PCR numérique sur puce pour détecter des variants de transcrits rares à l’aide d’une puce nanofluidique

La technique de PCR numérique basée sur une puce partitionne une seule réaction dans les chambres d’une puce nanofluidique. L’amplification des séquences partitionnées permet de détecter des variantes de transcrits rares - des transcrits non canoniques se produisant à basse fréquence.

Pour commencer, prélevez un échantillon contenant de l’ADNc du variant de transcrit rare cible et du variant commun. Ajoutez une solution contenant de l’ADN polymérase thermostable, des dNTP et des amorces.

Ajoutez des sondes oligonucléotidiques spécifiques aux variants de transcrits communs et rares, marquées avec différents rapporteurs fluorescents et molécules d’extinction. Le quencher absorbe la fluorescence du rapporteur lorsqu’il est à proximité.

Chargez le mélange sur la puce nanofluidique. La solution est divisée en nano-chambres de taille uniforme. Chaque chambre contenant un ADNc sert de récipient de réaction indépendant.

Démarrez le processus de cycle thermique. Une température de dénaturation élevée sépare l’ADN double brin en brins simples. Abaissez la température, ce qui permet aux amorces et aux sondes oligonucléotidiques de se recuire aux régions complémentaires sur les brins d’ADN uniques.

Augmentez la température pour atteindre l’étape d’extension, où l’ADN polymérase étend l’amorce et clive la sonde. La distance par rapport à l’extincteur permet l’émission de fluorescence du journaliste. Lire le signal de fluorescence.

Créez un nuage de points représentant les chambres avec la cible de transcription rare amplifiée et les chambres dépourvues de la cible. Des signaux positifs pour la cible indiquent la présence de la variante de transcrit rare dans l’échantillon.

Pour commencer, laissez le mélange principal et le test décongeler à température ambiante pendant au moins 20 minutes. Ensuite, chargez des tubes de 0,5 millilitre avec des aliquotes de 6 microlitres d’échantillons d’ADNc. Fabriquez également un tube de contrôle sans modèle. Ensuite, faites tourbillonner doucement le mélange principal et aliquote 8,7 microlitres par réaction dans un tube stérile.

Ensuite, pour chaque réaction, ajoutez 0,87 microlitre d’amorce de dosage personnalisé et ajoutez 1,83 microlitre d’eau sans nucléase. Mélangez doucement la combinaison et transférez 11,4 microlitres dans chaque tube contenant de l’ADNc, et dans le témoin sans matrice. Ensuite, mélangez doucement les tubes et regroupez le contenu des tubes à l’aide de la centrifugation pulsée. Pour un résultat optimal, chargez les puces dès que possible.

Branchez le chargeur de copeaux et attendez que le voyant devienne vert. Ensuite, préparez la seringue de liquide d’immersion en tirant doucement le piston à 1 à 2 millimètres, puis, retirez le capuchon et ajoutez l’embout.

Ensuite, notez le code écrit sur le couvercle d’une nouvelle puce, puis, tenez soigneusement le couvercle sur le côté, décollez le film protecteur et positionnez-le dans le nid du couvercle avec le côté collant vers le haut. Maintenant, appuyez sur le levier pour ouvrir la pince et chargez soigneusement la puce dans le nid de copeaux.

Ensuite, mettez une nouvelle lame de chargement dans le chargeur. Poussez-le doucement pour vous assurer qu’il est bien en place. Maintenant, transférez 14,5 microlitres de mélange réactionnel sur la lame de chargement. Ne faites pas de bulles d’air et ne déviez pas la lame. Ensuite, appuyez sur le bouton noir « Loading » pour répartir le volume sur la puce.

Il est important de confirmer que la lame de chargement est en place. Ensuite, pendant le remplissage de la lame, n’enfoncez pas la pipette jusqu’au deuxième arrêt pour éviter d’introduire des bulles. De plus, ne déviez pas la lame avec la pointe.

À l’aide de la seringue, transférez environ 20 gouttes de liquide d’immersion sur la surface de la puce. Veillez à ne pas toucher la surface avec la pointe, et couvrez complètement la surface sans la faire déborder. Ensuite, tournez le bras du rotor pour que le couvercle entre en contact avec la puce et appuyez pendant 15 secondes. Ensuite, appuyez sur le bouton du couvercle pour libérer la puce et remettre le bras du chargeur dans sa position de repos. Maintenant, ouvrez la pince et tenez la puce assemblée à un angle de 45 degrés pour distribuer soigneusement le fluide d’immersion à travers l’orifice de remplissage à l’aide d’une seringue. Ensuite, tournez légèrement la puce pour éliminer les bulles d’air, puis retirez tout excès de liquide avec la lingette stérile.

Évitez de renverser du liquide d’immersion sur le bord de la pointe. Si cela se produit, retirez soigneusement l’excédent avant de sceller.

Enfin, scellez le boîtier à puces en décollant doucement l’étiquette sur le couvercle, puis en bloquant l’orifice de remplissage pendant au moins 5 secondes. Maintenant, utilisez la puce dans les deux heures et, d’ici là, stockez-la dans l’obscurité.

Pour configurer la réaction, ouvrez le couvercle et installez les adaptateurs sur les deux blocs, même lorsqu’un seul bloc est utilisé. Ensuite, placez une puce sur les blocs d’échantillon et orientez ses orifices de remplissage vers l’avant du thermocycleur et élevez légèrement l’orifice. Utilisez des jetons vides pour équilibrer les deux blocs.

Ensuite, posez le tampon thermique sur la configuration pour couvrir complètement les puces. Ensuite, programmez les cycles, fermez le couvercle et démarrez la réaction.

Lorsque la réaction est terminée, éteignez le thermocycleur, retirez les coussinets thermiques, puis retirez les copeaux. Laissez les chips décongeler à température ambiante pendant au moins 10 minutes dans l’obscurité et analysez-les dans l’heure. Nettoyez la surface de la puce avec de l’isopropanol tout en l’inspectant pour détecter les fuites ou autres problèmes.

Pour enregistrer les données, insérez une clé USB dans le système de détection où les données peuvent être enregistrées. Ensuite, ouvrez le plateau de copeaux du système de détection et chargez la puce face vers le haut. Fermez le bac et attendez 30 secondes que les données soient traitées. Ensuite, retirez la puce et répétez le processus pour la puce suivante.

Ensuite, déplacez la clé USB du détecteur vers un ordinateur et transférez les fichiers. Ouvrez le logiciel basé sur le cloud, puis créez un projet et importez tous les fichiers de données pour les puces qui vous intéressent. Ensuite, sous l’onglet « Puces définies », sélectionnez le colorant et le dosage utilisés. Déterminez si la puce est acceptable en la visualisant dans l’onglet « Examiner les données ». Si l’échantillon a été bien chargé, au moins 13 000 points doivent être utilisables.

Ensuite, regardez le nuage de points de la puce sélectionnée. Là, appliquez un seuil défini par le type de test. Pour le signal de colorant rapporteur de fluorescéine amidite, utilisez un seuil de 6 000. Maintenant, supprimez tous les signaux douteux qui pourraient entraîner des faux positifs. Sélectionnez l’endroit douteux sur le nuage de points à l’aide de l’outil « Lasso » et sélectionnez l’option « Indéterminé ».

Tous les points positifs restants indiquent la présence de copies d’ADNc de la cible rare analysée.