Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

Les mitochondries absorbent le calcium cytosolique car il est essentiel à leur bon fonctionnement.

Un afflux excessif de calcium dans la matrice mitochondriale - surcharge calcique mitochondriale - déclenche l’ouverture d’un canal membranaire interne, le pore de transition de perméabilité mitochondriale, ou MPTP. Le pore ouvert permet une augmentation de l’efflux de calcium des mitochondries, provoquant un dysfonctionnement mitochondrial.

Pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial, commencez par une plaque multipuits contenant des mitochondries isolées en suspension dans un tampon approprié. Complétez le puits avec du pyruvate et du malate, qui sont des substrats producteurs d’ATP. Mélangez le contenu du puits et incuber.

Pendant l’incubation, le pyruvate et le malate sont convertis en ATP, dynamisant les mitochondries. Ajoutez une solution contenant des molécules de colorant fluorescent sensibles au calcium et imperméables à la membrane mitochondriale. Distribuez le tampon contenant du calcium aux mitochondries énergisées.

Surveillez la fluorescence calcique du colorant pendant que les molécules de colorant se lient au calcium libre dans le tampon.

Ajoutez plus d’ions calcium pour initier l’afflux de calcium mitochondrial. L’augmentation progressive du calcium mitochondrial diminue les ions calcium dans le tampon, réduisant ainsi la fluorescence calcique du colorant.

Une fois que les mitochondries atteignent leur capacité maximale de transport de calcium, l’ajout supplémentaire d’ions calcium ouvre les canaux MPTP et importe du calcium dans le tampon. Le calcium tampon se lie aux molécules de colorant, provoquant une augmentation de la fluorescence du calcium du colorant.

Tracez la fluorescence du colorant à différents moments de l’ajout de calcium pour surveiller la cinétique de l’absorption du calcium mitochondrial.

Pour commencer la mesure de l’absorption du calcium mitochondrial à l’aide d’un lecteur de plaques, programmez le lecteur pour qu’il effectue une lecture cinétique de la fluorescence du vert de calcium-5N toutes les secondes, pendant une durée totale de 1 000 secondes.

Programmez les injecteurs de réactifs pour distribuer 5 microlitres de solution de chlorure de calcium à différents moments. Ensuite, amorcez les injecteurs avec la solution de chlorure de calcium qui sera utilisée.

Ensuite, ajoutez 200 microgrammes de mitochondries isolées dans un puits d’une plaque de 96 puits et ajoutez le volume approprié de tampon de chlorure de potassium pour obtenir un volume total de 197 microlitres. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de pyruvate 1 molaire, 1 microlitre de malate de 500 millimolaires et 1 microlitre de 1 millimolaire de vert de calcium-5N, et mélangez doucement par pipetage.

Incuber à l’abri de la lumière à température ambiante pendant 2 minutes, pour que les mitochondries se dynamisent. Enfin, démarrez le protocole cinétique préprogrammé et surveillez la fluorescence du vert de calcium-5N.