Quantification de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Les stimulateurs externes activent les cellules et induisent une protrusion membranaire circulaire tridimensionnelle, ou formation de volants membranaires, essentielle pour diverses activités cellulaires.

Pour visualiser la formation de volants de membrane, commencez par une plaque multi-puits contenant une lamelle à la base. Le sommet de la lamelle a des macrophages cultivés.

Traitez ces macrophages avec des molécules stimulatrices qui activent les cellules, facilitant la réorganisation du cytosquelette et la formation de protrusions membranaires. Superposez les cellules avec une solution fixatrice, en réticulant les protéines et en préservant la structure cellulaire.

Traitez les macrophages fixes avec des concentrations d’alcool croissantes pour une déshydratation complète. Desséchez ces macrophages à l’aide d’un sécheur à point critique, en éliminant toute trace d’eau pour une meilleure imagerie.

Montez la lamelle sur un porte-échantillon de microscopie électronique à balayage, ou MEB, à l’aide d’un ruban conducteur. Recouvrez la lamelle contenant des macrophages d’une fine couche métallique, assurant une bonne conductivité électronique pendant l’imagerie.

Placez la lamelle dans la chambre MEB. Focalisez le faisceau d’électrons sur la lamelle. Le faisceau d’électrons frappe la membrane du macrophage recouvert de métal, provoquant la génération d’électrons secondaires de faible énergie à partir de la surface de la membrane.

Les protubérances tridimensionnelles dispersent les électrons différemment du reste de la membrane, mettant en évidence ces caractéristiques à la surface de la cellule. Le détecteur collecte les électrons diffusés à partir de diverses régions de la surface cellulaire, générant une image de contraste.

Dans l’image MEB, les macrophages apparaissent plus foncés avec des protubérances circulaires brillantes à la surface, confirmant la formation de volants.

Commencez par placer des lamelles en verre stérile dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pince autoclave. Ensuite, ensemencez les macrophages RAW 264.7 sur les lamelles à une densité de 10^{à 6} cellules par millilitre, et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, remplacez le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu complet frais, puis prétraitez les macrophages pendant 30 minutes avec un véhicule témoin tel que le DMSO ou un inhibiteur de macropinocytose tel que l’EIPA. Ensuite, pour favoriser l’ébouriffement de la membrane, traitez les cellules pendant 30 minutes avec des stimulateurs de macropinocytose, tels qu’une solution de PMA à 1 micromolaire ou 100 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages.

Pour fixer les cellules pour la microscopie électronique à balayage, aspirez le média des puits et lavez les lamelles deux fois avec du PBS glacé. Ensuite, incubez les lamelles dans un fixateur pendant 30 minutes à température ambiante, suivies d’une nuit d’incubation à 4 degrés Celsius.

Le lendemain, sans perturber la monocouche cellulaire, lavez doucement, puis incubez les lamelles dans 500 microlitres de cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant 15 minutes. Après deux lavages avec 500 microlitres d’eau distillée, lavez les lamelles deux fois dans 500 microlitres d’une série d’éthanol gradué avec une incubation de 10 minutes à chaque lavage.

Pour effectuer le séchage du point critique, placez les lamelles dans un séchoir à point critique et couvrez-les avec de l’éthanol à 100 %, puis appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de dioxyde de carbone. Appuyez sur le bouton Cool pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que la température descende à 0 degré Celsius. Ensuite, appuyez sur le bouton Remplir jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre.

Ensuite, appuyez sur le bouton Purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol provenant de l’échappement de purge disparaisse. Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton Cool, jusqu’à ce que la température descende à 0 degré Celsius. Appuyez à nouveau sur les boutons Remplir et Purger pour les désactiver. Ensuite, fermez le réservoir de dioxyde de carbone. Appuyez à nouveau sur le bouton Cool pour l’éteindre, puis appuyez sur le bouton Heat. Réglez la température à 42 degrés Celsius et la pression à 1 200 livres par pouce carré.

Une fois que la pression et la température se stabilisent, appuyez sur le bouton Bleed pour permettre à la pression de diminuer lentement. Une fois que la pression de la chambre atteint 150 livres par pouce carré, appuyez sur le bouton Vent et attendez que la pression descende à 0 livre par pouce carré. Éteignez le sécheur Critical Point et retirez les lamelles.

Ensuite, à l’aide de languettes adhésives au carbone, montez les lamelles sur les supports d’échantillons en aluminium pour la microscopie électronique à balayage. Ensuite, procédez au revêtement par pulvérisation cathodique à l’aide d’or ou de palladium dans une coucheuse par pulvérisation.

Allumez le bouton d’alimentation de l’enduiseur par pulvérisation. Une fois que le vide a atteint 30 millitorrs, rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz fin dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Une fois que le vide atteint 200 millitorrs, éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 millitorrs, puis rincez à nouveau la chambre pour éliminer l’humidité et l’air comme indiqué. Après avoir rincé la chambre trois fois, appuyez sur le bouton de la minuterie et ajustez le bouton de tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 milliampères. Ensuite, retirez les lamelles revêtues de la chambre.

Pour visualiser et quantifier les volants de la membrane, insérez les lamelles de l’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage. Fermez la porte et appuyez sur le bouton Evac. Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la tension d’accélération sur 15 kilovolts et la distance de travail sur 10 millimètres. Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous dans le contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation. Réglez le grossissement sur 3500x et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo.