Détermination de la capacité de rétention calcique des mitochondries isolées

Placez les mitochondries isolées des cellules du neuroblastome dans un tampon contenant un colorant fluorescent imperméable à la membrane et liant le calcium.

Incuber pour permettre aux mitochondries de se stabiliser dans le tampon.

Ajouter un tampon contenant du calcium et incuber en secouant.

Les ions calcium se lient aux molécules de colorant, provoquant leur fluorescence.

À l’aide d’un spectromètre de fluorescence, surveillez la fluorescence du colorant en temps réel.

Maintenant, injectez un tampon contenant du calcium à intervalles réguliers.

L’augmentation de la concentration de calcium favorise l’absorption du calcium mitochondrial, réduisant les ions calcium libres disponibles pour se lier au colorant, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence.

Une fois que les mitochondries atteignent leur capacité maximale de stockage de calcium, un ajout supplémentaire de calcium déclenche l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP).

Cette ouverture des pores libère le calcium des mitochondries dans le tampon, où il se lie au colorant et provoque une fluorescence accrue.

Déterminez la quantité totale de calcium nécessaire pour induire l’ouverture du mPTP, qui reflète la capacité de rétention du calcium mitochondrial.

Préparez le milieu de chlorure de potassium et ajoutez le colorant fluorescent vert liant le calcium à une concentration finale de 0,5 micromolaire avant l’expérience. Pour déterminer la capacité de rétention du calcium mitochondrial, transférez d’abord 1 millilitre de mitochondries isolées dans un milieu de chlorure de potassium contenant 0,5 colorant fluorescent vert de liaison au calcium micromolaire dans chaque puits d’une plaque à 6 puits.

Incuber les mitochondries dans le colorant fluorescent vert liant le calcium dans la plaque à 6 puits à température ambiante. Protégez-le de la lumière ambiante pendant 1 minute. Après l’incubation, ajoutez 4 aliquotes d’un microlitre d’une solution de chlorure de calcium de 20 millimolaires dans chaque puits de la plaque à 6 puits, en utilisant le réglage de distribution automatique pour introduire 200 nanomoles de calcium par milligramme de protéine mitochondriale.

Utilisez un spectromètre fluorescent pour surveiller les changements de fluorescence toutes les trois secondes pendant 2 minutes, avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 531 nanomètres. La plaque est équipée d’une agitation à 600 tr/min pendant 3 secondes entre les lectures, contrôlée par un logiciel. Ajoutez une aliquote supplémentaire de 4 microlitres de solution de chlorure de calcium de 20 millimolaires dans chaque puits, puis surveillez les changements de fluorescence toutes les 3 secondes pendant 2 minutes.