La technique de photoconversion pour explorer la dynamique cellulaire inflammatoire dans les pupes d’insectes

Commencez par une boîte à fond de verre contenant des pupes de drosophile transgéniques portant un épithélium blessé marqué avec leurs protéines de surface cellulaire présentant une fluorescence verte.

Les cellules immunitaires des pupes - ou hémocytes - expriment des fluorophores verts photoconvertibles dans le cytoplasme et des protéines fluorescentes rouges dans le noyau, facilitant le suivi cellulaire.

Les cellules blessées libèrent des chimioattractants – ou molécules inflammatoires, attirant les hémocytes vers le site blessé.

La microscopie confocale révèle la zone blessée encerclée par des cellules épithéliales vertes.

Au cours de la cicatrisation, les hémocytes verts avec des noyaux rouges près de la plaie étendent les protubérances membranaires - filopodes et lamellipodes - et migrent vers la zone blessée.

Au fil du temps, à mesure que le chimioattractant se diffuse, des hémocytes distants migrent vers la plaie, créant une onde cellulaire immunitaire.

Illuminez la sous-population d’hémocytes migrateurs avec une longueur d’onde de 405 nanomètres. Cela convertit de manière irréversible le fluorophore photoconvertible des hémocytes du vert au rouge.

Ces hémocytes photoconvertis réparent l’épithélium blessé et s’éloignent du site de la plaie, différenciant les hémocytes photoconvertis des hémocytes non photoconvertis et élucidant la dynamique cellulaire inflammatoire.

Après avoir blessé les bords de l’aile de la pupille, transférez rapidement la boîte à fond de verre dans un microscope approprié pour l’imagerie en accéléré. Ensuite, ouvrez le logiciel de capture d’image approprié.

Dans le logiciel, allumez les lasers appropriés et ajustez leur puissance et leur décalage de gain pour obtenir suffisamment de signal fluorescent sans saturation des pixels. En général, la puissance laser la plus faible possible, comprise entre 5 % et 20 %, est la meilleure pour minimiser le photoblanchiment.

Concentrez-vous sur l’ensemble de l’aile pupille sous un faible grossissement ou concentrez-vous sur la plaie sous un fort grossissement pour étudier la réparation de la plaie. Pour capturer à la fois l’épithélium réparateur et le recrutement des cellules inflammatoires, réglez d’abord le microscope pour qu’il enregistre une pile z à l’aide du réglage de la mise au point fine sur le panneau de commande. Balayage de l’épithélium blessé jusqu’à l’espace extracellulaire situé en dessous, contenant les hémocytes migrateurs.

Ensuite, réglez le logiciel pour qu’il enregistre les coupes z à travers l’aile pupillaire tous les 3 microns ou à des intervalles encore plus serrés. Pour l’imagerie en accéléré, enregistrez les piles z au moins toutes les 30 secondes pendant au moins une heure.

Lorsque vous utilisez les sondes photoconvertibles pour photoconvertir et étiqueter sélectivement un sous-ensemble de cellules pendant l’imagerie, ouvrez les modules appropriés dans le logiciel d’imagerie pour effectuer la photoconversion et activer le laser de 405 nanomètres. Ensuite, sélectionnez les cellules à photo-convertir dans le logiciel FRAP à l’aide d’un outil de sélection.

Ensuite, réglez le temps de conversion de photos sur une seule itération d’image et réglez le laser de 405 nanomètres sur une puissance laser de 20 %, puis cliquez sur Démarrer l’expérience pour effectuer la conversion de photos. Une fois l’opération terminée, quittez le module FRAP et revenez à l’écran d’imagerie d’origine. Là, réglez les lasers sur les fluorophores utilisés et imagez les cellules photoconverties et non photoconverties à l’aide d’enregistrements en accéléré.