Détection de la liaison de la vitronectine aux surfaces bactériennes à l’aide de la cytométrie en flux

Prenez des tubes de cytomètre en flux contenant des souches sauvages et mutantes d’Haemophilus influenzae, type f.

Pipette un tampon contenant des protéines bloquantes et de la vitronectine. Couver.

Les protéines bloquantes réduisent les interactions non spécifiques à la surface bactérienne, tandis que les molécules de vitronectine se lient à la protéine H, une protéine de liaison à la vitronectine, sur les surfaces bactériennes de type sauvage. Dans la souche mutante, la vitronectine ne se lie pas en raison de l’absence de protéine H.

centrifugeuse. Retirez la vitronectine non liée et les protéines bloquantes.

Ajoutez un tampon contenant des anticorps anti-vitronectine primaires, qui se lient spécifiquement à la vitronectine attachée aux surfaces bactériennes de type sauvage.

Ensuite, introduisez des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores, qui se lient aux anticorps primaires de la vitronectine et facilitent la détection de la vitronectine.

centrifugeuse. Retirer les anticorps secondaires non liés. Remettez les bactéries en suspension dans le tampon.

Effectuez une cytométrie en flux pour déterminer la liaison de la vitronectine à la surface bactérienne.

Comparez les signaux de fluorescence de souches de type sauvage et mutantes. Un changement dans le signal de fluorescence chez les bactéries de type sauvage confirme la liaison de la vitronectine à la surface bactérienne.

Pour se préparer à la cytométrie en flux, remettez en suspension les pastilles bactériennes avec 50 microlitres de tampon de blocage contenant 250 nanomolaires de vitronectine. Ensuite, incubez les échantillons pendant 1 heure à température ambiante sans agiter. Après l’incubation, granulez les bactéries par centrifugation à 3 500 x g pendant 5 minutes. Ensuite, lavez les granulés trois fois à l’aide de PBS et d’étapes de centrifugation similaires.

Après le lavage, ajouter 50 microlitres d’anticorps polyclonaux primaires anti-vitronectine humaine de mouton à la pastille bactérienne, à une dilution de 1 à 100 dans PBS/BSA. Incuber la suspension pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, lavez les bactéries trois fois avec du PBS pour éliminer les anticorps non liés.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de PBS/BSA contenant des anticorps polyclonaux anti-moutons conjugués à la fluorescéine isothiocyanate d’âne à la pastille. Incuber à température ambiante pendant 1 heure dans l’obscurité. Enfin, après trois étapes de lavage, remettre en suspension la pastille bactérienne avec 300 microlitres de PBS, et analyser par cytométrie en flux.