en outre l’ARN polymérase, conduisant à la transcription, à la formation de l’ARNm et à l’expression ultérieure du gène cible rapporteur en aval.
Pour les expériences de moins de 10 jours, administrer continuellement la doxycycline dans l’eau potable en suivant le protocole suivant. Tout d’abord, dissolvez 5 grammes de saccharose dans 100 millilitres d’eau du robinet et autoclave.
Ensuite, dissolvez 100 milligrammes d’hyclate de doxycycline dans 5 millilitres de solution de saccharose dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres pour filtrer stérilement la solution à travers un filtre de 0,2 micron, puis ajoutez la solution de doxycycline filtrée aux 95 millilitres restants de solution de saccharose et fournissez la solution à la souris au lieu de boire de l’eau. Vérifiez quotidiennement et remplacez immédiatement si la solution devient trouble, ce qui indique une prolifération bactérienne.