Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine

L’objectif global de cette procédure d’immunoprécipitation de la chromatine est d’évaluer la liaison induite par le TGF bêta 1 du facteur de transcription SMAD2 aux éléments de liaison SMAD dans le promoteur du kit C. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire telles que la transcription génique induite par les cytokines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a le potentiel de démontrer la liaison directe des facteurs de transcription et d’autres protéines régulatrices de la transcription à leurs sites de liaison à l’ADN in vivo.

Cultivez les cellules à une confluence comprise entre 70 et 80 % sur des plaques de culture tissulaire de dix centimètres. Stimuler les cellules selon les objectifs expérimentaux. Retirez le milieu de culture tissulaire et ajoutez cinq millilitres de solution de fixation.

Ensuite, incubez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante sur une plate-forme vibrante. Retirez la solution de fixation et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de glace un X PBS. Retirez le PBS X et ajoutez cinq millilitres de solution de glycine stop fix.

Après avoir incubé les cellules pendant cinq minutes à température ambiante sur une plate-forme agitante, retirez la solution de fixation de glycine et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de glace un X PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez deux millilitres de solution de grattage cellulaire et récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Ensuite, transférez les cellules récoltées dans un tube conique sur de la glace.

Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 600 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’un tampon de lyse cellulaire X et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Une fois que la pastille est remise en suspension dans le tampon de lyse cellulaire, transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Dounce glacé et donnez 10 coups à l’aide d’un pilon de type B pour la rupture cellulaire.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation et centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 2 400 fois G et quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 350 microlitres de tampon de digestion des noyaux. Après avoir incubé les échantillons pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez des nucléases micrococciques et mélangez par vortex.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant cinq à 20 minutes, en mélangeant les échantillons toutes les deux minutes par inversion. Le temps dans une certaine concentration, si vous êtes entre des lignées cellulaires, il peut être nécessaire d’être optimisé en cas de cisaillement enzymatique sous-optimal. Une procédure de cisaillement alternative utilisant du sonicare disponible dans le commerce peut être trouvée dans le protocole de texte.

Après l’incubation avec la nucléase micrococcique, ajoutez sept microlitres d’EDTA froid glacé à 0,5 molaire pour arrêter la réaction. Centrifugez les échantillons avec l’ADN cisaillé pendant 10 minutes à 16, 200 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez l’ADN cisaillé contenant du surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Aliquote 50 microlitres dans un tube de microcentrifugation séparé, pour confirmer le cisaillement réussi de l’ADN comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez immédiatement le volume restant pour l’immunoprécipitation ou stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Combinez 10 à 25 microgrammes de chromatine réticulée cisaillée avec 25 microlitres de billes magnétiques de protéine G de qualité immunoprécipitation de la chromatine.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon de dilution d’immunoprécipitation et un microlitre de cocktail d’inhibiteur de protéase. Après quatre heures d’incubation, ajoutez un à 10 microgrammes d’anticorps dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Et ajoutez de l’eau distillée à un volume final de 100 microlitres.

Incuber les échantillons sur un rotateur de bout en bout pendant quatre à 12 heures à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, placez les tubes sur un support magnétique. Une fois que les billes magnétiques s’agrègent sur le côté du tube, retirez et jetez soigneusement le surnageant.

Lavez les perles trois fois avec 800 microlitres de tampon de lavage. Pour chaque lavage, mélangez les billes en inversant le tube plusieurs fois. Ensuite, placez le tube sur le support magnétique et retirez soigneusement le tampon de lavage une fois que les billes magnétiques s’agrègent sur le côté du tube.

Ensuite, lavez les perles une fois avec 800 microlitres de tampon de lavage deux en utilisant la même procédure. Après les lavages, remettre les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon d’élution et incuber les échantillons sur un rotateur de bout en bout pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube frais à l’aide du support magnétique.

Ajoutez six microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires pour inverser la réticulation, suivis de deux microlitres de protéinase K. Après avoir mélangé les échantillons, incubez-les pendant deux heures à 65 degrés Celsius. À ce stade, les échantillons peuvent être analysés directement pour les sites de liaison aux protéines, comme décrit dans le protocole textuel, ou peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius. Pour confirmer la liaison de SMAD2 induite par le TGF bêta 1 au promoteur SCF, le test d’immunoprécipitation de la chromatine a été effectué.

Le traitement par TGF bêta-1 a entraîné la liaison de SMAD2 au promoteur SCF dans les lignées de cancer du foie humain, HepG2 et Hep3B. En l’absence de stimulation par le TGF bêta-1, aucune liaison SMAD n’a été notée. En tant que témoin positif, pour l’activation de SMAD induite par le TGF bêta-1, une immunoprécipitation de la chromatine pour PAI-1 a été effectuée.

Le promoteur PAI-1 est une cible connue du TGF bêta et du SMAD. La spécificité de l’immunoprécipitation SMAD2 a été confirmée par l’utilisation d’anticorps IgG non spécifiques. Aucune liaison de SMAD2 à l’EBS n’a été notée après immunoprécipitation avec des IgG.

Pour confirmer la liaison de STAT3 au gène du ligand bêta du TGF bêta induite par le TGF bêta-1, des tests d’immunoprécipitation de la chromatine ont été effectués à l’aide de cellules HepG2 et Hep3B traitées au TGF bêta 1. Le traitement au TGF bêta 1 a entraîné la liaison de STAT3 au deuxième site de liaison STAT3 présumé du gène TGF bêta, mais pas au premier. Dans cet exemple, la liaison positive de STAT3 à STB-2 sert de contrôle positif interne.

Comme pour l’autre expérience d’immunoprécipitation de la chromatine, la liaison de STAT3 au ST-2 n’a pas été observée après l’immunoprécipitation à l’aide d’IgG. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en un ou deux jours selon l’anticorps si elle est réalisée correctement. Lors de cette procédure, il est important de suivre les directives de sécurité du laboratoire et d’être très précis à chaque étape du protocole.

Des précautions telles que la vérification des fiches signalétiques et le port d’un équipement de protection tel que des gants, une blouse blanche et des lunettes de sécurité doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la liaison des protéines aux séquences spécifiques de liaison à l’ADN. En suivant ce protocole, d’autres méthodes telles que les tests de promoteur peuvent être effectuées afin de confirmer la pertinence fonctionnelle de la liaison à l’ADN des protéines démontrée par l’immunoprécipitation de la chromatine.