Électrophorèse sur gel d’agarose d’amplicons d’ADN post-PCR : une méthode pour analyser les produits de la PCR multiplex et évaluer le succès de la réaction PCR

Pour analyser les amplicons d’ADN - des fragments d’ADN amplifiés de longueur spécifique - résultant de la réaction en chaîne par polymérase multiplexe, la PCR, en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose, assemble un plateau de coulée avec un peigne pour créer des puits pour le chargement des échantillons.

Versez une concentration appropriée d’agarose fondue, un polysaccharide linéaire, dissous dans un tampon d’électrophorèse, complété par un colorant d’ADN fluorescent, sur le plateau de coulée et laissez solidifier.

L’agarose fondue polymérise, formant un gel tridimensionnel avec des pores microscopiques.

Placez le gel coulé dans une cuve d’électrophorèse, le côté peigne orienté près de la cathode négative. Le réservoir contient le tampon d’électrophorèse utilisé dans la préparation du gel pour maintenir une conductivité optimale. Retirez le peigne.

Transférez l’échantillon de produit PCR, mélangé à une solution de colorant de chargement pour surveiller la migration de l’échantillon, dans les puits. Chargez un puits avec des échelles d’ADN de longueur définie. Amorcez l’électrophorèse.

Les amplicons d’ADN, avec des groupes phosphate négatifs régulièrement espacés, migrent des puits dans le gel vers l’anode positive et sont séparés en fonction de leur longueur en raison de la grande mobilité des amplicons plus courts que des plus grands. Simultanément, le colorant d’ADN fluorescent positif dans le gel migre dans le sens inverse et se combine avec les amplicons d’ADN, s’intercalant entre les bases.

Après l’électrophorèse, imagez le gel à l’aide de la lumière ultraviolette. Pour une PCR réussie, les amplicons d’ADN intercalés avec des colorants apparaissent sous la forme de bandes fluorescentes discrètes les plus proches de l’échelle de la longueur attendue des amplicons. Le rendement en amplicon peut être estimé à l’aide de l’intensité de fluorescence.

Selon les recommandations du fabricant, ajoutez de la poudre de gel d’agarose dans 1 tampon TBE pour atteindre 1,5 (poids/volume) pour cent, et chauffez pour dissoudre.

Avant de couler, inclinez brièvement la solution de gel dissous sous l’eau courante. Ajouter 5 microlitres de colorant d’acide nucléique fluorescent pour 50 microlitres de solution de gel et mélanger.

Assemblez et nivelez le plateau de coulée. Ajouter des peignes en fonction du nombre d’échantillons. Versez la solution de gel dans le plâtre et attendez qu’elle se solidifie.

Après cela, immergez le plâtre contenant le gel dans 1x tampon TBE dans un système d’électrophorèse sur gel. Mélangez 5 microlitres de produits PCR avec 2 microlitres de colorant de chargement dans de nouvelles bandelettes PCR. Transférez 5 microlitres des mélanges dans les puits du gel. Conservez au moins un puits vide. Ajoutez 5 microlitres d’échelle d’ADN dans le puits vide pour référence.

Branchez les électrodes et faites fonctionner le gel à 110 volts par 15 centimètres pendant environ 1 heure. Utilisez un système d’imagerie sur gel basé sur les UV pour vérifier la présence de plusieurs bandes représentant des amplicons PCR.