Essai de criblage de nématicides à petites molécules : une méthode à débit moyen pour cribler des nématicides potentiels contre Ditylenchus dipsaci

Les nématodes parasites des plantes tels que Ditylenchus dipsaci sont des vers microscopiques. Les vers vivants présentent des mouvements sinusoïdaux par le biais de contractions musculaires, et leur motilité est un déterminant important de leur santé dans des conditions de culture.

L’exposition aux nématicides - des substances chimiques toxiques - peut interférer avec les principaux processus biologiques, affectant la mobilité de ces nématodes cultivés, entraînant leur mort.

Pour cribler des nématicides à petites molécules, prenez une plaque multipuits contenant de l’eau distillée. À l’aide d’un outil d’épinglage propre, transférez les petits nématicides moléculaires potentiels de la plaque de stock de produits chimiques à la plaque de test pour assurer un transfert de quantités constantes de molécules dans chaque puits.

Distribuez un nombre égal de nématodes dans chaque puits de la plaque. Scellez les plaques tout en maintenant des conditions humides pour favoriser la survie et la mobilité des nématodes. Incuber la plaque en l’agitant légèrement pour éviter que les vers ne se déposent.

Pendant l’incubation, diverses petites molécules toxiques agissent sur les vers et les tuent, tandis que les non toxiques n’ont aucun impact. Observez la plaque à l’aide d’un microscope à dissection afin d’identifier les puits où la population de vers n’est pas mobile.

Compléter les plaques d’essai avec une solution d’hydroxyde de sodium - stimulant chimique final. Cela déclenche le mouvement de tous les vers au repos et les différencie des vers morts.

La présence de vers non mobiles après traitement à l’hydroxyde de sodium dans certains puits confirme l’efficacité des petites molécules correspondantes en tant que nématicides.

Pour préparer les plaques de dosage, versez de l’eau distillée autoclavée dans une auge stérile et distribuez 40 microlitres d’eau distillée de l’auge dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits avec une pipette multicanaux. Ajoutez des produits chimiques des plaques de stock de produits chimiques à 96 puits aux plaques de dosage, en les épinglant trois fois dans la plaque chimique. Ensuite, transférez les broches 10 fois dans la plaque de dosage. Épongez sur du papier devant la solution de nettoyage.

Pour compter le nombre de nématodes de la collection, il faut d’abord remettre la collection en suspension, puis pipeter 5 microlitres de la solution à l’aide d’embouts à faible rétention sur une lame. Comptez le nombre de nématodes en 5 microlitres à l’aide d’un microscope de dissection. Ensuite, ajustez la concentration à deux vers par microlitre en utilisant de l’eau distillée stérile.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon dans chaque puits des plaques de 96 puits avec une pipette multicanaux et une auge. Enveloppez les assiettes avec une serviette en papier humide et placez-les dans une boîte. Ensuite, ajoutez une serviette en papier humide supplémentaire pour stabiliser et assurer un mouvement minimal des plaques, et fixez-la sur un tampon collant dans un incubateur à secousses à 20 degrés Celsius réglé à 200 tr/min.

Observez les plaques le jour 5 sous un microscope à dissection. Compter le nombre de D. dipsaci mobiles et totaux dans les témoins de solvants DMSO et les puits traités par médicament.

Si les vers sont immobiles, ajoutez 2 microlitres d’hydroxyde de sodium à 1 molaire à une concentration finale de 40 millimolaires dans le puits pour stimuler le mouvement. Calculez la proportion de vers mobiles. Dans les tamis de D. dipsaci, les puits qui ont donné de manière reproductible 0 % de vers mobiles sont classés comme des coups forts.