Multimer-PAGE pour la séparation de complexes de protéines natives : une technique de séparation hybride composée de Blue Native-PAGE et de SDS-PAGE pour séparer les protéines multimères intactes du lysat tissulaire

Les complexes protéiques multimériques sont essentiels à divers processus biologiques.

Pour séparer les complexes protéiques à l’état natif par multimère-PAGE, prenez du lysat tissulaire contenant les complexes souhaités. Chargez le lysat sur un assemblage de gel pour Blue native PAGE.

Remplissez le système d’un tampon alcalin contenant un colorant anionique bleu et connectez-le à l’alimentation électrique. À un pH alcalin, les molécules de colorant se lient au complexe protéique, lui conférant une charge négative globale sans se dénaturer. Ce complexe protéique intact chargé négativement migre à travers le gel sous la forme d’une bande bleue.

Après une course minimale, et en laissant la protéine intacte migrer dans le gel de résolution, exciser la bandelette contenant le complexe. Incuber la bandelette dans une solution contenant un agent de réticulation pour permettre à ses groupes réactifs d’interagir avec les groupes amines de la protéine proximale, stabilisant ainsi le complexe multimérique.

Remplacez la solution de réticulation par un réactif d’extinction pour calmer l’activité des agents de réticulation n’ayant pas réagi. Ajoutez du SDS - un détergent anionique - qui confère une charge négative uniforme au complexe protéique intact tout en préservant leur taille et leur composition natives.

Placez la bande traitée dans une cassette neuve et remoulez-la dans un nouveau gel SDS-PAGE. Au cours de l’électrophorèse, le complexe protéique réticulé chargé négativement migre vers l’anode positive et apparaît sous la forme d’une bande de poids moléculaire élevé dans le gel.

Pour commencer cette procédure, préparez-vous à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu, comme décrit dans le protocole de texte. Connectez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorèse les protéines dans le gel à 150 volts, jusqu’à ce que la bande de colorant progresse d’environ 2 centimètres dans la couche de résolution. À ce stade, arrêtez et débranchez l’alimentation électrique.

Après avoir démonté l’appareil d’électrophorèse, séparez les vitres de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d’empilement.

Coupez soigneusement le gel, juste en dessous du bord inférieur de la face du colorant, en prenant soin de rendre cette coupe aussi lisse et droite que possible. Ensuite, jetez le morceau de gel non utilisé. Coupez toutes les parties inutilisées le long des bords de la bande de gel.

Placez délicatement la bandelette dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans un petit récipient, et mélangez doucement par nutation pendant 30 minutes pour équilibrer. Après l’équilibrage, jetez et remplacez le PBS par 10 millilitres supplémentaires.

Pipette 500 microlitres de DSP de 25 millimolaires dissous dans du sulfoxyde de diméthyle dans le PBS et continuer à mélanger comme précédemment, pendant 30 minutes. Après 30 minutes, versez la solution DSP. Ajoutez 10 millilitres de Tris-HCl de 0,375 molaire, pH 8,8, contenant 2 % de dodécylsulfate de sodium, pour éteindre le DSP n’ayant pas réagi. Continuez la nutation pendant 15 minutes.

Pendant que la bande de gel est en train de tremper, préparer les solutions de gel SDS-PAGE selon les méthodes standard. N’ajoutez pas les réactifs de polymérisation. Après la trempe, remettez la bande de gel natif bleu à température ambiante et coulez-la dans une nouvelle cassette de gel.

Pour ce faire, prélevez soigneusement le gel et placez-le sur une plaque d’espacement propre de la cassette de gel. Orientez la bande de manière à ce qu’elle soit retournée par rapport à son orientation précédente et que le bas de la face avant du colorant soit le plus proche du haut de la nouvelle cassette.

Placez la bande de manière à ce que son bord supérieur se trouve au même niveau que le bord supérieur de la plaque de recouvrement. Assurez-vous que la face avant du colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre. Poussez un côté de la bande excisée contre l’une des parois de l’espaceur, en laissant de la place de l’autre côté pour que le gel soit versé et qu’un étalon ou une échelle de protéines soit chargé. Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones déchiquetées ou inégales, coupez-les soigneusement.

Une fois la bande de gel correctement positionnée, posez la plaque de recouvrement sur la plaque d’espacement. Appliquez une légère pression pour expulser les bulles d’air emprisonnées. Continuez à assembler l’appareil de coulée de gel, conformément aux instructions du fabricant.

La bande de gel se déplace parfois lorsque la plaque supérieure est placée. Il est utile de laisser la bande pendre un peu sur le bord de la plaque supérieure, de sorte qu’elle peut être ajustée avec une spatule pour corriger les éventuels décalages.

Ajoutez des réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution et versez-le dans la cassette de gel préparée à l’aide d’une pipette sérologique. Remplissez la cassette de gel à environ 2 centimètres sous la bande de gel PAGE native bleue excisée pour laisser de la place pour la couche d’empilement. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de butanol sur le dessus du gel versé et attendez 30 minutes pour la polymérisation de la couche de résolution avant de verser le butanol.

Ensuite, ajoutez les réactifs de polymérisation à la solution de gel d’empilement. À l’aide d’une pipette sérologique, versez la couche d’empilement pour remplir tous les espaces vides restants dans la cassette de gel. Inclinez la cassette de gel pendant que la couche d’empilement est versée, de sorte qu’elle remplisse l’espace sous la bande de gel et que les bulles d’air ne soient pas piégées.

Au fur et à mesure que le tampon de gel empilable remplit l’espace vide sous la bande de gel, remettez progressivement la cassette de gel au niveau. Continuez à remplir l’espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel empilable, jusqu’à ce qu’il déborde presque. Ensuite, laissez la couche d’empilement polymériser pendant 30 minutes.

Une fois la couche d’empilage polymérisée, retirez la cassette de gel de l’appareil de coulée, rincez-la à l’eau distillée et assemblez l’appareil d’électrophorèse, selon les instructions du fabricant.

Remplissez complètement la chambre intérieure avec 1X SDS-PAGE tampon de fonctionnement. Ensuite, remplissez la chambre extérieure au niveau indiqué par le fabricant. Chargez l’espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou l’étalon protéique approprié.

Fixez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorisez les échantillons à 120 volts. Lorsque le colorant Coomassie s’écoule du gel, arrêtez le cycle et débranchez l’alimentation électrique. Analysez le gel à l’aide de méthodes standard d’électrobuvardage et de détection des protéines à base d’anticorps.