Procédé d’immunoprécipitation de réticulation amélioré pour l’identification efficace de l’ARN lié aux protéines dans les testicules de souris

Prenez un testicule de souris fraîchement récolté dans un tampon réfrigéré. Retirez la tunique albuginée, la couche de tissu fibreux.

Triturer le testicule pour libérer les tubes séminifères contenant des cellules germinales et des cellules de Sertoli.

Ajouter un tampon et soumettre les tubules à un rayonnement UV pour une réticulation irréversible de l’ARN avec les protéines associées, préservant ainsi les interactions.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettre les tubules en suspension dans un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de RNase et de protéase.

Sonicer le tissu, libérant des complexes protéine-ARN et d’autres composants intracellulaires. Les inhibiteurs de la RNase et de la protéase inactivent les RNases et les protéases endogènes.

Ajoutez de la DNase pour dégrader l’ADN. Introduire la RNase diluée pour la digestion partielle de l’ARN.

Centrifuger et transférer le surnageant contenant des complexes ARN-protéines dans une solution de billes magnétiques enrobée d’anticorps avec une spécificité élevée par rapport à la protéine de liaison à l’ARN cible.

Appliquez un champ magnétique pour séparer les complexes protéine-ARN liés aux billes. Jetez le surnageant.

Laver avec un tampon. Séparez magnétiquement les complexes protéine-ARN et utilisez-les pour une analyse plus approfondie de l’interaction ARN-protéine.

Pour commencer cette procédure, prélevez environ 100 milligrammes de testicules sur des souris de l’âge approprié pour chaque expérience d’immunoprécipitation. Placez les mouchoirs dans du PBS glacé. À l’aide d’une pince à épiler à pointe fine, retirez délicatement la tunique albuginée. Ajoutez 3 millilitres de PBS glacé dans un broyeur à mouchoirs et utilisez un pilon en verre lâche pour triturer le tissu par une légère force mécanique. Ensuite, transférez la suspension tissulaire dans une boîte de culture cellulaire et ajoutez du PBS glacé jusqu’à 6 millilitres. Secouez rapidement l’assiette pour que le liquide recouvre uniformément le fond du plat.

Réticuler la suspension sur la glace trois fois avec 400 millijoules par centimètre carré à 254 nanomètres. Assurez-vous de mélanger la suspension entre chaque irradiation, puis recueillez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 1 200 fois g et à 4 degrés pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de PBS. Après cela, transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Centrifugez à 1 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant deux minutes et jetez le surnageant.

Tout d’abord, ajoutez 125 microlitres de billes magnétiques de protéine A par échantillon dans un tube à centrifuger frais. Placez le tube sur l’aimant pour séparer les billes de la solution. Après 10 secondes, retirez le surnageant et lavez les billes deux fois avec 1 millilitre de tampon de lyse glacé. Remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon de lyse froide avec 10 microgrammes d’anticorps eCLIP. Faites pivoter les tubes à température ambiante pendant 45 minutes, puis lavez les billes deux fois avec 1 millilitre de tampon de lyse glacé.

Pour commencer, mettez les granules tissulaires en suspension dans 1 millilitre de tampon de lyse froide contenant 22 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéines 50X sans EDTA et 11 microlitres d’inhibiteur d’ARNase. Continuez à lyser les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes. Sonicate chaque échantillon est décrit dans le protocole texte. Ensuite, ajoutez 4 microlitres de DNAse dans chaque tube et mélangez bien. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes tout en secouant à 1 200 tr/min. Après cela, ajoutez 10 microlitres d’ARNASE diluée et mélangez bien. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes en secouant à 1 200 tr/min.

Ensuite, centrifugez à 15 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes pour éliminer le lysat. Récupérez soigneusement le surnageant. Tout d’abord, ajoutez 1 millilitre de lysat aux billes préparées et faites pivoter les échantillons à 4 degrés Celsius pendant deux heures ou toute la nuit. Après cela, récupérez les perles avec le support magnétique et jetez le surnageant. Lavez les perles deux fois avec 900 microlitres de tampon à haute teneur en sel, puis lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon de lavage.