Une technologie de microréseau peptidique pour le profilage de spécificité des anticorps

Prenez une lame de microréseau contenant des peptides d’histones avec des modifications post-traductionnelles cibles et non cibles ou PTM.

Les peptides sont immobilisés via la biotine conjuguée à des endroits spécifiques de la lame de verre fonctionnalisée par la streptavidine.

Les taches contiennent également un fluorophore vert immobilisé conjugué à la biotine, facilitant l’identification des taches.

Introduire un tampon de blocage, empêchant l’interaction d’anticorps non spécifiques.

Retirez le tampon et centrifugez-le pour sécher la lame.

À l’intérieur d’une imprimante à cire, bordez le réseau avec de la cire.

Équilibrez le réseau à l’aide d’un tampon d’hybridation.

Incuber avec les anticorps primaires spécifiques d’un PTM cible.

Introduire des anticorps secondaires conjugués au fluorophore rouge qui se lient aux anticorps primaires.

Retirez les anticorps non liés et centrifugez pour sécher la lame.

Imagez la lame à l’aide d’un scanner à microréseaux. La fluorescence verte aide à identifier les taches, tandis que la fluorescence rouge indique l’interaction PTM-anticorps, démontrant la spécificité de l’anticorps.

La reconnaissance du PTM cible démontre la spécificité de l’anticorps, tandis que la reconnaissance des PTM non cibles indique une réactivité croisée des anticorps.

Guidés par la carte de la plaque source, chargez 1 à 2 microlitres de chaque caractéristique peptidique dans les puits désignés d’une ou plusieurs plaques de petit volume de 384 puits. Diluez chaque caractéristique dix fois avec 1 tampon d’impression de microréseau de protéines, complété par 1 % d’albumine sérique bovine et 5 microgrammes par microlitre de biotine marquée à la fluorescéine. Ensuite, centrifugez les plaques à 500 fois g à température ambiante pendant 2 minutes. Ensuite, videz le conteneur à déchets de l’imprimante à microarray. Remplissez la solution de lavage dans des récipients d’humidificateur avec de l’eau distillée stérile. Entrez les paramètres de la diapositive de la matrice dans le logiciel de l’imprimante de la puce.

Réglez la procédure de lavage sur un lavage de 1 seconde avec une seule immersion, le post-lavage pour tremper les goupilles cinq fois et l’humidité à 60 %. Ensuite, insérez des lames de verre recouvertes de streptavidine dans les plateaux du substrat. Chargez les plateaux dans l’élévateur de plateau. Insérez les plaques sources dans les supports de plaques et chargez les supports dans l’élévateur de plaques sources. Lancez le processus d’impression.

Ensuite, retirez les plateaux de substrat de l’instrument. Bloquez les lames imprimées avec 1x tampon de blocage de microréseau de protéines pendant 30 minutes pendant que vous agitez. Ensuite, lavez les lames dans une solution saline tamponnée au phosphate de pH 7,6 à température ambiante pendant 10 minutes. Répétez le lavage avec un nouveau lot de PBS. Sécher les lames par centrifugation pendant 30 secondes à température ambiante.

Ensuite, préchauffez une imprimante de cire à 85 degrés Celsius pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que la cire ait fondu. Ensuite, insérez une diapositive, côté imprimé vers le bas, dans le support et alignez le support avec le moule de l’imprimante. Mettez le moule en contact avec la glissière et maintenez-le enfoncé pendant deux secondes. Ensuite, retirez rapidement la diapositive du support et inspectez les bordures de cire pour vérifier que les matrices sont correctement fermées. Stockez les lames cloisonnées à 4 degrés Celsius dans un endroit sec et sombre.

Pour commencer la procédure d’hybridation, placez une lame de réseau partitionné dans une parabole en plastique et recouvrez la lame d’un tampon d’hybridation. Équilibrez la glissière pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius tout en secouant à basse vitesse. Séchez la lame en la faisant tourner dans une centrifugeuse à microréseau à température ambiante. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de chaque solution d’anticorps d’histone PTM dans au moins deux puits du réseau et incubez à 4 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, retirez la solution d’anticorps et lavez le réseau avec du PBS froid trois fois, pendant 5 minutes chacune, à 4 degrés Celsius. Ensuite, incubez le réseau dans une solution d’anticorps secondaires conjuguée à un colorant fluorescent pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius, en l’absence de lumière. Lavez la lame trois fois avec du PBS froid comme précédemment.

Trempez le tableau dans une température ambiante 0,1x PBS pour éliminer l’excès de sels, et séchez la lame par une brève centrifugation à température ambiante. Imagez la lame à l’aide d’un scanner à microréseaux à une résolution d’au moins 25 microns.